Une étude de toxicité subchronique de 13- semaines sur le 2- (l-menthoxy)éthanol chez le rat F344

Pour plus d'informations:emily.li@wecistanche.com

Takeshi Toyoda, Kohei Matsushita, Hirotoshi Akane, Tomomi Morikawa et Kumiko Ogawa

1 Division de pathologie, Institut national des sciences de la santé, 3-25-26 Tonomachi, Kawasaki-Ku, Kawasaki 210-9501, Japon

Résumé:

Le {{0}}(-menthoxy)éthanol a été fréquemment utilisé comme agent aromatisant ; cependant, les données concernant la toxicité du 2-(I-menthoxy)éthanol restent limitées. Nous avons réalisé une étude de toxicité subchronique de 13-semaines sur le 2-(I-menthoxy)éthanol chez des rats F344 mâles et femelles, avec des doses de 0,15.j ou 250 mg/ke de poids corporel (BWday administré par voie orale hw moyenne en utilisant l'huile de maïs comme véhicule Aucun changement toxicologique significatif de l'état général, du poids corporel ou de l'apport alimentaire n'a été observé dans aucun des groupes L'évaluation hématologique a montré une diminution de l'hémoglobine, de l'hématocrite, du volume corpusculaire moyen et de l'hémoglobine corpusculaire moyenne et une augmentation du nombre de plaquettes chez La biochimie sérique a révélé une élévation du cholestérol total dans le groupe 250 mg/kg de rats mâles et femelles, une diminution des triglycérides dans le groupe femelle 250 mg/kg et une augmentation des protéines totales dans le groupe mâle 250 mg/kg. indiquant des effets sur le métabolisme des lipides et la synthèse des protéines. Pour le poids des organes, les poids absolu et relatif du foie et des glandes surrénales ont augmenté dans le groupe de 250 mg/kg des deux sexes et le groupe de 250 mg/kg de mâles, respectivement. Analyse histopathologique ont montré une néphropathie chronique chez les mâles recevant 15 mg/kg ou plus, avec une augmentation absolue et relativeun reinpoids, ainsi qu'une élévation de la créatinine sérique chez les mâles recevant 60 et 250 mg/kg. Cependant, des granules éosinophiles contenant de l'a,-globuline ont été identifiés dans les tubules proximaux, suggérant une2-néphropathie à globuline spécifique aux rats mâles et sans signification toxicologique. Ces résultats ont indiqué que le niveau sans effet nocif observé de 2-(-menthoxy)éthanol était de 60 mg/kg de poids corporel/jour pour les deux sexes, (DOI ; 10.1293tox2020-0091:J Toxicol Patho 1 2021;34 :309-317)

Mots clés :2-(-menthoxy)éthanol, 2-1-menthoxyethandl,alimentsadditif, aromatisant, rat Fischer, menthd

Cistanche est bon pour les reins

Introduction

Le {{0}}(-Menthoxy)éthanol (N° CAS38618-23-4) est un liquide clair et incolore avec une odeur caractéristique et est largement utilisé comme agent aromatisant. Le Comité mixte FAO/OMS d'experts des additifs alimentaires (JECFA) a évalué le 2-(1-méthoxy)éthanol en tant qu'agent aromatisant classé comme une substance structurellement apparentée au menthol. Sur la base de la classe structurelle des agents aromatisants, le 2-(-méthoxy)éthanol a été attribué à la classe I. Aux États-Unis et en Europe, les niveaux d'ingestion de 2-(I-méthoxy)éthanol par les humains étaient estimées à 12 ug/personne/jour et 0,01 ug/personne/jour, respectivement, toutes deux inférieures au seuil de classe I de 1 800 ug/personne/jour. Sur la base de ces estimations, il est considéré que le 2-(1-méthoxy)éthanol peut ne pas présenter de problèmes de sécurité lors d'une utilisation de routine en tant qu'agent aromatisant.

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD.:>2,000 mg/kg de poids corporel [PC]1. Malgré l'utilisation de 2-(1-menthoxy)éthanol comme agent aromatisant. des données limitées sont disponibles concernant la toxicité à doses répétées de ce composé. Notre laboratoire a étudié la toxicité de plusieurs additifs alimentaires, y compris des agents aromatisants représentatifs de chaque catégorie, dans des modèles de rongeurs2-7. Pour clarifier le profil toxicologique et établir une dose sans effet nocif observé (NOAEL), nous avons mené une étude de toxicité subchronique de 13- semaines sur le 2-(1-éthoxy)éthanol, qui a été administré par voie orale à des rats F344 par gavage.

Matériaux et méthodes

Produit chimique d'essai

2-(I-Menthoxy)éthanol (Lot n° 510002, pureté 99,9 %) produit par Takasago Int. Corp. (Tokyo, Japon) a été fourni par la Division des normes et de l'évaluation, Département de la sécurité alimentaire, Ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être, Japon, avec le soutien de la Japan Flavor & Fragrance Materials Association (Tokyo, Japon). Bien que la substance d'essai ait été fournie sous la forme d'un mélange d'isomères optiques (n° CAS 38618-23-4), elle a été confirmée comme étant l'1-énantiomère (n° CAS 75443-64-0) ​​par le fabricant. Le gavage oral avec de l'huile de maïs (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japon) comme véhicule a été choisi comme voie d'administration en raison de l'insolubilité aqueuse et de la volatilité du 2-(1-menthoxy)éthanol. Des solutions de 2-(1-menthoxy)éthanol ont été préparées quotidiennement, immédiatement avant l'administration. Après stockage pendant 2 h à température ambiante, les ratios résiduels de 2-(-menthoxy)éthanol dans 4, 40 et 400 mg/mL de solution ont été confirmés à 96,8 %, 99,8 % et 96,5 %, respectivement, par chromatographie en phase gazeuse (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokyo, Japon).

Animaux d'expérimentation

Au total, 40 rats mâles et 40 rats exempts d'agents pathogènes spécifiques aux femelles (F344/DuCrlCrlj,5-âgés d'une semaine) ont été achetés chez Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japon) et utilisés après acclimatation pendant une semaine. Au cours de l'étude, les animaux ont été logés dans des cages en polycarbonate avec une litière en copeaux souples, maintenus dans une pièce avec un système de barrière pour contrôler le cycle lumière/obscurité (12 h), la ventilation (taux de renouvellement d'air de 18 fois/h), la température (24 ±1 degré) et l'humidité relative (55±5 pour cent). Les cages et la litière à copeaux étaient remplacées deux fois par semaine. Chaque animal avait libre accès à l'eau du robinet et à une alimentation de base (CRF-1 ; Oriental Yeast, Tokyo, Japon). Au début de l'expérience, les animaux ont été répartis au hasard en quatre groupes de 10 rats mâles et femelles chacun, sur la base des poids corporels mesurés immédiatement avant le début du traitement avec le produit chimique d'essai.

Étudier le design

Dans une étude préliminaire de {{0}}jours évaluant le2-(1-menthoxy)éthanol administré à des doses de 0.200 400 et 800 mg/kg de poids corporel/jour, les poids absolu et relatif du foie ont augmenté de manière significative dans tous les groupes traités des deux sexes (données non présentées). Sur la base de ces résultats, nous avons sélectionné des doses de 2-(-menthoxy)éthanol de 0,15,60 et 250 mg/kg de poids corporel/jour pour l'administration aux rats mâles et femelles dans le présent 13- étude de toxicité d'une semaine.

Les conditions générales et la mortalité ont été évaluées quotidiennement. Les poids corporels, ainsi que les quantités de nourriture fournie et résiduelle, ont été mesurés une fois par semaine pendant la période expérimentale. Tous les rats ont été mis à jeun pendant une nuit à la fin du traitement, et des échantillons de sang pour l'hématologie et la biochimie sérique ont été prélevés de l'aorte abdominale sous anesthésie par inhalation profonde à l'aide d'isoflurane. La conception de l'étude était conforme aux Directives pour la désignation des additifs alimentaires et à la révision des normes d'utilisation des additifs alimentaires du Japon (1996) et approuvée par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Institut national des sciences de la santé du Japon.

Hématologie et biochimie sérique

Les paramètres hématologiques suivants ont été analysés à l'aide des analyseurs d'hématologie automatiques ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, États-Unis) : nombre de globules blancs (WBC), nombre de globules rouges (RBC), concentration d'hémoglobine (HGB), hématocrite (HCT ), volume corpusculaire moyen (MCV), hémoglobine corpusculaire moyenne (MCH),

concentration corpusculaire moyenne d'hémoglobine (MCHC), numération plaquettaire (PLT) et cellules leucocytaires différentielles, y compris les neutrophiles (Neut), les lymphocytes (lymphe), les monocytes (Mono), les éosinophiles (Eosino) et les basophiles (Baso). L'analyse biochimique du sérum a été réalisée par Oriental Yeast pour les paramètres suivants : protéine totale (TP), albumine (Alb), rapport albumine/globuline (A/G), bilirubine totale (Bil). glucose, cholestérol total (T-Chol), triglycérides (TG), azote uréique (BUN), créatinine (Cre), calcium (Ca), phospho-rus inorganique (IP), sodium (Na), potassium (K), chlore (Cl), as-partate aminotransférase (AST), alanine aminotransférase (ALT), phosphatase alcaline (ALP) et y-glutamyl trans-peptidase (y-GTP).

Poids des organes et évaluation histopathologique

Une nécropsie complète a été réalisée pour tous les animaux. et le cerveau, le thymus, les poumons, le cœur, la rate,foie, surrénalglandes,reins, les testicules et les ovaires ont été pesés. Ces organes, ainsi que les tissus de la moelle épinière, du nerf trijumeau, de l'hypophyse, de la cavité nasale, des glandes salivaires, de la langue, de l'œsophage, de la trachée, de l'aorte, de la glande thyroïde, de la glande parathyroïde, du pancréas, de l'estomac, de l'intestin grêle et du gros intestin, sous-maxillaire et mésentérique les ganglions lymphatiques, le vagin, l'utérus, la vessie, la prostate, les vésicules séminales, l'épididyme, le fémur et le sternum avec la moelle osseuse, les vertèbres, les muscles squelettiques, le nerf sciatique, la peau et la glande mammaire, ont été fixés dans du formol neutre tamponné à 10 % ; ensuite, des sections incluses dans la paraffine ont été préparées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour un examen histopathologique. Les testicules et les yeux avec des glandes de Harder ont été fixés respectivement dans le fixateur de Bouin et la solution de Davidson. Les tissus osseux, y compris la cavité nasale, les vertèbres, le sternum et le fémur, ont été décalcifiés à l'aide d'un mélange de 10 % d'acide formique et de 10 % de formol tamponné pendant jusqu'à 2 semaines. Une évaluation histopathologique a été réalisée pour tous les tissus obtenus à partir d'animaux du groupe témoin et le groupe a reçu la dose la plus élevée, sauf si des lésions liées au traitement ont été observées.

Immunohistochimie de la ,-globuline

Chez les rats mâles, l'accumulation d'a.globuline dans le rein a été examinée par analyse immunohistochimique de coupes incluses en paraffine. Pour la récupération d'antigène, les coupes obtenues à partir de 5 rats de chaque groupe ont été incubées avec de la protéinase K (DAKO, Glostrup, Danemark) pendant 1 min à température ambiante. Toutes les sections ont été immergées dans une solution de H, O./méthanol à 3 % pendant 10 min à température ambiante pour l'inactivation de l'activité peroxydase endogène. Après avoir bloqué les réactions non spécifiques avec du sérum de lapin normal à 10 %, les coupes ont été incubées avec un anticorps primaire contre la -globuline (dilué à 1 : 400 ; anti-rat, anticorps anti-globuline ; R&D Systems, Minneapolis, MN, États-Unis) pendant une nuit à 4 degrés La visualisation de la liaison des anticorps a été réalisée à l'aide d'un kit Vecta-Stain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) et de la 3,3'-diaminobenzidine. Toutes les coupes ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline.

analyses statistiques

Les écarts dans les valeurs de données pour le poids corporel au cours de la période expérimentale, ainsi que pour l'hématologie, la biochimie sérique et le poids des organes, ont été évalués pour l'homogénéité à l'aide du test de Bartlett. L'analyse unidirectionnelle de la variance et le test de Kruskal-Wallis, respectivement, ont été utilisés pour les données homogènes et hétérogènes. Lors de la détermination des différences statistiquement significatives, le test de comparaison multiple de Dunnett a été utilisé pour comparer les groupes de contrôle et de traitement. Les comparaisons des incidences histopathologiques et des grades ont été analysées en utilisant respectivement le test de probabilité exacte de Fisher et le test U/ de Mann-W Whitney. Valeurs P de<0.05 were="" considered="" statistically="">

Résultats

Paramètres de la vie, hématologie et biochimie sérique Aucun signe clinique significatif n'a été noté pendant toute la période expérimentale et tous les animaux ont survécu jusqu'à l'autopsie prévue. De plus, aucune différence significative dans le poids corporel et l'apport alimentaire quotidien n'a été observée chez les rats mâles et femelles (Fig. 1A et B).

Les données d'hématologie et de biochimie sérique sont présentées dans les tableaux I et 2, respectivement. Les analyses hématologiques ont révélé une diminution significative du HGB, du HCT, du MCV et du MCH et une augmentation du PLT chez les rats mâles ayant reçu 250 mg/kg de poids corporel/jour de 2-(1-menthoxy)éthanol (tableau 1). Dans la biochimie sérique, des augmentations significatives de TP, T-Chol et Ca et des diminutions de Bil et ALP ont été notées chez les mâles du groupe 250 mg/kg (tableau 2). Une augmentation significative de Cre et une diminution de A/G ont été notées chez les mâles des groupes de 60 et 250 mg/kg. Chez les femelles, une augmentation significative du Ca et une diminution de l'ALP ont été enregistrées dans les groupes 60 et 250 mg/kg, alors qu'une élévation du T-Chol et une diminution de l'A/G, Bil, TG.AST et ALT ont été détectées dans les groupes 250 mg/kg/kg. groupe de kilogrammes.

Bien qu'une augmentation significative de TG et une diminution de Cl aient été observées chez les mâles ayant reçu 60 mg/kg, l'absence de relation avec la dose suggère que ces différences n'étaient pas associées à l'exposition à la substance d'essai.

Poids des organes

Les données sur le poids des organes sont résumées dans le tableau 3. Les poids absolu et relatif du foie ont augmenté de manière significative chez les deux sexes du groupe recevant 250 mg/kg (tableau 3). Une augmentation significative du poids relatif du foie a été observée chez les mâles du groupe 60 mg/kg. Chez les mâles, valeurs absolue et relativeun reinles poids ont été significativement augmentés dans les groupes de 60 et 250 mg/kg. Dans le groupe mâle de 250 mg/kg, des augmentations significatives du poids absolu et relatif des glandes surrénales et du poids relatif de la rate et des testicules ont été notées.

Histopathologie et immunohistochimie

Les données pour les résultats histopathologiques et immunohistochimiques sont résumées dans les tableaux 4 et 5, respectivement. Les résultats histopathologiques ont révélé que la fréquence d'accumulation de granules éosinophiles (Fig.2A-D), de tubules basophiles et de moulage hyalin, ainsi que d'inflammation interstitielle focale dans leun rein, ont été significativement augmentés dans les groupes de traitement exclusivement masculins par rapport au groupe témoin (tableau 4). Sur la base d'analyses immunohistochimiques, les rats mâles traités avec la substance testée ont présenté une augmentation de l'immunoréactivité de la globuline dans les cellules épithéliales des tubules proximaux, démontrant une nette dépendance à la dose (Fig.2E-H) (Tableau 5).

À l'autopsie, un rat mâle du groupe recevant 250 mg/kg a présenté une hypertrophie importante du côté droitun reinen raison d'un néphroblastome histologiquement caractéristique. Bien que le néphroblastome soit rare dans la plupart des souches de rats9, ce cas a été considéré comme accidentel, car aucun autre animal n'a présenté de lésions similaires. De plus, dans les études de cancérogénicité orale, l'incidence du néphroblastome spontané chez les rats mâles F344/DuCrlCrlj aurait varié entre 0-2.0 pour cent 10. Bien que plusieurs lésions aient été sporadiquement détectées dans d'autres organes, aucun traitement significatif- des modifications dépendantes de l'incidence de ces lésions étaient apparentes.

Discussion

À ce jour, 24 agents favorisants, y compris le 2-(-menthoxy)éthanol, ont été évalués par le JECFA en tant que substances structurellement apparentées au menthol, et tous sont répertoriés comme « aucun problème de sécurité » aux niveaux d'apport estimés actuels. Le 2-(1-menthoxy)éthanol est classé dans un sous-groupe d'alcools ou d'éthers alicycliques et est considéré comme étant principalement conjugué à l'acide glucuronique, suivi d'une excrétion urinaire !. Bien que les valeurs DL par voie orale de ces substances chez les rongeurs soient relativement élevées, les données issues des études de toxicité à doses répétées restent limitées. Une étude de toxicité à doses répétées de 13-semaines a révélé que le carboxylate de pyrrolidone de menthyle (n° CAS 68127-22-0), un composé structurellement apparenté au menthol, peut être associé à une augmentation relative desun reinpoids chez les rats Wistar mâles et femelles. L'accumulation de ß-globuline dans les tubules proximaux des rats mâles a également été observée à une dose de 1,111 mg/kg de poids corporel/jour, et la NOAEL a été déterminée à 109 mg/kg de poids corporel/jour.

Dans la présente étude de toxicité subchronique de 13-semaines sur le 2-(1-menthoxy)éthanol, aucun changement toxicologique de l'état général, du poids corporel et de l'apport alimentaire n'a été observé. Suite à l'évaluation hématologique, nous avons observé une diminution de HGB (96,6 % par rapport aux valeurs moyennes de contrôle), HCT (96,3 %), MCV (98,4 %) et MCH (98,2 %) et une augmentation de PLT (111 %) chez l'homme. groupe de 250 mg/kg, qui ont été considérés comme des influences toxicologiques du traitement au 2-(1-menthoxy)éthanol À la fois absolu (115 % chez les deux sexes) et relatif (119 % chez les hommes et 111 % chez les femmes ) le poids du foie était significativement augmenté chez les deux sexes dans les groupes de 250 mg/kg. Bien qu'il n'y ait eu aucun changement histopathologique dans le foie, une augmentation des taux sériques de T-Chol (110 % chez les hommes et 121 % chez les femmes) et de TP (105 % chez les hommes) et une réduction de TG (60,1 % chez les femmes) au cours des 250 Les groupes mg/kg indiquent des changements toxiques associés au métabolisme des lipides et à la synthèse des protéines dans le foie. Une réduction de HGB et MCH et une augmentation de PLT, T-Chol et TP chez les mâles et une diminution de TG et une augmentation du poids absolu et relatif du foie chez les deux sexes ont également été détectées, avec une signification statistique dans l'étude préliminaire de 28- jours (données non présentées ), corroborant que ces paramètres hématologiques et biochimiques sériques modifiés, ainsi que le poids du foie, n'étaient pas des effets fortuits mais liés à la substance d'essai. En revanche, l'augmentation significative du poids relatif du foie détectée dans le groupe mâle de 60 mg/kg dans la présente étude n'était pas accompagnée d'une augmentation du poids absolu ou de changements dans les paramètres biochimiques associés, ce qui suggère que cette augmentation était un changement adaptatif.

Une augmentation significative du poids absolu (120 pour cent) et relatif (118 pour cent) des glandes surrénales dans le groupe mâle de 250 mg/kg a été considérée comme étant associée au produit chimique d'essai. En outre, l'augmentation du poids absolu et relatif des glandes surrénales chez les deux sexes a montré une nette dépendance à la dose dans l'étude préliminaire du 28-jour (données non présentées), indiquant l'association avec le traitement chimique testé. Bien que l'hypertrophie des surrénales puisse résulter du stress, il n'y a eu aucun résultat suggérant un stress, tel qu'une réduction du gain de poids corporel ou une atrophie du thymus et d'autres organes lymphoïdes, tant dans la présente étude que dans les études préliminaires. Comme il peut ne pas y avoir de changements histopathologiques dans la glande surrénale même avec une production altérée de glucocorticoïdes en cas d'inhibition des enzymes liées à la stéroïdogenèse, la possibilité que l'augmentation du poids de la glande surrénale soit une découverte toxique ne peut être exclue. En revanche, l'augmentation du poids relatif de la rate et des testicules chez le mâle du groupe 250 mg/kg, non observée dans l'étude préliminaire, a été considérée comme non significative sur le plan toxicologique en raison de l'absence de lésions histopathologiques ou d'une augmentation significative du poids absolu. De même, la biochimie sérique a révélé une diminution de l'A/G et une augmentation de Ca chez les deux sexes, ce qui a été considéré comme n'ayant aucune signification toxicologique, étant donné qu'aucune anomalie n'a été détectée dans les paramètres connexes. De plus, la diminution des niveaux de Bil et d'ALP chez les deux sexes et la diminution de l'AST et de l'ALT chez les femmes contrastaient avec les effets toxiques attendus et étaient considérées comme non significatives.

Une néphropathie chronique caractérisée par des tubules basophiles, une fonte hyaline et une inflammation focale interstitielle a été observée avec une signification statistique chez les mâles de tous les groupes traités. De plus, augmentation de la Cre sérique et absolue et relativeun reindes poids ont été détectés chez les mâles des groupes 60 et 250 mg/kg ; ces changements n'ont pas été observés dans les groupes de traitement féminins. Dans ces cas, le degré d'accumulation de granules éosinophiles dans les cellules épithéliales tubulaires proximales a augmenté d'une manière apparemment dépendante de la dose. Ces granules ont été confirmés comme étant de la 2uglobuline par immunohistochimie, indiquant la survenue d'une néphropathie à x-globuline. -Les globulines liées à certains produits chimiques, comme le d-limonène, s'accumulent dans les lysosomes et sont observées dans les tubules proximaux sous forme de granules éosinophiles ou hyalins9. Cette accumulation peut endommager les cellules épithéliales, entraînant une néphropathie progressive chronique et la formation de tumeurs qui en résulte. Ainsi, bien que la NOAEL pour le 2-(1-men-thoxy)éthanol associé à ., la néphropathie à la globuline chez le rat mâlereinsn'a pas été identifié, ce type de néphropathie serait spécifique aux rats mâles et n'est donc pas pertinent pour l'évaluation des risques pour l'homme. Un risque accru d'insuffisance rénale médié par des mécanismes liés à l'accumulation de ,-globuline est hautement improbable, car cette protéine est absente chez l'hommel4. Par conséquent, il a été jugé raisonnable d'exclure les modifications associées à la néphropathie chronique observées chez les hommes de la détermination de la NOAEL.

En conclusion, la présente étude de toxicité subchronique de 13-semaines a démontré qu'un traitement à 250 mg/kg de poids corporel/jour de 2-(/-menthoxy)éthanol provoquait des modifications toxiques de l'hématologie, de la biochimie sérique et du poids des organes chez les mâles et rats F344 femelles. Sur la base des résultats observés, la NOAEL du 2-(1-menthoxyéthanol a été évaluée à 60 mg/kg PC/jour pour les deux sexes.

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