Organoïdes rénaux 3D pour la traduction du laboratoire au chevet du patient

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Navin Gupta, et al

Résumé

Les reins sont des organes essentiels qui filtrent le sang, éliminant les déchets urinaires tout en maintenant l'homéostasie des fluides et des électrolytes. Les modèles de recherche conventionnels actuels tels que les cultures cellulaires statiques et les modèles animaux sont insuffisants pour appréhender la situation humaine complexe in vivo ou manquent de valeur translationnelle. Accélérerun reinrecherche, de nouveaux outils de recherche sont nécessaires. Des développements récents ont permis la différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites pour générer des organoïdes rénaux.Un reinles organoïdes ressemblent au rein humain in vitro et peuvent être appliqués en médecine régénérative et comme modèles de développement, de toxicité et de maladie. Bien que les études actuelles se soient révélées très prometteuses, des défis subsistent, notamment l'immaturité, la reproductibilité limitée et le manque de systèmes de canaux vasculaires et collecteurs perfusables. Cette revue donne un aperçu de notre compréhension actuelle de la néphrogenèse qui a permis la génération d'organoïdes rénaux. Ensuite, les applications potentielles deun reinles organoïdes sont discutés suivis de perspectives futures. Cette revue propose que l'avancement de la recherche sur les organoïdes rénaux sera facilité grâce à notre connaissance croissante de la néphrogenèse et à la combinaison de techniques prometteuses telles que les modèles d'organes sur puce.

Mots-clés Organoïde rénal. Cellules souches. Bioingénierie.Néphron

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Introduction

Les reins sont des organes essentiels qui filtrent le sang pour générer des déchets métaboliques, destinés à l'excrétion urinaire. Les reins ont une plasticité remarquable pour adapter la composition de l'urine, en faisant correspondre l'apport avec l'excrétion pour maintenir l'homéostasie des solutés et l'équilibre hydrique. Le rein des mammifères étant un organe non régénérateur, la perte d'unités fonctionnelles, ou néphrons, s'accumule au fil du temps chez tous les individus [1]. Maladies systémiques à forte prévalence, à savoir hypertension et diabète sucré, médicaments ou maladies aiguës induites par l'hémodynamiqueun reinblessure(IRA) et les maladies primaires du rein, sont des causes fréquentes de perte accélérée de la fonction rénale et constituent les principales étiologies de l'insuffisance rénale chronique (IRC) [2]. CKD est divisé en étapes basées surun rein dysfonctionnement, ce qui provoque des dérangements de soluté et un déséquilibre hydrique responsables d'une morbidité et d'une mortalité importantes. Aux États-Unis, l'IRC a une prévalence rapportée de 14 % [3], a un coût de traitement annuel de 120 milliards de dollars [4], a un impact négatif sur la qualité de vie [5] et, à un stade avancé, aboutit à une insuffisance rénale terminale ( ESRD), qui nécessite la nécessité d'une thérapie de remplacement rénal (RRT). Les formes de RRT comprennent la dialyse et la transplantation, la première représentant 7 % du budget de Medicare [6] et la seconde limitée par la fourniture d'organes appropriés [7]. L'IRC et l'IRT représentent un fardeau majeur pour les ressources et les coûts de soins de santé, ainsi que pour les patients souffrant de ces maladies [8].

Pour faire face à ces fardeaux, des recherches fondamentales et translationnelles ont été menées dans les domaines deun rein développement, les tests de néphrotoxicité, la modélisation des maladies et la médecine régénérative rénale. Les outils de recherche traditionnels consistent en la culture cellulaire in vitro, à partir de cellules rénales primaires isolées et de lignées cellulaires immortalisées transformées par voie virale, et de modèles animaux in vivo. Bien que ces modèles courants aient été utilisés pour étudier la physiologie et la pathologie rénales avec un certain succès, ils présentent des limites inhérentes qui peuvent contribuer à la mauvaise traduction des études de laboratoire en thérapie clinique [9]. Les modèles in vitro sont largement limités à l'analyse de types unicellulaires, ignorant les effets des interactions intercellulaires et environnementales au sein de tissus hétérogènes complexes, tels que le rein. Les modèles animaux, bien qu'intégratifs des systèmes corporels, sont limités par les différences inter-espèces, ce qui entraîne des conclusions non fidèles qui coûtent cher en temps et en argent [10]. De nouvelles méthodes d'expérimentation dans les cellules et les tissus humains sont une nécessité pour surmonter les limites des techniques de recherche traditionnelles [11].

Comme la nécessité est la mère de l'innovation, les progrès des protocoles utilisant des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) ont généré des tissus complexes tridimensionnels, multicellulaires et spécifiques à un organe, appelés organoïdes. Les organoïdes du foie, des poumons, du cœur, des intestins et des reins permettent des expérimentations sur des tissus humains in vitro [12]. En théorie, les tissus qui composent l'intégralité du soma humain peuvent être reproduits à grande échelle, grâce aux hPSC définissant les caractéristiques de pluripotence et d'auto-renouvellement. Les deux types de hPSC sont les cellules souches embryonnaires humaines (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (iPSC). En 1998, Thomson et al. décrit pour la première fois la génération de lignées ESC dérivées de blastocystes humains. Pour contourner la controverse liée à l'origine embryonnaire des CSE, en 2006, Takahashi et al. décrit une méthode révolutionnaire pour induire la pluripotence dans des cellules somatiques différenciées en phase terminale. Appelées iPSC, ces cellules sont formées par l'activation transcriptionnelle des facteurs Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc) [13]. En plus d'éviter les problèmes éthiques, les CSPi permettent en outre des approches de médecine personnalisée. Les CSPi représentent un approvisionnement illimité de cellules isogéniques à leur cellule somatique parentale [13]. Les CSPi spécifiques au patient avec des mutations naturelles peuvent être utilisées pour générer des modèles de maladies cliniquement pertinents dans les tissus humains, en particulier dans des conditions pour lesquelles aucun modèle animal n'existe. Dans les modèles de maladies héréditaires, les contrôles corrigés du génome peuvent établir un lien direct entre le génotype et le phénotype [14]. Les approches de médecine régénérative immunocompétentes peuvent utiliser des tissus en vrac spécifiques à un organe générés à partir des CSPi d'un patient, annulant ainsi le besoin d'immunosuppression et contournant la pénurie d'organes transplantables [15]. Tirer parti de l'utilité translationnelle des hPSC, en particulier des iPSC, peut révolutionner les domaines du développement de médicaments et de la transplantation d'organes, entraînant des résultats spectaculaires pour la santé humaine et la maladie.

La capacité des hPSC à reconstituer toutes les cellules du corps pose un grand défi, en particulier, comment contrôler la différenciation vers des types de cellules et de tissus spécifiques d'intérêt. L'organogenèse des mammifères sert d'archétype pour la différenciation dirigée, l'induction séquentielle efficace de types de cellules intermédiaires qui se produisent au cours du développement des organes [16]. À l'inverse, la reprogrammation directe implique l'induction de facteurs de transcription spécifiques au type cellulaire, contournant les types cellulaires intermédiaires lors de la conversion d'une cellule somatique vers une population cible définie. Bien que bénéficiant d'une méthodologie plus simple, la reprogrammation directe entraîne souvent une conversion incomplète vers la cellule cible en raison du profil de méthylation de l'ADN et de l'épigénétique de la cellule parentale [17]. Même si une reprogrammation directe s'est produite avec une conversion complète, le résultat est susceptible d'être une population cellulaire uniforme [18]. En ce qui concerne le rein, plus d'une douzaine de types cellulaires distincts contribuent à la structure et à la fonction du néphron in vivo. La reconstitution d'un néphron nécessiterait une reprogrammation directe vers un ancêtre commun de tous les types de cellules contributrices, à savoir les cellules progénitrices du néphron, les cellules progénitrices endothéliales et les cellules progénitrices stromales [19]. L'approche requise pour développer un tissu semblable au rein natif est la différenciation dirigée, une méthode fondée sur une connaissance approfondie du développement du rein. Dans cette revue, nous soulignons le rôle essentiel que la biologie du développement rénal a joué dans la génération d'organoïdes rénaux dérivés de hPSC, commentons brièvement les applications de la technologie des organoïdes rénaux et discutons des orientations futures qui répondent aux limites et aux défis actuels de la traduction clinique.

Développement du rein

Le développement du rein sert d'étalon-or pour la différenciation dirigée, pour produire le tissu in vitro le plus biosimilaire à son homologue in vivo. Des décennies d'études sur le développement dans des modèles de mammifères ont révélé que les voies Wnt, FGF, acide rétinoïque et TGF-/BMP régissent la morphogenèse, la structuration des tissus et l'induction des ébauches d'organes [12]. Ces voies sont essentielles au développement itératif des tissus à travers les 3 couches germinales, y compris le rein dérivé du mésoderme. Le mésoderme, pris en sandwich entre les couches endodermique et ectodermique, est modelé par la gastrulation des hPSC (épiblastes antérieurs) à travers la strie primitive, une structure transitoire qui définit les axes antéro-postérieur et médial-latéral de l'embryon en développement [12]. L'axe antéro-postérieur du mésoderme est déterminé par la durée de l'involution à travers la strie primitive avec une exposition temporelle à la signalisation Wnt, car les hPSC qui involuent à travers la strie primitive migrent vers l'avant pour contribuer initialement aux structures antérieures, se remplissant ensuite [1]. L'axe médio-latéral du mésoderme est déterminé par un gradient de BMP rostrocaudal dans la strie primitive, alors que les hPSC subissant une gastrulation à travers la strie primitive rostrale (faible activité BMP) deviennent du mésoderme paraxial, à travers la strie mi-primitive (activité BMP modérée) devenir le mésoderme intermédiaire (IM) et à travers la strie primitive caudale (activité BMP élevée) deviennent le mésoderme de la plaque latérale [20, 21]. Dans la séquence primitive, la durée du signal Wnt et le degré du signal BMP sont des déterminants majeurs de la structuration dans toute la couche germinale mésodermique.

Dans le développement rénal des mammifères, il existe 3 stades néphriques, le pronéphros, le mésonéphros et le métanéphros, qui dérivent tous du mésoderme. Des études chez la souris révèlent que le métanéphros, qui persiste dans le rein adulte, est dérivé de l'induction réciproque de deux tissus dérivés de la MI, le mésenchyme métanéphrique (MM) et le bourgeon urétéral (UB) [22]. Le MM est composé de cellules progénitrices du néphron (NPC) entrecoupées de cellules stromales, tandis que l'UB se forme comme un vestige sortant du canal de Wolff, une structure dégénérative qui draine le mésonéphros primitif vers le cloaque [23]. Les PNJ concentrés du mésenchyme de la coiffe du MM subissent une morphogenèse progressive de corps en forme de virgule à en forme de S, qui se différencient de manière segmentaire en structures épithéliales contiguës comprenant le néphron, à savoir les podocytes, les tubules proximaux, une anse de Henle, les tubules distaux et les tubules de connexion. 24–27]. Les tubules de connexion des néphrons individuels convergent dans un système collecteur ramifié dérivé de l'UB, suite à une induction réciproque entre les deux tissus [28]. La signalisation Wnt dérivée de l'UB catalyse la transition mésenchymateuse-épithéliale (MET) des PNJ vers l'épithélium néphronique [29], tandis que les signaux GDNF dérivés du MM via le complexe Ret/GFRA1 régissent la morphogenèse de la ramification [30] (Fig. 1).

Fig. 1 Le développement du rein humain de la strie primitive à un néphron mature. [1] La strie primitive (PS) donne naissance au mésoderme et par la suite au mésoderme intermédiaire (IM) à partir duquel IM postérieur (PIM) et IM antérieur (aIM) peuvent être distingués au début de la gastrulation. [2] Le mésenchyme métanéphrique (MM) qui comprend les cellules progénitrices du néphron (NPC) et les cellules stromales sont formées à partir du PIM tandis que l'aIM forme le canal de Wolff à partir duquel se développe le bourgeon urétéral (UB). L'UB commence à se ramifier avec les PNJ, les cellules progénitrices stromales (SPC) et les cellules progénitrices endothéliales (EPC). À ce stade, le système vasculaire n'infiltre pas les populations de PNJ. [3] Ensuite, les PNJ développent des vésicules rénales qui forment un corps en forme de virgule suivi d'un corps en forme de s. Finalement, cette structure se connecte à UB et devient un néphron mature. Le sang est filtré dans le glomérule (gris) qui déplace l'ultrafiltrat vers le tubule collecteur (jaune) à travers le tubule proximal (orange), une boucle de Henle (bleu) et le tubule distal (vert). Des marqueurs correspondant à chaque structure sont donnés.

Une avancée majeure dans notre compréhension du développement rénal s'est produite en 2014 lorsque Taguchi et al. découvert de manière inattendue que les précurseurs T plus MM sont distincts sur le plan du développement des progéniteurs Osr1 plus UB [31], en utilisant des techniques de traçage de la lignée, notant que des travaux antérieurs suggéraient une ascendance commune dans Osr1 plus IM sans autre délimitation [22]. Dans l'étude susmentionnée, une souris Osr1-GFP a été utilisée pour déterminer que Osr1 est exprimé à différents moments et à différents endroits dans la zone néphrique de l'IM. Par analyse histologique et tri/réagrégation des cellules OSR1-GFP plus à différents stades de développement, les auteurs ont pu démontrer que la MI antérieure contribue au mésonéphros, au canal mésonéphrique (canal de Wolff) et au bourgeon urétéral (sortie du Canal de Wolff), tandis que le MI postérieur contient Six2 plus Sall1 plus des PNJ du MM qui se différencient en cellules épithéliales du néphron. La détermination que MM est dérivé de l'IM postérieur et UB de l'IM antérieur, ainsi que l'expression de marqueurs caractéristiques, fournit une feuille de route pour l'induction spécifique des lignées spécifiques du rein et a permis à des protocoles de différenciation dirigés d'induire efficacement le néphron dérivé de MM. épithélium sans contamination d'autres dérivés IM. Il est important de noter que les études historiques supposaient que le développement du rein de la souris reflétait la néphrogénèse humaine. En comparant le développement des reins chez l'homme et chez la souris, des études récentes ont élucidé des caractéristiques convergentes et divergentes, notamment la formation de lobes, l'organisation de la niche des progéniteurs et l'expression de marqueurs présumés définissant le type de cellule [32]. Dans de telles études, des données sur les reins humains ont été obtenues à partir de tissus embryonnaires posthumes, ce qui permet de mieux comprendre par opposition à l'expérimentation. L'avènement des organoïdes rénaux dérivés de hPSC permet des hypothèses vérifiables dans le développement du rein humain, parmi les applications translationnelles.

Organoïdes rénaux 3D

Des développements récents ont permis la formation d'organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPCS) par différenciation dirigée [33], générant une nouvelle plate-forme translationnelle pour le développement de médicaments et les techniques de médecine régénérative. Les organoïdes sont des mini-organes in vitro qui s'auto-organisent à partir de cellules (souches) dans des microenvironnements 3D. Ils présentent de grandes similitudes avec leurs homologues in vivo en termes de morphologie tissulaire, de nombre de cellules, de prolifération et de différenciation [34].

Après avoir délimité les origines distinctes du MM et de l'UB au cours du développement du rein de mammifère et travaillé en arrière dans une approche par étapes pour identifier les étapes intermédiaires et leur expression de marqueur caractéristique, Taguchi et al. ont établi des protocoles de différenciation dirigée pour le MM dans les CSP de souris et humaines [31]. Plus précisément, les corps embryoïdes formés à partir d'OCT3/4 plus SOX2 plus hPSC ont été soumis à une signalisation Wnt et BMP4 étendue pour induire T plus CDX2 plus mésoderme naissant, qui est destiné à contribuer aux cellules du mésoderme naissant postérieur. L'axe médio-latéral du mésoderme a été dirigé vers WT1 plus HOXD11 plus OSR1 plus IM postérieur par un traitement simultané avec BMP4, Activin et acide rétinoïque. Ensuite, de faibles Wnt et FGF9 ont été utilisés pour soutenir le développement de OSR1 plus SIX2 plus SALL1 plus WT1 plus NPC, avec une efficacité d'induction rapportée d'environ 62 %. Alors que les PNJ ont été générés à partir de CSP de souris et d'humains, la coculture avec la moelle épinière embryonnaire de souris était nécessaire pour les différencier davantage en tubules proximaux, tubules distaux et grappes de podocytes.

En utilisant à la fois des hESC et des hiPSC en culture monocouche, Morizane et al. ont décrit un protocole de différenciation dirigée qui a induit SIX2 plus SALL1 plus WT1 plus des PNJ avec une efficacité allant jusqu'à 90 % aux jours de différenciation 8 à 9. En bref, la signalisation Wnt étendue a induit une séquence primitive tardive qui a été soumise à l'activine pour former le PIM, qui s'est différencié en PNJ en réponse au FGF9. Les PNJ ont ensuite été agrégés dans une culture en suspension tridimensionnelle par centrifugation, soumis à une impulsion transitoire CHIR99021 (CHIR) pour simuler la signalisation Wnt dérivée de l'UB pour catalyser le MET dans les PNJ, et ont continué à être soumis au FGF9 pour étendre et maintenir la tige du Niche PNJ [35]. Après l'impulsion CHIR, le MM est passé à un PAX8 plus LHX1 plus un agrégat péritubulaire, qui s'est ensuite différencié en une LAM1 plus une vésicule rénale au 14e jour de différenciation. structures constituées d'épithéliums contigus portant plusieurs marqueurs pour chacun des podocytes (NPHS1 plus PODXL plus ), des tubules proximaux (LTL plus ), de l'anse de Henle (CDH1 plus UMOD plus ), des tubules distaux (CDH1 plus UMOD− ) et des tubules de connexion ( CDH1 plus AQP2 plus ) [36].

Freeman et al. ont utilisé une approche différente pour créer un protocole simplifié pour obtenir des organoïdes rénaux. Ici, les auteurs ont utilisé une méthode sandwich Matrigel pour fournir un microenvironnement 3D permettant aux hPSC de former des sphéroïdes entourant des cavités creuses de type amniotique [37]. Grâce à la différenciation dirigée, ces sphéroïdes sont stimulés pour devenir des organoïdes rénaux avec un protocole en deux étapes. Les sphéroïdes formés ont été traités avec CHIR pendant 1,5 jours, suivis d'une exposition à un milieu additionné de B27-. Au jour 10, des organoïdes tubulaires alambiqués, translucides se sont formés après la transition mésenchymateuse à épithéliale. Takato et al. ont identifié des caractéristiques de développement à la fois du canal collecteur et des progéniteurs du mésenchyme rénal [38]. Ici, les auteurs ont utilisé ces informations pour induire à la fois le mésenchyme métanéphrique (vs mésonéphrique) et l'épithélium urétique par 4 jours d'exposition au CHIR suivis de 3 jours d'exposition au FGF9. Les agrégats ont ensuite été cultivés pendant 20 jours, permettant la formation d'organoïdes correspondant à un rein du premier trimestre. Les auteurs ont revendiqué la présence du tube collecteur par la présence des marqueurs GATA3 et ECAD. Cependant, cela a été évalué plus tard comme peu fiable car les tubules distaux et collecteurs dérivés du MM peuvent également exprimer ces marqueurs [39, 40] (Fig. 2).

Fig. 2 Protocoles de différenciation dirigés pour générer des organoïdes rénaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme. Les similitudes et les différences entre les quatre protocoles pour générer des organoïdes de rein humain sont visualisées. Chaque protocole visualisé comprend l'échelle de temps en jours, le stade de développement de l'organoïde et les facteurs supplémentaires pour conduire la différenciation dirigée et la maturation des organoïdes. Les protocoles de Taguchi et al. et Takasato et al. abouti à des organoïdes sur membranes Transwell. Morizane et al. a permis la génération des organoïdes rénaux dans des plaques 96-puits et Freedman et al. dans une approche sandwich Matrigel

Après la publication des quatre protocoles de différenciation dirigée ci-dessus en 2015, plusieurs groupes ont suivi une approche similaire pour convertir séquentiellement les hPSC en strie primitive tardive, PIM, MM, agrégat péritubulaire, vésicule rénale et finalement organoïdes rénaux [41–44]. Wu et al. a effectué une transcriptomique unicellulaire à titre d'analyse comparative entre les protocoles Morizane et Takasato, à la fois l'un contre l'autre et contre le rein fœtal humain (16 semaines de gestation) et le rein humain adulte (62- homme d'un an avec uneun reinfonction). Lorsqu'ils ont été évalués dans des conditions statiques au 26e jour de différenciation, les deux protocoles ont généré des tissus immatures, chacun exprimant environ 20 % des facteurs de transcription des tubules proximaux adultes et des podocytes [41]. Cependant, Tran et al. ont utilisé la transcriptomique unicellulaire sur des organoïdes rénaux développés à l'aide du protocole Morizane pour soutenir l'application de podocytes dérivés d'organoïdes pour la modélisation de la maladie et la restauration de la fonction de filtration. Les podocytes d'organoïdes partageaient des profils transcriptionnels progressifs très similaires avec les reins fœtaux humains et recrutaient le système vasculaire de l'hôte lors de la transplantation pour favoriser une maturation ultérieure [42]. Garreta et al. ont constaté que le profil transcriptionnel des organoïdes rénaux était étendu à celui des reins fœtaux humains du deuxième trimestre au jour 16 de différenciation en utilisant un hydrogel doux pour allonger la durée d'un microenvironnement 3D afin de faciliter les interactions cellule-cellule et cellule-matrice [44] . Suivant un protocole de différenciation similaire, Low et al. effectué un séquençage d'ARN unicellulaire (RNAseq) qui a identifié un sous-ensemble de cellules progénitrices du néphron comme source potentielle du système vasculaire rénal, ce qui diffère des études sur le développement de la souris démontrant la source comme FLK1 plus des cellules progénitrices endothéliales, qui sont distinctes des PNJ du MM [45] et dérivent en partie des cellules progénitrices stromales FOXD1 [46]. Pourtant, d'autres découvertes majeures incluaient que la signalisation Wnt régit la vascularisation et la proportion de segments de néphron proximaux par rapport aux segments distaux, la maturation fonctionnelle des organoïdes après l'implantation et la modélisation de la polykystose rénale autosomique récessive (ARPKD) à l'aide de CSPi dérivées du patient [43].

Utilité translationnelle des organoïdes rénaux

En général, les modèles de recherche actuels pour étudier des maladies ou des composés sont souvent limités aux études cellulaires et aux modèles animaux. Les modèles cellulaires sont faciles à utiliser et peuvent être appliqués en grand nombre. Cependant, ceux-ci incluent souvent des lignées unicellulaires et ne peuvent pas saisir la complexité des reins humains in vivo tels que le microenvironnement 3D et les multiples cellules présentes. Par conséquent, les modèles cellulaires sont incapables d'imiter la morphologie tissulaire 3D in vivo et le microenvironnement hétérogène et complexe. Pour tenir compte de l'environnement complexe in vivo, les modèles animaux tels que les souris ont été un modèle de recherche conventionnel. Cependant, ces modèles sont peu transposables aux conditions humaines [47, 48]. De plus, les préoccupations éthiques concernant l'utilisation d'animaux à des fins de recherche ont augmenté [49, 50].

Par conséquent, de nouveaux modèles capables de reproduire plus précisément la situation humaine in vivo sont nécessaires [51].

Les organoïdes ont le potentiel de surmonter ces limitations en raison de leur capacité unique à imiter la situation in vivo des humains. Et parce que les organoïdes sont dérivés des hiPSC, ils peuvent également être utilisés pour la médecine personnalisée. Par exemple, certains (combinaisons de) composés peuvent être testés avec les organoïdes dérivés de cellules d'une personne spécifique pour tester la toxicité ou l'efficacité. De plus, des applications à plus grande échelle sont possibles. Par exemple, les organoïdes peuvent être utilisés comme modèles précliniques pour déterminer les caractéristiques de certains composés. De plus, des modèles fiables de maladies humaines peuvent être utilisés dans des essais cliniques pour accélérer le développement de traitements pour des maladies particulièrement rares pour lesquelles les patients sont rares.

Bien que davantage de progrès soient nécessaires pour créer des reins pleinement fonctionnels in vitro, les études à ce jour sont très prometteuses. Certaines études ont déjà montré des applications des organoïdes rénaux tels qu'ils sont aujourd'hui. Ces avancées dans les organoïdes rénaux permettent l'application (future) pour la médecine régénérative et comme modèles de développement, de toxicité et de maladie. Parmi ces applications translationnelles, les organoïdes sont également considérés comme des méthodes potentielles d'application de la médecine régénérative pour créer des reins issus de la bio-ingénierie afin d'introduire des thérapies alternatives à la dialyse et à la greffe de rein (Fig. 3). Comme de nombreuses revues ont rapporté les applications translationnelles publiées des organoïdes rénaux [1, 52–59], cette revue se concentre sur la future génération de tissu rénal dérivé de cellules souches qui est histologiquement biosimilaire au rein humain natif pour faciliter la traduction de la recherche sur les organoïdes rénaux. vers un impact sur les soins cliniques.

Défis actuels et perspectives d'avenir

Le rein est un organe hautement vascularisé qui reçoit collectivement 20 % du débit cardiaque, filtrant jusqu'à 180 l de sang par jour [60]. Dix-neuf kilomètres de capillaires glomérulaires, d'une surface de ~ 6000 cm2, contribuent à la barrière de filtration glomérulaire (GFB) [61]. Les constituants du GFB sont les capillaires glomérulaires fenestrés, la membrane basale glomérulaire chargée négativement et les podocytes présentant des diaphragmes à fente entre les processus du pied [61]. La structure du GFB engendre sa fonction, la filtration du sang basée sur la taille et la charge des solutés. L'urine primitive formée à partir de la filtration glomérulaire pénètre dans les tubules néphroniques, où elle est traitée par des mécanismes d'absorption et de sécrétion. Sur les 180 litres de filtrat, environ 99 % sont absorbés et seulement 1 à 2 litres sont destinés à l'excrétion urinaire dans des conditions normales. Compte tenu de la résorption volumique substantielle dans les capillaires péritubulaires, il n'est pas surprenant que plusieurs néphrons se drainent vers des canaux collecteurs partagés qui convergent au niveau du bassinet rénal pour former des uretères solitaires. La structure globale, de la vascularisation étendue du néphron proximal à la communication généralisée du lit capillaire épithélial-péritubulaire tubulaire au drainage du néphron distal arborisé, joue un rôle essentiel dans la fonction rénale. Les reins maintiennent une fonction relativement nécessaire même lorsque la capacité diminue à 20 %, bon nombre de ces patients restant asymptomatiques. Cependant, les réductions à moins de 15 % se traduisent souvent par la nécessité d'une RRT [62, 63]. Les PNJ dotés de capacités de régénération sont perdus chez les humains avant la naissance et, par conséquent, les néphrons ne peuvent pas se renouveler. Actuellement, il n'y a pas de thérapies disponibles pour reconstituer la fonction rénale perdue, il y a donc une forte demande pour les applications de médecine régénérative. De plus, un GFB est nécessaire pour modéliser les maladies qui affectent la filtration, le transport tubulaire fonctionnel nécessaire pour une grande variété de tests de toxicité et de modélisation de maladies, et la combinaison de néphrons dérivés de MM avec des conduits collecteurs dérivés d'UB nécessaires pour modéliser la plupart des anomalies congénitales du rein. et des voies urinaires (CAKUT) [64]. Le développement d'un système vasculaire rénal organisé et d'un système de collecte ramifié représenterait des sauts translationnels significatifs dans la technologie des organoïdes rénaux.

Vascularisation organoïde rénale

La vascularisation du rein implique deux processus distincts : la vasculogenèse et l'angiogenèse [65]. Dans la vasculogenèse, l'assemblage vasculaire se produit de novo, tandis que l'angiogenèse implique la ramification ou l'extension de vaisseaux préexistants. L'interaction entre ces deux processus au cours de la néphrogenèse reste inconnue, mais les microvaisseaux rénaux vasculogènes peuvent précéder le développement de l'artère rénale angiogénique [65]. Chez la souris, le MM n'a pas de système vasculaire lors de l'invasion des bourgeons urétiques mais développe un riche réseau capillaire le lendemain avec la formation ultérieure de glomérules vascularisés. Ce dernier est réalisé par des cellules endothéliales qui envahissent la fente vasculaire pour former des glomérules à boucle capillaire unique [66–68]. Pendant ce temps, le FLK1 vasculogène plus les cellules progénitrices endothéliales intercalées dans le MM contribuent au riche réseau capillaire glomérulaire [69]. Semblable aux approches de différenciation dirigée pour la formation de MM ex vivo, la vascularisation du tissu rénal dérivé de hPSC devrait suivre ses origines embryonnaires pour développer le réseau vasculaire rénal à motifs et hiérarchique.

Les organoïdes rénaux 3D développés à partir des protocoles initiaux pour le MM dérivé du PIM se sont avérés contenir des cellules vasculaires ; cependant, les glomérules sont restés largement avasculaires et l'abondance globale des vaisseaux sanguins était faible par rapport au tissu rénal natif [70]. Fait important, ces assemblages de vaisseaux sanguins vasculogéniques imitent la formation précoce de microvaisseaux dans le développementun reintissu, survenant avant l'envahissement angiogénique de l'artère rénale [65]. Dans leur travail fondateur, Taguchi et al. ont transplanté leur MM de souris induit chez des souris, avec un système vasculaire angiogénique dérivé de l'hôte entraînant une augmentation des capillaires glomérulaires. Les grappes de podocytes WT1 plus co-localisées avec les vaisseaux PECAM1 plus, qui contenaient des globules rouges hôtes lors de l'imagerie [31]. Une transplantation sous-capsulaire similaire d'organoïdes rénaux a été répétée, démontrant que la vascularisation dans les glomérules des organoïdes dérive de manière persistante de l'hôte et la formation d'une membrane basale glomérulaire précoce constituée de cellules endothéliales fenêtrées et de processus de pied de podocyte [71]. Un faible degré de filtration glomérulaire a été revendiqué sur la transplantation sous-cutanée d'organoïdes rénaux, basé sur la détection intracellulaire dans les tubules de dextranes fluorescents administrés par voie systémique pris pour signifier l'absorption du filtrat glomérulaire [72] ; cependant, une fixation apicale permise par l'absence de jonctions serrées dans la capsule de Bowman vers le tubule proximal ou une fixation basolatérale via des mécanismes phagocytaires tubulaires ne peut être exclue [73]. S'appuyant sur leurs travaux dans lesquels des organoïdes rénaux transplantés sous la capsule rénale sont vascularisés par l'hôte et démontrent une maturation glomérulaire et tubulaire [71], récemment, van den Berg et al. ont développé un élégant système in vivo utilisant l'imagerie multiphotonique à haute résolution pour démontrer le tamisage glomérulaire sélectif en fonction de la taille [74]. Notamment, les glomérules vascularisés formés à partir de tissus chimériques interspécifiques ne parviennent pas à surmonter les limitations liées à la dépendance continue des systèmes animaux, y compris les différences de développement et physiologiques entre les espèces, une perte importante pour les approches de médecine personnalisée, un faible débit et un coût élevé.

La vascularisation des organoïdes rénaux a été obtenue in vitro, avec des résultats similaires à ceux rapportés dans les expériences de transplantation. En mariant les technologies d'organoïde rénal et de rein sur puce pour récapituler le microenvironnement fluidique in vivo, Homan et Gupta et al. ont constaté que la contrainte de cisaillement fluidique appliquée aux organoïdes rénaux intégrés sur puce facilitait la formation de réseaux vasculaires perfusables développés à partir de l'expansion et de la différenciation des cellules progénitrices endothéliales co-induites. De plus, les auteurs ont démontré une polarité et une maturation accrues des cellules épithéliales tubulaires et des podocytes, qui manifestent des processus de pied qui aboutaient aux capillaires glomérulaires pour former un GBM primitif [70, 75]. Bien que les organoïdes rénaux aient été superfusés, par opposition à un écoulement limité à l'intérieur du système vasculaire, l'application d'une contrainte de cisaillement fluidique sur des organoïdes entiers simule le flux interstitiel généré par les déplacements de fluides compartimentaux lors de la réabsorption d'environ 99 % du filtrat glomérulaire. En d'autres termes, environ 99 % du volume des lumières tubulaires est transmis à travers l'interstitium et réabsorbé par les capillaires péritubulaires in vivo. Alors que la vascularisation perfusable a été démontrée à l'aide de sondes fluorescentes, la filtration glomérulaire n'a pas été soutenue par la détection de la fluorescence dans les lumières tubulaires en raison de l'utilisation de billes de 500 nm de diamètre, tout en notant que le diamètre moyen des fenestrations dans les capillaires glomérulaires est d'environ 70 nm [ 76]. Notamment, toute la vascularisation du système est dérivée des organoïdes rénaux sans invasion angiogénique.

Les méthodes pour surmonter les défis actuels comprennent le couplage de réseaux vasculaires angiogéniques in vitro avec des organoïdes rénaux vasculogènes pour permettre la maturation du GBM avec une filtration glomérulaire fonctionnelle. Il existe une multitude de raisons plausibles pour lesquelles la filtration glomérulaire définitive ne s'est pas encore produite dans les approches d'organoïdes rénaux sur puce, y compris le manque d'expérimentation longitudinale, la pression hydrostatique limitée transmise dans les capillaires glomérulaires, l'immaturité de l'épithélium du néphron et le potentiel de circulation essentielle. facteurs facilitant le développement du rein embryonnaire. Des réseaux vasculaires angiogéniques directement perfusables in vitro ont déjà été décrits, capables de supporter des tissus épais ou d'envahir des constructions cellulaires intégrées sur puce [77, 78]. Un tel système vasculaire peut s'anastomoser avec des microvaisseaux dérivés d'organoïdes pour limiter la perfusion dans le compartiment vasculaire, permettant la transmission d'une pression hydrostatique substantielle aux capillaires glomérulaires. D'autres limitations peuvent être résolues en utilisant des études longitudinales, en perfusant avec du sérum embryonnaire et en utilisant des organoïdes de jour de différenciation optimale (influant sur la maturité) dans de tels dispositifs. Si le réseau vasculaire angiogénique était composé de cellules humaines, alors les limitations liées aux différences inter-espèces seraient contournées. De même, l'utilisation de vaisseaux sanguins dérivés de hPSC, comme cela a été décrit [79], faciliterait les approches de médecine personnalisée pour le développement de médicaments et les stratégies de médecine régénérative.

Formation du bourgeon urétéral

La production d'ultrafiltrat glomérulaire ex vivo représenterait une découverte historique pour faciliter les applications translationnelles du tissu rénal dérivé de cellules souches, mais un système de collecte serait nécessaire pour le drainage ultérieur. Un réseau de conduits collecteurs ramifiés de manière dichotomique fait converger la sortie des ~ 1 million de néphrons d'un rein individuel vers un seul uretère [60]. Les canaux collecteurs transportent non seulement le filtrat, mais sont également impliqués dans la réabsorption de l'eau et l'équilibre électrolytique via divers transporteurs et canaux dans ses différents types de cellules épithéliales tubulaires. Les canaux collecteurs sont un produit de la morphogenèse ramifiée du bourgeon urétéral qui est contrôlée par divers signaux moléculaires qui peuvent être exploités in vitro pour mimer ce processus, y compris les voies de signalisation FGF, GDNF/RET et Wnt [68].

Des études sur le développement du rein à l'aide de MM et UB de souris microdisséquées fournissent un aperçu significatif de la formation précoce de ce qui constituera le rein humain adulte. Le MM non induit, séparé des structures épithéliales de l'UB, empêche la maturation de l'un ou l'autre des tissus. Cependant, la coculture de MM et UB ex vivo est capable de reconstituer le rein de souris, ce qui suggère que ces populations de précurseurs rénaux possèdent un programme autonome suffisant pour piloter l'organogenèse rénale [80]. Du point de vue du développement, la méthode optimale pour développer un tissu rénal fonctionnel à partir de hPSC in vitro est susceptible d'impliquer séparément l'induction de MM et UB avec une efficacité élevée et la coculture des deux populations distinctes.

Les protocoles de différenciation décrits précédemment génèrent majoritairement des MM, destinés à devenir des structures néphroniques. La différenciation dirigée vers les cellules progénitrices des canaux collecteurs de l'UB a été publiée pour la première fois en 2013, avant que Taguchi ne délimite les origines IM divergentes du MM et de l'UB. Xia et al. converti les hPSC en tissu engagé mésodermique en utilisant FGF2 et BMP4 pendant 2 jours, puis induit des cellules progénitrices UB en utilisant une combinaison d'activine, de BMP2 et d'acide rétinoïque pendant 2 jours supplémentaires dans un protocole de différenciation en deux étapes [81, 82]. Cellules progénitrices UB dérivées de hPSC auto-assemblées dans un tissu chimérique inter-espèces lorsqu'elles sont combinées avec un MM embryonnaire de souris. En 2017, en analysant les profils d'expression des gènes au cours du développement du bourgeon urétéral chez des embryons de souris, Taguchi et al. ont établi un protocole pour inclure à la fois les tissus MM et UB dans les organoïdes rénaux en utilisant des ESC de souris (mESC) [83]. Ce protocole était basé sur le tri FACS CXCR4 plus KIT plus les progéniteurs du conduit de Wolff. La coculture de progéniteurs de canaux de Wolff avec des MM dérivés de mESC a nécessité la présence de cellules progénitrices stromales pour former des organoïdes réassemblés qui ont subi une organogenèse d'ordre supérieur pour former des néphrons interconnectés par un épithélium urétéral ramifié. En fin de compte, les résultats n'ont pas été reproduits dans le MM et l'UB dérivés des hPSC en raison de l'arrêt prématuré de la ramification de l'UB, ce qui, selon les auteurs, pourrait être dû à l'absence du pool de progéniteurs stromaux [83]. L'établissement d'une différenciation dirigée vers les progéniteurs stromaux du rein humain et un accès accru aux tissus rénaux fœtaux humains primaires peuvent discerner la cause de la morphogenèse ramifiée incomplète rapportée. Pourtant, il peut y avoir des limites dans l'efficacité d'induction du type de cellule requis, à savoir les cellules proliférantes Ret plus UB tip, qui sont responsables de la ramification et de la formation d'une liaison structurelle avec les tubules de connexion des néphrons distaux [84].

Il y a peu de protocoles de différenciation dirigés des hPSC vers UB et ses dérivés, les protocoles publiés démontrant des limites. Des protocoles améliorés sont nécessaires pour permettre l'ajout d'un réseau de conduits collecteurs pour couvrir l'intégralité des organoïdes rénaux contenant des néphrons. Analogue à la maximisation de l'efficacité d'induction pour les PNJ basée sur l'expression de SIX2, la maximisation de l'efficacité d'induction pour les cellules de pointe UB basée sur l'expression de Ret est l'une de ces stratégies. À cette fin, une compréhension du développement des reins est nécessaire. Notamment, l'UB se forme comme une sortie du canal de Wolff (alias canal mésonéphrique), qui est généré à partir de la migration caudale des cellules IM antérieures vers le bas du sinus urogénital jusqu'au cloaque, notant que ces cellules subissent un MET en cours de route. Les origines détournées de l'UB posent un défi à l'établissement d'un protocole de différenciation dirigée robuste. Cependant, les cellules mésenchymateuses exprimant Ret présentes dans l'aIM sont capables de contribuer à l'UB [84], de sorte qu'un protocole d'étape 3- peut convertir les hPSC en séquence primitive précoce (étape 1), puis aIM (étape 2) , puis Ret plus les cellules de pointe UB (étape 3). Notamment, le référentiel cellulaire du consortium ReBuilding a Kidney (RBK) des NIH comprend une ligne de reporter Ret

Conclusion

Le rein est un organe remarquable qui régule entre autres l'homéostasie hydrique et électrolytique du corps. La dérégulation de ces processus peut entraîner de graves complications de santé avec un lourd fardeau sociétal et économique. Grâce à notre compréhension de la néphrogenèse humaine in vivo, nous avons mis en lumière la récapitulation de ce processus in vitro. Les progrès actuels ont permis la génération d'organoïdes rénaux dérivés de hiPSC. Ces organoïdes rénaux ressemblent au rein humain et offrent des avantages supplémentaires par rapport aux modèles de recherche conventionnels. L'application des organoïdes rénaux comprend la médecine régénérative et les modèles de développement, de toxicité et de maladie. Malgré les progrès de ces dernières années, les organoïdes rénaux nécessitent des protocoles améliorés et des modifications vers la maturation des tissus, le système vasculaire perfusable et l'intégration du système de collecte. Ensuite, ces systèmes doivent être adaptés pour apporter une valeur supplémentaire aux modèles conventionnels de recherche cellulaire et animale, voire les remplacer. L'amélioration des protocoles de génération d'organoïdes grâce à notre connaissance croissante du développement du rein, combinée à l'adoption de la technologie des organes sur puce, peut faciliter et accélérer la traduction des organoïdes rénaux 3D vers une utilisation clinique.

Extrait de : "Organicoïdes rénaux 3D pour la traduction du banc au chevet" parNavin Gupta, et al

---J Mol Med (2021) 99 : 477–487