Les N-hydroxycinnamoylphénalkylamides (36H) ont montré à la fois des capacités antioxydantes et antityrosinase. Le composé a été étudié pour ses propriétés antioxydantes, à l'aide d'un test de piégeage du 1,1-diphényl-2-picrylhydrazul- (DPPH-), d'une évaluation du pouvoir antioxydant réducteur d'ions ferriques (FRAP) et d'un test de métal- dosage du pouvoir chélatant. Les résultats ont montré que le 36H avait des capacités antioxydantes dans les examens du pouvoir de piégeage du DPPH et de réduction ferrique, mais le dosage du pouvoir chélateur n'a pas démontré de capacité antioxydante. 36H a également été mesuré pour l'activité inhibitrice de la tyrosinase en appliquant diverses plateformes d'espèces, y compris les champignons in vitro, le mélanome de souris B16F10 et les cellules de mélanocytes humains. En termes de suppression in vitro de la tyrosinase des champignons, le 36H a freiné les processus de mélanogénèse. On suppose que 36H a bloqué le site actif de la tyrosinase en tant qu'inhibiteur compétitif de la tyrosinase de champignon, ne diminuant donc pas la viabilité cellulaire des mélanocytes humains normaux. Une réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR) et un transfert Western ont découvert que le 36H réduisait l'ARN et les protéines liés à la mélanogenèse, y compris la production de pigments (MITF, tyrosinase, TRP-1 et TRP-2) , la maturation des mélanosomes (Rab27a) et le transport des mélanosomes (Myo5a, MLPH et Mreg). Dans l'ensemble, le 36H présentait les fonctions biologiques d'antioxydation et de suppression de la mélanine, il y avait donc une possibilité pour son application en tant qu'additif alimentaire ou agent de blanchiment de la peau.

Selon des études pertinentes,cistancheest une herbe commune qui est connue comme "le miracleherbequi prolonge la vie". Son composant principal estcistanoside, qui a divers effets tels queantioxydant, anti-inflammatoire, etpromotion de la fonction immunitaire. Le mécanisme entre cistanche etpeaublanchimentréside dans l'effet antioxydant deglycosides de cistanche. La mélanine de la peau humaine est produite par l'oxydation detyrosinecatalysé partyrosinase, et leoxydationLa réaction nécessite la participation d'oxygène, de sorte que les radicaux sans oxygène dans le corps deviennent un facteur important affectant la production de mélanine. Cistanche contientcistanoside, qui est un antioxydant et peut réduire la génération de radicaux libres dans le corps, ainsiinhibant la production de mélanine.

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1. Introduction

La peau humaine est le plus grand organe du corps humain; il maintient les fonctions corporelles et prévient la perte d'eau, d'électrolytes et de biomolécules. La peau est composée de l'épiderme, du derme et de l'hypoderme. L'épiderme est ensuite divisé en cinq couches distinctes : la couche cornée, la couche lucide, la couche granuleuse, la couche épineuse et la couche basale [1]. La couche de base de l'épiderme, qui est reliée au derme, est la couche basale qui contient les mélanocytes. Les mélanocytes ont des dendrites pour transférer la mélanine aux kératinocytes, qui déterminent la surface de la couleur de la peau en raison de la teneur en mélanine dans ces kératinocytes [2].

Les radicaux libres sont composés d'un atome ou d'un groupe d'atomes qui ont un ou plusieurs électrons non appariés. Ils sont impliqués dans les réactions physiologiques, métaboliques et immunitaires et les fonctions de transfert de signaux. Bien qu'ils fassent partie des processus biochimiques sains normaux dans le corps, ils sont également responsables des dommages. Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et divers radicaux libres sont stimulés par la génération d'anions superoxydes ou de peroxydes d'hydrogène. Cela peut provoquer des messages confus, des dommages aux membranes cellulaires et des dommages aux communications des cellules ioniques en raison de la peroxydation des lipides. Cela affecte les molécules intracellulaires qui comportent des groupes SH et des protéines agissantes et de l'ADN [3]. La quantité de ROS est contrôlée par les systèmes d'autodéfense qui sont médiés par des antioxydants dans leur état normal, tels que les antioxydants. Ceux-ci incluent la vitamine C, la vitamine E ou le glutathion [4], qui éliminent les radicaux libres pour prévenir les dommages cellulaires. Cependant, ils perturbent l'équilibre de l'état d'oxydation cellulaire qui se traduit par trop de ROS. Des études antérieures ont montré que de nombreuses maladies dégénératives, telles que le vieillissement et le cancer, sont causées par des espèces actives de l'oxygène ou des radicaux libres. Les propriétés antioxydantes suggèrent que la peroxydation des lipides dans les membranes des mélanocytes augmente la teneur en glutathion intracellulaire, ce qui peut expliquer la dépigmentation [5, 6].

L'assombrissement de la peau, des yeux et des cheveux est causé par la synthèse de mélanine, qui est un biopolymère pigmenté synthétisé dans le mélanosome des mélanocytes. La mélanine est un mécanisme de protection contre les dommages causés par la lumière UV [7]. Les gènes congénitaux peuvent affecter la couleur de la peau, mais l'induction des rayons UV, l'inflammation et les changements hormonaux amènent les mélanocytes à synthétiser plus de mélanine. Néanmoins, la surproduction de mélanine peut induire des troubles pigmentaires, tels que le mélasma, le lentigo sénile, les taches de rousseur et l'hyperpigmentation [8]. Ceux-ci sont généralement traités à l'aide de cosmétiques ou d'ingrédients pharmaceutiques contenant des composants blanchissants pour la peau. Même si ces éléments proviennent de sources naturelles, seuls certains agents sont utilisés dans les cosmétiques ou les médicaments en raison de problèmes de sécurité ou d'efficacité de blanchiment. La mélanogénèse implique la liaison de l'hormone stimulant les mélanocytes à la mélanocortine -1, qui augmente l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et active les facteurs de transcription associés à la microphtalmie (MITF) [9]. Le MITF régule à la hausse l'expression d'une enzyme mélanogène, la tyrosinase, qui joue un rôle important dans l'hydroxylation de la L-tyrosine en dihydroxyphénylalanine (L-DOPA) et l'oxydation de la L-DOPA en dopaquinone [10]. Les traitements médicaux et cosmétiques font de plus en plus appel aux inhibiteurs de l'activité de la tyrosinase. La production de mélanogénèse et le transfert des mélanosomes des mélanocytes vers les kératinocytes sont nécessaires à la coloration de la peau [11]. Les mélanosomes sont attachés au cytosquelette d'actine à la périphérie des mélanocytes via le complexe tripartite formé par la protéine Rab-27 (Rab27a), la mélanophiline (MLPH) et la myosine Va (Myo5a). Rab27a est une protéine liée à la membrane impliquée dans le transport des protéines et la transduction du signal médiée par la petite GTPase. La mélanophiline forme un complexe ternaire avec Rab27a dans le site lié au GTP avec Myo5a qui est la protéine motrice. La pigmentation visible des mammifères dans les cheveux et la peau dépend de ce complexe tri-protéique pour attacher les organites producteurs de pigments. Si la protéine complexe est déficiente, la connexion entre la F-actine et le mélanosome est rompue [12].

Parmi les composés à potentiel thérapeutique positif, les N-hydroxycinnamoylphénalkylamides (36H) auraient un effet inhibiteur sur l'expression des métalloprotéinases matricielles (MMP-) 9 dans THP-1, une lignée cellulaire monocytaire de la leucémie humaine, qui est stimulée par le facteur de nécrose tumorale (TNF-) [7]. Une étude précédente a montré que l'expression induite par le TNF de MMP-9 pour les niveaux de protéines et d'ARNm était totalement inhibée de manière dépendante de la concentration (1 à 20 μM). Il a été constaté que le 36H supprimait nettement l'amplificateur du gène du polypeptide léger du facteur nucléaire κ dans la signalisation des lymphocytes B (NF-κB), tel que détecté par le test du gène rapporteur NF-κB, mais n'avait aucun effet sur la dégradation du (facteur nucléaire du polypeptide léger κ amplificateur de gène dans l'inhibiteur des lymphocytes B (IκB) ou la translocation de NF-κB. Les données d'immunoprécipitation de la chromatine ont montré que l'affiliation entre MMP -9 et le gène promoteur de la sous-unité p65 (p65) de NF-κB était entièrement annulée par 36H et la phosphorylation de p65 n'a pas été influencé. En général, un rapport précédent a démontré que 36H supprimait la sécrétion de MMP-9 par la régulation à la baisse ciblée nucléaire des mécanismes de la voie NF-κB dans le THP-1. 36H est un analogue de l'acide caféine l'ester de phénéthyle (CAPE), qui est un suppresseur connu des métastases et de l'invasion du cancer [14] Les activités antioxydantes et de piégeage des radicaux libres de certains analogues de CAPE ont été étudiées, et les résultats de ces études ont incité cette étude à déterminer si le 36H réduisait activité tyrosinase et ARN et protéines liés à la mélanogénèse régulés à la baisse. Cette étude révèle que le 36H est un antioxydant potentiel et positif et un agent de blanchiment de la peau.

2. Matériels et méthodes

2.1. Réactifs et matériaux.Le diméthylsulfoxyde (DMSO) et la L-tyrosine ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich Chemical Inc. (St. Louis, MO, USA). Le milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et le sérum de veau fœtal (FBS) ont été achetés auprès de Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, États-Unis). Tous les réactifs et tampons alternatifs ont été acquis à la pureté commerciale la plus élevée.

2.2. Synthèse chimique de 36H.36H a été fourni par le professeur Yueh-Hsiung Kuo, qui a utilisé les méthodes ultérieures de couplage de liaison amide pour obtenir les composés. L'hexafluorophosphate de benzotriazol-1-yloxytris (diméthylamino)-phosphonium (BOP) a été combiné avec un mélange de R2-NH2, R1-COOH et de triéthylamine (Et3N) dans du diméthylformamide (DMF). La solution réactionnelle a été mélangée pendant 3{{1{{30}}}} min à 0 °C, puis mélangée à 25 °C pendant 2 heures. Une fois le liquide chimique évaporé, le résidu a été divisé entre H2O et de l'acétate d'éthyle (AcOEt). Le résidu a ensuite été filtré et purifié par chromatographie sur colonne avec une solution d'élution (AcOEt-CH2Cl2, 1 : 1, v/v) sur gel de silice (70-230 et 230-400 mesh, Merck 7734). Les produits ont été recristallisés à partir d'AcOEt pour obtenir la meilleure médecine oxydative et longévité cellulaire et les cristaux les plus idéaux. Un spectromètre de masse Finnigan TSQ-46C a été utilisé pour la spectrométrie de masse à impact électronique (EIMS). Les spectres RMN 1H et 13C ont été obtenus à l'aide d'un spectromètre Bruker Avance 500. Un spectrophotomètre Nicolet Magna-IR 550 a enregistré les spectres IR. Le 36H a été initialement dissous dans une solution de DMSO avant les études suivantes. Pour chaque dosage, du DMSO avec une concentration constante et finale de 0,2 % (v/v) a été utilisé. Ce composé n'est pas connu comme antioxydant ou agent de blanchiment de la peau [7, 13], et la structure est illustrée à la figure 1. Les échantillons ont été dissous dans du DMSO et diverses concentrations ont été préparées avec une concentration finale de DMSO inférieure à 0,5 %.

2.3. Dosage de la capacité de piégeage des radicaux DPPH.DPPH est le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle, qui devient violet foncé lorsqu'il contient un radical libre. Lorsque l'antioxydant récupère le radical du DPPH˙, il réduit le DPPH˙ en un DPPH stable, qui a une couleur jaune clair [14]. Diverses doses de 36H (2 μL en volume total) ont été combinées dans 98 μL de mélange DPPH (60 μM) et la plaque a été examinée à l'aide d'un lecteur spectroscopique ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) de 517 nm. L'acide L-ascorbique a été utilisé comme témoin positif. Les ratios de DPPH résiduel ont été cartographiés à côté de l'échantillon pour déterminer la quantité d'antioxydant qui diminue l'ancienne concentration de DPPH. La propriété de piégeage ( pourcentage ) a été déterminée comme

2.4. Dosage du pouvoir réducteur.Le dosage du pouvoir antioxydant réducteur d'ions ferriques (FRAP) est souvent appliqué pour évaluer la capacité antioxydante des boissons, des aliments, des fruits et des suppléments nutritionnels, y compris les flavonoïdes ou les polyphénols. Divers dosages de 36H ont été introduits dans un mélange tampon phosphate 67 mM (0.085 mL, pH 6,8) et 20 % de ferricyanure de potassium [K3Fe(CN)6, 2,5 μL). La solution a réagi pendant 20 min à 50 degrés C, puis de l'acide trichloroacétique (10 %, 0,16 mL) a été ajouté à la solution avant d'être centrifugée à 3 000 g pendant 10 min [14]. Le surnageant de la solution (75 μL) a été combiné avec 2 % de FeCl3 (25 μL), puis un lecteur spectroscopique ELISA a mesuré l'absorbance résultante à 700 nm, pour une plaque à puits 96-. L'hydroxyanisole butylé (BHA) a été utilisé comme contrôle positif. Plus la qualification réductrice est grande, plus l'absorbance est forte.

2.5. Dosage de l'activité de chélation des métaux.Le potentiel ferreux chélatant les ions de la chlorophylle a été mesuré en utilisant la technique de Chen et al. [14]. En bref, des dosages spécifiques des échantillons ont été dissous dans du DMSO et ont été introduits dans un mélange de FeCl2·4H2O (2,0 mM, 0.05 mL). L'ajout de ferrozine (5 mM, 0,2 ml) a initié la réaction lorsque la solution a été agitée avec force puis laissée pendant 10 min à 25 °C. Lorsque la réaction a atteint l'équilibre, les valeurs d'absorbance de la solution ont été déterminées à 560 nm en utilisant un véhicule vierge. L'EDTA a été utilisé comme contrôle positif. La formule de calcul de l'activité chélatante était identique à (1).

2.6. Dosage de l'activité tyrosinase de champignon.La suppression de l'activité de la tyrosinase du champignon et l'inhibition de la tyrosinase cellulaire ont été déterminées par spectrophotométrie en utilisant la méthode précédente, avec des modifications mineures [2]. L'acide kojique a été utilisé comme témoin positif pour le dosage de l'activité de la tyrosinase. Les matériaux ont d'abord été dissous dans du DMSO aqueux et cultivés dans de la L-tyrosine (2,5 mg/mL) avec un tampon phosphate (50 mm, pH 6,8). Tous les modèles utilisaient du DMSO, qui n'est pas pertinent pour l'activité de la tyrosinase lorsque le DMSO constitue<0.5% of the total volume. Subsequently, 25 U/mL of mushroom tyrosinase with an identical buffer was then added, and the solution was incubated at 37° C for 30 min. An ELISA spectroscopic reader was used to conduct the absorbance measurements for the assays at 475 nm, using 96-well microplates (Molecular Devices, CA, USA).

2.7. Cultures de cellules mélanocytaires humaines (HMC).Les mélanocytes épidermiques humains primaires du prépuce néonatal ont été acquis auprès de Cascade Biologics. Cela a également été appliqué par Wang et al. [2]. Il a été cultivé dans du milieu 254 (M-254- 500 ; Cascade Biologics, Portland, OR, États-Unis) et amélioré avec un supplément de croissance de mélanocytes humains (HMGS, numéro de catalogue S-002-5). Le milieu 254 est un milieu de base contenant des vitamines non essentielles et essentielles, des composés organiques, des acides aminés, des sels inorganiques et des oligo-éléments. Le supplément de croissance des mélanocytes humains comprenait du sérum bovin fœtal, de l'insuline bovine, de l'extrait hypophysaire bovin, de la transferrine bovine, de l'hydrocortisone, du facteur de croissance basique des fibroblastes, du phorbol 12-myristate 13-acétate et de l'héparine. Toutes les cellules ont été incubées à 37 degrés C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère à 5 % de CO2.

2.8. Détermination de la viabilité cellulaire de HMC.La viabilité cellulaire a été déterminée à l'aide d'un test MTT [3]. Lorsqu'un tétrazole jaune est combiné avec la déshydrogénase mitochondriale ( ubiquinone ) dans les cellules vivantes, les anneaux de tétrazolium du MTT se clivent et se réduisent en formazan violet. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 9 × 103 cellules/puits dans des plaques 96-puits. Lorsque les cellules ont été cultivées pendant une journée, le milieu a été changé et différentes concentrations de 36H ont été ajoutées dans un volume de milieu final de 100 μL. Après une incubation de 48 heures, le milieu a été remplacé par un milieu frais (100 μL), comprenant du MTT (0,5 mg/mL). La plaque a ensuite été cultivée dans un incubateur à 37 degrés C pendant 2 heures avec 5% de CO2. Du DMSO (100 μL) a ensuite été ajouté à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan violet. Pour s'assurer que les plats atteignent une dissolution maximale, les plats ont été doucement secoués et mélangés dans l'obscurité pendant 10 min et mesurés à 595 nm. La croissance cellulaire a été calculée comme

2.9. Mesure de l'activité tyrosinase à partir de HMC.Pour déterminer l'activité tyrosinase dans les cellules mélanocytaires humaines (CMH) (5 × 104 cellules par puits), elles ont été positionnées dans des plaques 12-puits dans 1000 μL de milieu avec différents dosages de 36H et cultivées pendant 48h [2] . Un tampon PBS a été utilisé pour laver les cellules traitées avec l'échantillon, puis celles-ci ont été lysées avec 1 % de Triton X-100/PBS. L'extrait enzymatique a ensuite été collecté à partir du lysat cellulaire résultant et combiné avec 50 μL de L-tyrosine 2 mM. Les extraits ont ensuite été incubés pendant 3 heures à 37°C dans l'obscurité. Un spectrophotomètre a ensuite été utilisé pour déterminer leur absorbance à 490 nm.

2.10. Détermination de la teneur en mélanine dans HMC.Avec quelques modifications mineures, la technique précédente a également été utilisée pour cette expérience [2]. Les culots cellulaires ont été dissous dans du NaOH 2.0 N avec 10 % de DMSO et chauffés à 90 °C pendant 1 heure. Les suspensions ont été séparées par centrifugation pendant 10 min à 10,000g. À l'aide d'un spectrophotomètre, la teneur en mélanine a été déterminée via les données produites à un niveau d'absorbance de 475 nm.

2.11. Réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel.Pour la qRT-PCR, une réaction de 20 μL contenait un mélange 0.4 mL de deux transcriptases inverses : 10 μL de 2 × QuantiTect SYBR Green Master Mix (QIAGEN, Valencia , Californie, États-Unis) avec la polymérase Taq à démarrage à chaud, 0,8 ml d'amorces et 0,5 ml (10 ng/mL) de la matrice. Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau 1. Le système StepOnePlus™ a été utilisé pour tous les tests de PCR en temps réel. La réaction a été complétée en effectuant la réaction RT à 42 degrés C pendant 2 0 min, puis en activant l'ADN polymérase FastStart Taq à 95 degrés C pendant 5 min. Celui-ci a ensuite été amplifié pendant 40 ou 50 cycles à 95 °C pendant 5 secondes pour dénaturation, recuit et acquisition à 60 °C pendant 5 secondes. Il a finalement été allongé à 72 degrés C pendant 15 sec. La fluorescence peut également être mesurée après la phase d'élongation, mais pour cette expérience, elle a été mesurée après la phase de recuit. Avec une plaque à puits 96-, 9 μL du lysat ont été ajoutés à 11 μL du mélange réactionnel, qui consistait en 10,6 μL de MasterMix du kit de base Eurogentec qPCR pour SYBR Green I (1,4 μL de 50 mM MgCl2, 2 μL de tampon de réaction 10x, 0,8 μL de mélange de dNTP 5 mM, 0,6 μL de SYBR Green I, 5,7 μL d'eau sans nucléase et 0,1 μL de polymérase GoldStar Taq chaude), 0,1 μL d'ARN MS2, 0,1 μL d'inhibiteur de RNAse dilué 10x et 0,1 μL de l'amorce REV (100 μM), ainsi que le MS2 FWD pour les tests SG-PERT sur le système ABI 7300 qPCR. La réaction qRTPCR, l'activation de l'enzyme chaude GoldStar Taq, l'amplification du cycle 40-, l'hybridation et l'acquisition, la dénaturation à 95 °C et l'élongation à 72 °C ont utilisé l'instrument ABI 7300. Pour préparer le test, tous les réactifs ont été conservés soit sur un bloc de refroidissement, soit sur de la glace. Des réactions SGPERT en double ont été effectuées sur chaque échantillon de lysat. À l'aide d'un logiciel et d'instruments qPCR, un ABI 7300 avec son seuil déterminé manuellement et un LightCycler® 480 avec sa méthode de dérivée seconde maximale ont généré le cycle de valeurs de quantification (Cq). En utilisant le même logiciel pour les deux instruments, les pics de fusion ont également été automatiquement calculés.

2.12. Western blot.Un total de 1 × 105 cellules ont été traitées avec des groupes d'échantillons ou le témoin de véhicule vierge pendant deux jours. Les cellules ont été récoltées et lysées avec un tampon de lyse (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, chlorure de sodium 137 mM, fluorure de sodium L 50 mM, pyrophosphate de sodium 10 mM, glycérophosphate 20 mM, fluorure de phénylméthylsulfonyl L 1 mM , EDTA 1 mM, 10 % de glycérol, 1 % de Nonidet P-40, 2 μM de leupeptine, 0,1 mM d'orthovanadate de sodium et 2 ug/mL d'aprotinine) [14]. Les lysats ont été centrifugés à 20,000 ×g pendant 30 min, et les concentrations de protéines dans la solution de surnageant ont été déterminées avec un kit de dosage de protéines d'acide bicinchoninique (BCA) (Pierce, Rockford, IL, USA). Des quantités égales de protéines ont été séparées par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE), puis électrotransférées sur une membrane de nitrocellulose (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA). La membrane a été bloquée pendant 1 heure avec 5 % de lait écrémé dans du tampon PBS-T (PBS contenant 0,1 % de Tween 20). Le film de transfert a été soigneusement retiré du réservoir de transfert humide et de la fente de transfert semi-sèche et placé dans une boîte contenant 5% de lait écrémé dans 1x TBST pendant 1 heure à température ambiante. Il a ensuite été délicatement lavé avec 1x TBST pour éliminer les traces de lait écrémé. La membrane a ensuite été incubée avec les anticorps primaires respectifs. Dans chaque cas, les membranes ont été incubées avec un anticorps anti-lapin ou de souris conjugué à la peroxydase de raifort, puis traitées avec des réactifs de détection ECL (PerkinElmer, ECL1 : ECL2=1 : 1). Un système d'imagerie chimiluminescent de taille mini de Life Science a été utilisé pour la mesure afin de détecter les bandes [14].

2.13. Analyses statistiques.Trois de chaque concentration pour le standard et les échantillons ont été utilisés. En utilisant le test t de Student, les résultats ont été statistiquement comparés et ont été exprimés en utilisant la moyenne des valeurs moyennes ± l'écart type (SD).

3. Résultats

3.1. Activité de piégeage des radicaux libres DPPH.Les ROS peuvent générer des peroxydes lipidiques, des dommages à l'ADN, l'expression des protéines, le vieillissement des tissus et la genèse du cancer lorsque l'équilibre entre les radicaux libres et les antioxydants inhérents est perturbé. Les réactions en chaîne des radicaux libres sont bloquées en neutralisant les dons ou les acceptations d'électrons et en chélatant les paires isolées libres. Réduire le stress oxydatif des facettes intrinsèques et extrinsèques est un moyen d'améliorer la santé. Cette étude a examiné les propriétés antioxydantes, en déterminant le pouvoir réducteur ferrique, la capacité de piégeage des radicaux libres DPPH et le pouvoir chélateur des métaux. La génération et l'accumulation accrues de ROS produisent une oxydation des lipides dans les aliments et les cosmétiques et une activité antioxydante naturelle. En particulier, les propriétés de piégeage des radicaux libres sont essentielles dans les additifs nutritionnels fonctionnels et les produits de soin de la peau.

Le premier test d'inhibition de l'oxydation était le test de piégeage des radicaux libres DPPH. Il s'agit d'une plateforme expérimentale simple et économique, dans laquelle les antioxydants agissent pour prévenir les produits d'oxydation. Les antioxydants changent la couleur du réactif DPPH radicalaire stable du violet au jaune clair de la diphényl-picrylhydrazine. Pour déterminer les propriétés antioxydantes du 36H, une dose de 100 μM a été appliquée pour déterminer la capacité de piégeage. Le tableau 2 montre que le 36H présentait une excellente capacité de piégeage des radicaux libres et piégeait 60 % du radical libre DPPH et la vitamine C à la même concentration (100 μM) en piégeait 85,3 %.

3.2. Pouvoir antioxydant réducteur ferrique.Le deuxième test d'inhibition de l'oxydation est le test de pouvoir réducteur ferrique, qui est un moyen courant et fiable de mesurer la synthèse du complexe Fe (III) – ferricyanure. Un agent fonctionnel réduit les complexes Fe3 plus/ferricyanure à la forme ferreuse. Cette combinaison avait une couleur bleue à 7{{10}}0 nm car K4Fe(CN)6 a réagi avec Fe3 plus pour former Fe[Fe(CN)6]3. Dans l'expérience, la couleur de la solution est passée du jaune clair à différentes nuances de bleu et de vert, en fonction du pouvoir réducteur du composé cible. Le tableau 2 présente que le BHA à 100 μM avait une valeur de pouvoir réducteur de 0,95 et le 36H à 100 μM avait une valeur de pouvoir réducteur de 0,85 par rapport au BHA. Par conséquent, le 36H s'est avéré avoir un bon pouvoir antioxydant réducteur ferrique.

3.3. Capacité de chélation des ions ferreux.L'activité chélatante des ions ferreux de 36H est présentée dans le tableau 2. L'EDTA (100 µM) a été utilisé comme témoin positif. Fe2 plus et la ferrozine forment quantitativement des complexes. La formation de complexes réactifs est souvent perturbée, à cause des agents chélatants, ce qui se traduit par une diminution de la couleur rouge du complexe. Le 36H à une dose de 10 μM n'a eu aucun effet significatif sur la capacité de piégeage de Fe2 plus et, à la concentration de 100 μM, il a présenté une inhibition de 43,2 %. Le contrôle positif, EDTA, avait une capacité de chélation d'ions d'environ 80 % à 100 μM.

3.4. Effet de 36H sur l'activité tyrosinase des champignons.L'inhibition de l'activité de la tyrosinase a été décrite dans de nombreux rapports, dont la plupart utilisaient la tyrosinase de champignon comme modèle. Les avantages sont bien développés par les scientifiques, des procédures simples, un processus de pigmentation rapide et peu coûteux, des caractéristiques structurelles et fonctionnelles similaires à celles des mammifères et la commodité d'observer le développement de la mélanine. L'inhibition de l'activité de la tyrosinase de champignon par 36H a été étudiée, et la capacité inhibitrice avait une corrélation positive avec la concentration de 36H (Figure 2 (a)). A la quinzième minute, on a vu que le 36H à différentes concentrations (1, 5 et 10 mM) par rapport au témoin réduit les valeurs de DO. L'activité enzymatique diminue d'environ 10 % à 1 mM, 30 % à 5 mM et 40 % à 10 mM, par rapport au véhicule témoin (figure 2(b)). La relation entre l'activité de la tyrosinase et sa concentration en 36H a été étudiée. Différentes concentrations de l'inhibiteur donnent un groupe de lignes qui passent toutes par l'origine. L'inhibition de l'activité tyrosinase par 36H n'affecte pas la quantité d'enzyme, ce qui montre que 36H est un inhibiteur réversible (figure 2(c)). Le type d'inhibition de la tyrosinase par 36H a été confirmé à l'aide d'un graphique à double inverse de Lineweaver-Burk. Les tracés de 1/v versus 1/[s] ont donné une famille de lignes droites passant par l'origine, qui présentait que 36H était un complexe compétitif. La cinétique de l'enzyme est présentée sur la figure 2(d).

3.5. L'effet de la viabilité cellulaire, de la tyrosinase cellulaire et de la teneur en mélanine sur 36H dans HMC.En tant que puissant composé éclaircissant pour la peau, le composant doit être inoffensif, sans effets secondaires cytotoxiques indésirables. Il existe des inhibiteurs de synthèse de mélanine bien connus, notamment l'acide kojique, l'arbutine, le PTU ou l'hydroquinone, qui sont actuellement utilisés dans le monde entier comme ingrédients cosmétiques. Nous avons également découvert que ces inhibiteurs mélanogènes pourraient induire une tumorigénicité de la peau humaine à des doses élevées ou à une utilisation fréquente [2]. HMC a été cultivé en 36H pendant 48 heures à diverses concentrations de 1, 5, 10 et 25 μM, et la viabilité cellulaire a été déterminée pour montrer de faibles toxicités cellulaires sur la figure 3 (a). En considérant l'agent à usage thérapeutique ou cosmétique chez l'être humain, nous avons constaté que les conséquences cytotoxiques sur les viabilités cellulaires dermiques humaines étaient insignifiantes. Pour comprendre l'effet inhibiteur de 36H sur la mélanogenèse, nous avons évalué l'activité de la tyrosinase intracellulaire dans HMC. Les résultats de l'activité de la tyrosinase dans les HMC ont montré qu'il y avait une variation évidente à mesure que la concentration augmentait et que l'activité de la tyrosinase diminuait pour une faible toxicité cellulaire. Après le traitement, l'activité de la tyrosinase a été réduite à 39 ± 2, 2% à 25 μM de manière dose-dépendante (Figure 3 (b)). Ces résultats ont montré que 36H inhibait l'activité de la tyrosinase intracellulaire. Les résultats du dosage de la mélanine ont clairement montré que le 36H réduit la teneur en mélanine dans les HMC de manière dose-dépendante (Figure 3(c)). Le pourcentage de contrôle représente la teneur en mélanine. Après traitement, la teneur en mélanine était de 77 % à 25 μM, 84 % à 10 μM, 88 % à 5 μM et 90 % à 1 μM. Ces résultats ont montré que le 36H avait un effet inhibiteur significatif sur la synthèse de mélanine dans les HMC à 25 μM.

3.6. L'ARNm et les protéines liés à la biosynthèse de la mélanine ont été influencés par 36H dans HMC.La biosynthèse de la mélanine se produit dans les mélanosomes et le substrat initial d'acides aminés est la tyrosine. La tyrosine est d'abord catalysée en L-DOPA via la tyrosinase, et en utilisant la même enzyme, la tyrosinase, la DOPA est catalysée en dopaquinone. La dopaquinone est catalysée par la dopachrome tautomérase (protéine liée à la tyrosinase- 2, TRP-2), TRP-1 et la tyrosinase pour former l'eumélanine. Dans HMC, 36H a régulé à la baisse les ARN et les protéines liés à la mélanogénèse cellulaire, comme le montre la figure 4.

3.7. Effet du 36H sur la maturation des mélanosomes.Le mélanosome est un organite qui repose sur la synthèse de mélanine au sein des mélanocytes. Plus les mélanosomes mûrissent, plus la mélanine se forme. Par conséquent, la maturation des mélanosomes est importante dans le mécanisme de blanchiment de la peau. La protéine prémélanosome 17 (Pmel17) est ciblée sur les précurseurs de l'organite pigmentaire, le mélanosome, où elle est transformée protéolytiquement en plusieurs petits fragments. Certains de ces fragments forment des amyloïdes non pathologiques qui s'assemblent en feuilles et forment le motif strié qui sous-tend l'ultrastructure du mélanome. Cette étude a démontré que 36H réduisait l'expression de l'ARN et de la protéine Pmel17 dans HMC (Figure 5).

3.8. Effet du 36H sur le transport des mélanosomes.Rab27a, MLPH et Myo5a forment un complexe tri-protéique pour lier les mélanosomes à la périphérie des mélanocytes. Dans le processus de transport des mélanosomes, le complexe ternaire est la connexion entre le cytosquelette d'actine et le mélanosome. Un manque de ces protéines affecte le transport, et la mélanoréguline (Mreg) entraîne le transfert des mélanosomes des mélanocytes aux kératinocytes via un mécanisme d'excrétion régulé. Cette étude a illustré que 36H diminuait le transport des mélanosomes en affectant cet ARN et ces protéines apparentés (Figure 6).

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