Une distribution distincte du facteur inductible par l'hypoxie -1 dans les cellules tubulaires rénales en culture avec hypoperfusion simulée par le placement de lamelle

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Résumé

L'hypoxie chronique du tubulo-interstitium rénal joue un rôle clé dans la progression de la maladie chronique.un reinmaladie(CKD). Il est donc important d'étudier l'hypoxie tubulaire et l'activité du facteur inductible par l'hypoxie (HIF) -1 en réponse à l'hypoxie. La raréfaction du capillaire péritubulaire provoque une hypoperfusion dans l'IRC ; cependant, l'effet de l'hypoperfusion sur les HIF a rarement été étudié. Nous avons induit une hypoperfusion causée par le placement de lamelle chez l'hommeun rein-2 cellules et observé un gradient d'oxygène sous la lamelle. L'immunocytochimie du HIF -1 a montré une formation en forme de beignet sur le bord d'une zone positive au pimonidazole, que nous avons nommée "l'anneau HIF". La tension d'oxygène de l'anneau HIF a été estimée entre environ 4 mmHg et 20 mmHg. Ce résultat n'était pas compatible avec ceux des recherches antérieures montrant l'accumulation de HIF -1 dans la plage anoxique avec une tension d'oxygène homogène. Nous avons en outre observé la présence d'un gradient de pH sous une lamelle, ainsi qu'un déplacement de l'anneau HIF dû aux changements de pH du milieu de culture, suggérant que l'anneau HIF a été formé par la suppression de HIF -1 lié à un pH bas. Cette recherche a démontré que l'activation du HIF-1 imite l'état physiologique des cellules en culture avec hypoperfusion.

MOTS CLÉShypoperfusion, hypoxie, facteur inductible par l'hypoxie, gradient d'oxygène, pH

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1|INTRODUCTION

L'incidence des maladies chroniquesun reinmaladie(MRC) augmente dans le monde à mesure que les sociétés vieillissent (Tonelli & Riella, 2014). La progression de l'IRC est irréversible une fois que les lésions rénales atteignent un certain degré et aboutissent finalement à une insuffisance rénale terminale (IRT), quelle que soit la maladie sous-jacente. Ce résultat indique l'existence d'une « voie finale commune ». D'après les analyses anatomopathologiques antérieures, le déclin de la fonction rénale est plus fortement corrélé à l'atteinte tubulo-interstitielle qu'à l'atteinte glomérulaire. Il y a eu plusieurs rapports démontrant que la fibrose rénale induit une hypoxie chronique dans le tubulointerstitium, et cette hypoxie tubulointerstitielle aggrave l'IRC et conduit à l'IRT. Ces preuves indiquent que l'hypoxie tubulo-interstitielle joue un rôle dans la voie commune finale de l'IRC (Mimura & Nangaku, 2010 ; Nangaku, 2006). Laun reinest très sensible à l'hypoxie en raison de sa forte demande en oxygène et de l'existence d'un shunt d'oxygène entre les artères et les veines intrarénales (Nangaku, 2006 ; Welch et al., 2001 ; Zhang et al., 2014). Par conséquent, nous considérons qu'il est essentiel d'étudier l'hypoxie et la réponse à l'hypoxie dans le tubulointerstitium rénal.

La principale réponse biologique à l'hypoxie chez les organismes vivants se produit via la voie du facteur inductible par l'hypoxie (HIF) (Hypoxia, 2011 ; Semenza & Wang, 1992 ; Zhou et al., 2003). HIF se compose de - et - sous-unités. Bien que la sous-unité - soit constitutivement active, la sous-unité - est dégradée en présence d'oxygène. Dans des conditions normoxiques, HIF- est hydroxylé par le domaine prolyl hydroxylase (Ph.D.), ce qui le rend reconnaissable par le suppresseur de tumeur von Hippel – Lindau (VHL). Cette reconnaissance entraîne l'ubiquitination et la dégradation du HIF- hydroxylé dans le protéasome. Dans des conditions hypoxiques, le HIF- s'accumule dans le cytosol, car le HIF- non hydroxylé échappe à la dégradation. HIF- accumulé est transloqué du cytosol vers le noyau, où il se dimérise avec HIF-, et agit comme un facteur transcriptionnel, favorisant l'expression des gènes en aval. Parmi les trois isoformes identifiées des sous-unités HIF - HIF-1 , HIF-2 et HIF-3 - les cellules épithéliales tubulaires rénales sont connues pour exprimer HIF-1 (Tanaka et al ., 2016). Des études antérieures ont montré une accumulation transitoire ou régionale de HIF dans leun reinavec CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), et ce HIF est activé dans la tension d'oxygène réduite dans le milieu CKD. La mauvaise adaptation à l'hypoxie dans l'IRC pourrait être causée par la présence de facteurs qui suppriment les voies HIF (Asai et al., 2016 ; Tanaka et al., 2013 ; Thangarajah et al., 2009). Des effets protecteurs de l'activation du HIF ont été rapportés dans plusieurs modèles animaux, y compris des rats diabétiques induits par la streptozotocine et des rats néphrectomisés 5/6 (Deng et al., 2010 ; Nordquist et al., 2015). doctorat les inhibiteurs ont récemment attiré l'attention en tant que nouvelles approches thérapeutiques de l'anémie rénale chez les patients atteints d'IRC (Akizawa et al., 2019 ; Chen et al., 2017, 2019 ; Coyne et al., 2017 ; Miyata et al., 2011 ; Pergola et al. ., 2016 ; Provenzano et al., 2016). Cependant, les détails de la progression de l'hypoxie rénale et la façon dont l'accumulation de HIF se produit dans leun reinavec CKD, restent obscures. L'hydroxylation dépendante de l'oxygène de HIF- se produit dans le cytosol, et il est donc important de mesurer la tension d'oxygène intracellulaire et extracellulaire. Il existe plusieurs méthodes utilisées pour mesurer la tension en oxygène, y compris l'utilisation de microélectrodes ou l'imagerie par résonance magnétique dépendante du niveau d'oxygène dans le sang (BOLD-MRI). Nous avons utilisé la microscopie d'imagerie à vie de phosphorescence (PLIM) pour la mesure quantitative du statut d'oxygène intracellulaire (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 est un colorant phosphorescent basé sur le complexe d'iridium (III) BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoate-pyridine, aac=acétylacétone) avec un groupe diméthylamino cationique, qui est passivement distribué dans les lysosomes intracellulaires. Il a été synthétisé sous forme de sonde phosphorécente pour mesurer la pression d'oxygène intracellulaire (Yoshihara et al., 2015). PLIM avec BTPDM1 a permis l'acquisition d'images haute résolution de la pression partielle d'oxygène dans les cellules tubulaires rénales sur la surface rénale de souris normales, fournissant des données indiquant la présence d'un gradient d'oxygène, même dans les reins normaux (Hirakawa et al., 2018 ).

Il existe des gradients d'oxygène dans les organes vivants, y comprisreins, même dans des conditions normales (Hirakawa et al., 2018 ; Kietzmann, 2017 ; Zhdanov et al., 2015), et de tels gradients peuvent donc également être attendus dans l'IRC. L'hypoperfusion est causée par la raréfaction de la microvasculature dans l'IRC, dans laquelle une lésion glomérulaire progressive entraîne une diminution du flux sanguin capillaire péritubulaire, aggravant la fibrose interstitielle. La fibrose interstitielle altère la diffusion et l'apport d'oxygène aux cellules tubulaires et conduit à la raréfaction de la microvascularisation, aggravant encore l'hypoxie tubulo-interstitielle (Mimura & Nangaku, 2010 ; Nangaku, 2006). Les effets biologiques de l'hypoperfusion restent cependant obscurs, car la plupart des études ont étudié les effets de l'hypoxie et du HIF -1 sur des cellules en culture dans des conditions de perfusion homogène et de tension en oxygène (Rexius-Hall et al., 2017). Des études antérieures ont démontré que des cellules en culture monocouche recouvertes d'une lamelle fournissent un bon modèle d'hypoperfusion induite par une barrière à la diffusion dans le milieu de culture. L'hypoperfusion modélisée est associée à un gradient d'oxygène car une lamelle empêche la diffusion de l'oxygène du haut du milieu vers les cellules (Pitts & Toombs, 2004 ; Takahashi & Sato, 2010 ; Yoshihara et al., 2015). Dans une monocouche de cellules en culture recouverte d'une lamelle, la tension d'oxygène intracellulaire chute avec la distance du bord de la lamelle en raison de la diffusion limitée de l'oxygène dans les cellules en culture. En conséquence, un gradient d'oxygène se forme du bord au centre de la lamelle, et la tension d'oxygène intracellulaire peut chuter à une plage anoxique au centre de la lamelle (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Dans la présente étude, nous nous sommes concentrés sur l'activation du HIF et avons recherché s'il existe un changement indépendant de l'oxygène dans l'expression du HIF en présence d'hypoperfusion avec un gradient d'oxygène. Étant donné qu'une hypoperfusion avec un gradient d'oxygène existe dans les tubules rénaux in vivo, l'observation d'effets indépendants de l'oxygène sur l'expression de HIF dans le modèle de lamelle couvre-objet peut fournir des informations sur le mécanisme sous-jacent à l'insuffisance d'accumulation de HIF dans l'IRC.

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2|MATÉRIAUX ET MÉTHODES

2.1|Culture de cellules

Les cellules cultivées ont été incubées dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. L'incubation hypoxique a été réalisée dans un incubateur personnel à CO2/multigaz APM-30D (Astec). L'anoxie a été induite avec un sac d'anoxie, AnaeroPack et des ensembles de culture anaérobie #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

Cellules HK-2 (Homo sapiens, humainun rein, mâle, CRL- 2190, ATCC, RRID : CVCL_0302), une lignée cellulaire épithéliale immortalisée du tubule proximal provenant d'un rein humain adulte normal, ont été cultivées dans le mélange milieu/nutriment Eagle modifié de Dulbecco F{{2} } Jambon (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) et une solution de pénicilline-streptomycine (15070063, Thermo Fisher Scientific) dans une boîte de culture de 10 cm. Pour le passage, les cellules HK-2 ont été dissociées avec de la trypsine (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) et centrifugées à 300 g pendant 5 min.

Cellules cancéreuses cervicales HeLa et embryon humainun reinles cellules 293 (HEK293) ont été cultivées dans du DMEM avec du glucose faible (1000 mg/L) (D6046, Sigma Aldrich) contenant 5 % de FBS dans une boîte de culture de 10 cm. Ces cellules ont été passées en tant que cellules HK-2.

Les cellules épithéliales des tubules rénaux proximaux (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) ont été entretenues à l'aide des kits RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Pour le passage, les RPTEC ont été dissociées à l'aide de trypsine, neutralisées avec une solution neutralisante à la trypsine (CC -5002, Lonza Ltd.) et centrifugées à 200 g pendant 5 min.

2.2|Etablissement d'un modèle d'hypoperfusion par pose de lamelle

Des lamelles de forme ronde de 15 mm de diamètre (C015001, Matsunami) ont été nettoyées par ultrasons et stockées dans de l'éthanol à 99,5 % avant utilisation. Deux méthodes ont été employées, basées sur l'observation des cellules à l'extérieur de la lamelle.

Les cellules cultivées en monocouche ont été prises en sandwich entre une lamelle et le fond d'un plat (figure S1a, b), ou une méthode alternative (figure S1c), comme décrit ci-dessous. La méthode traditionnelle ou alternative a été sélectionnée pour établir notre modèle de lamelle pour l'imagerie en direct, qu'il s'agisse d'imagerie à l'oxygène ou d'imagerie PH. Pour l'immunocytochimie (ICC), la méthode alternative a été choisie, car lors de l'utilisation de la méthode traditionnelle, la majorité des cellules se détachaient fréquemment du fond du plat lors du retrait de la lamelle pour la fixation des cellules (Figure S2a).

2.2.1|Méthode traditionnelle

Le jour 1, les cellules ont été placées au fond d'une boîte en verre de 27 mm (3910-035, Iwaki) à une confluence de 100 % * (environ 5,0 × 105/boîte). Ils ont été cultivés dans du DMEM/F12 contenant 10 % de FBS sans solution antibiotique pendant une nuit. Le jour 2, une lamelle couvre-objet a été placée sur les cellules cultivées pendant la période indiquée (figure S1b).

2.2.2|Méthode alternative

Les cellules ont été ensemencées sur une lamelle dans une boîte de culture de 35 mm à 100 % de confluence (environ 5,0 × 105/boîte) le jour.

1. Ils ont été cultivés dans du DMEM/F12 contenant 10 % de FBS sans solution antibiotique pendant une nuit. Au jour 2, la lamelle a été inversée pour fixer la surface de ses cellules au fond d'un nouveau plat à base de verre de 27 mm pendant une période spécifiée (Figure S1c).

Nous avons également créé un modèle de lamelle en utilisant des lamelles de forme ronde d'un diamètre de 10 mm (CS01005, Matsunami) (Figure S2b).

2.3|Imagerie de l'oxygène en direct avec BTPDM1

Les cellules cultivées ont été préparées le jour 1, comme décrit ci-dessus. Au jour 2, les cellules ont été rincées deux fois avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) et incubées avec 500 nM de BTPDM1, un colorant lipophile cationique à base d'iridium utilisé comme sonde phosphorescente intracellulaire (Yoshihara et al., 2015), dans du DMEM/F12 sans rouge de phénol (21041-025, Thermo Fisher Scientific) pendant 30 min. Après que les cellules ont été lavées deux fois avec du HBSS, elles ont été prises en sandwich entre une lamelle et le fond d'une boîte, comme décrit ci-dessus. L'intensité de la phosphorescence de BTPDM1 dans des cellules en culture recouvertes d'une lamelle a été observée à l'aide d'un filtre d'excitation et d'émission, et la phosphorescence de BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) a été détectée à l'aide d'un microscope à fluorescence, BZ-X710 (Keyence Corporation). Les images obtenues à partir du microscope à fluorescence inversé ont été ajustées pour la luminosité et le contraste à l'aide du logiciel d'analyse BZ-X.

2.4|Immunocytochimie

Les cellules sur une lamelle ont été cultivées avec 200 µM de pimonidazole HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) dans du DMEM/F12 sans rouge de phénol pendant 1 h, après quoi la lamelle a été tournée et attachée à un couvercle en verre, comme décrit précédemment. Les cellules ont ensuite été cultivées dans du DMEM/F12 sans rouge de phénol pendant une durée déterminée. Lorsque la contre-coloration au pimonidazole n'a pas été utilisée, le prétraitement au pimonidazole a été omis.

Après la fin de la période de culture, chaque lamelle a été collectée et les cellules ont été immédiatement fixées avec du méthanol/acétone (1:1) sur de la glace, où elles sont restées pendant 30 min. Après avoir lavé deux fois avec de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Dulbecco (D5652, Sigma Aldrich), la membrane cellulaire a été perméabilisée pendant 30 min, incubée avec 5 % d'albumine de sérum bovin (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) pendant 30 min, puis avec bloc protéique sans sérum (X0909, DAKO) pendant 10 min. Les cellules ont été colorées avec un premier anticorps puis avec un second anticorps fluorescent. La liste des premiers anticorps est donnée dans le tableau S1. L'immunoglobuline anti-lapin polyclonale de porc FITC (F0205, dilution 1:20, DAKO) a été utilisée comme premier anticorps si l'hôte était un lapin. L'anticorps fluorescent Alexa Fluor 594 streptavidine (S11227, dilution 1:500, Thermo Fisher Scientific) a été utilisé comme premier anticorps si l'hôte était une souris, suivi d'une IgG anti-souris biotinylée (H plus L) (BA{{23} }, dilution 1:1000, Vector Laboratories), comme second anticorps. La coloration nucléaire a été réalisée en utilisant du trichlorhydrate de bisbenzimide H 33342 (B2261, Sigma Aldrich) pour chaque échantillon.

Les signaux fluorescents ont été observés à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé, BZ-X710 (Keyence Corporation) avec les filtres suivants : Texas Red avec une longueur d'onde d'excitation (Ex) de 560/40 nm, une longueur d'onde d'émission (Em) de 630/75 nm, GFP ( Ex : 470/40 nm, Em : 525/50 nm) et DAPI (Ex : 360/40 nm, Em : 460/50 nm). Les images ont été ajustées pour la luminosité et le contraste à l'aide du logiciel d'analyse BZ-X.

2.5|ICC de HIF de cellules HK-2 traitées avec du chlorure de cobalt

La méthode alternative a été modifiée pour produire un modèle de lamelle de cellules HK-2 traitées avec du chlorure de cobalt. Les cellules HK-2 ont été ensemencées à une densité semi-confluente (2,5 × 105/boîte) sur une lamelle le jour 1 et traitées avec 300 µM de chlorure de cobalt hexahydraté (C 8661, Sigma Aldrich) pendant 16 h le Jour 2. Le jour 3, la lamelle a été inversée pour fixer les surfaces cellulaires au fond d'un nouveau plat à base de verre de 27 mm pendant 3 h, et l'ICC de HIF a été réalisée.

2.6|Western blot

Pour étudier l'accumulation de HIF{{0}} sous différentes tensions d'oxygène et à différents niveaux de pH, 1.0 × 106 cellules HK-2 par boîte de culture de 10 cm ont été incubés sous normoxie, 2 % d'oxygène, 1 % d'oxygène ou anoxie, pendant 5 h, ou dans du DMEM/F12 à pH 7,4, pH 6,0 ou pH 5,0 pendant 5 h.

Ces cellules ont été lysées dans un tampon RIPA contenant 50 tampon Tris mM (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % w/v de sodium désoxycholate, 0,1 % p/v de SDS et 1,0 % p/v de NP40.

Pour le transfert Western, tampon d'échantillon SDS contenant {{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 % de SDS, 36 % de glycérol, 0,012 % de bleu de bromophénol et 0,1 M de dithiothréitol (DTT) a été ajouté aux protéines. Les protéines contenant le tampon d'échantillon SDS ont été éluées par ébullition à 95 degrés pendant 5 min.

Les protéines ont été séparées par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide SDS à 10 %. Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane AmershamTM HybondTM PVDF (10600023, GE Healthcare) dans un tampon de transfert (tampon Tris-base 48 mM, glycine 39 mM, 0,04 % SDS et 20 % v/v de méthanol) à l'aide d'un Trans-Blot® Système de transfert TurboTM (Bio-Rad). Les membranes ont été incubées à température ambiante avec des anticorps primaires, un anticorps anti-HIF1 (NB100-134, dilution 1:500, Novus Biologicals, RRID : AB_350071) et un anticorps anti-actine (A2066 , dilution 1:2000, Sigma Aldrich, RRID : AB_476693), puis dans l'anticorps secondaire, immunoglobuline polyclonale de chèvre anti-lapin/HRP (P0448, dilution 1:10000, DAKO, RRID : AB{{26 }}). Le substrat de transfert Western PierceTM ECL Plus (32132, ThermoFisher Scientific) a été utilisé pour la détection. La chimiluminescence a été observée à l'aide d'un analyseur Luminoimage ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). La reproductibilité a été confirmée en réalisant au moins trois expériences indépendantes. L'intensité des bandes a été quantifiée à l'aide du logiciel National Institutes of Health ImageJ (Schneider et al., 2012).

2.7|Test du rapporteur de la luciférase

Un test de rapporteur de luciférase a été effectué pour mesurer l'accumulation de HIF1 dans une incubation de culture hypoxique homogène. Nous avons précédemment construit un gène de luciférase marqué piloté par un élément sensible à l'hypoxie (HRE) et développé le vecteur rapporteur sensible à l'hypoxie (Transgene Construction). Ceci a été construit à partir de copies en tandem de l'HRE du gène du facteur de croissance endothélial vasculaire du rat sous-cloné dans la région 5 'de l'unité de transcription am CMV-promoteur-luciférase (pré-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al., 2004).

Des cellules HK{{0}} à une concentration de 1,0 × 105 par puits ont été préparées dans des plaques de culture 12-puits (150628, Thermo Fisher Scientific). Les cellules ont été co-transfectées avec 500 ng de vecteurs pGL3-Basic HRE-luciférase et 30 ng de vecteurs de contrôle pRL-SV40 Renilla luciférase (Promega), en utilisant 2 µl de réactif de transfection FuGENE® HD (E2311, Promega) par bien. Des cellules HK-2 co-transfectées avec 500 ng de vecteurs de luciférase de luciole de base pGL3- et 30 ng de vecteurs de contrôle de la luciférase de Renilla pRL-SV40 (Promega) ont été utilisés comme contrôle négatif.

Les cellules transfectées ont été incubées sous normoxie, 2 % d'hypoxie, 1 % d'hypoxie ou un sac d'anoxie pendant 5 h. Les cellules ont ensuite été récoltées en utilisant 100 ul de tampon de lyse passive des protéines, pour le dosage de la double luciférase. Un luminomètre LB9507 (EG et Berthold) a été utilisé pour les mesures. Pour corriger l'efficacité de la transfection, la valeur relative de l'unité lumineuse de luciférase de luciole a été divisée par celle de la luciférase de Renilla.

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2.8|Analyse de l'apoptose

Les cellules cultivées ont été recouvertes d'une lamelle couvre-objet pendant 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h et 24 h, puis recueillies à l'aide de trypsine. Les cellules traitées avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pendant 30 min ont été préparées comme contrôle apoptotique. L'analyse quantitative de l'apoptose a été effectuée à l'aide des kits d'annexine V et de cellules mortes Muse (MCH100105, Millipore) dans un analyseur de cellules Muse™ (Millipore), conformément aux instructions du fabricant.

2.9|PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)

L'extraction d'ARN total et la synthèse d'ADNc ont été réalisées conformément aux instructions du fabricant pour RNAiso Plus (9109, Takara) et PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) respectivement. La PCR en temps réel a été réalisée à l'aide du mélange qPCR THUNDERBIRD SYBR (QPS- 201, Toyobo) dans le système de détection PCR en temps réel CFX Connect (Bio-Rad). Les niveaux de transcription ont été normalisés au niveau d'expression d'ARNm de -actine. La qRT-PCR a été réalisée en triple en utilisant des amorces spécifiques au gène. HIF-1 a été amplifié à l'aide d'amorces directes 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCCGC-3′ et inverses 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′. -actine a été amplifiée à l'aide d'amorces directes, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′ et inverses 5′-AACTGGTCTCAAG TCATGTACAGG-3′.

2.10|Transfection avec siARN

Pour étudier l'inactivation de HIF-1 induite par l'ARNi dans les cellules HK-2, 5,0 × 104 cellules HK-2 par puits ont été préparées dans des plaques à six puits. Deux types d'ARNi—HIF-1 siARN (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] et siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific])—ont été utilisés avec Lipofectamine RNAiMAX Réactif de transfection (Thermo Fisher Scientific). Comme contrôle négatif, Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113) a été utilisé ; 1,5 µl de chaque siARN et 5 µl d'ARNiMAX ont été mélangés. Les cellules transfectées par l'ARNsi ont été incubées dans des conditions normoxiques ou hypoxiques (1 % d'O2) pendant 48 h et l'ARN a été extrait. L'efficacité de l'inactivation du HIF-1 a été examinée à l'aide de la qRT-PCR.

2.11|Imagerie en direct des effets d'un gradient de PH

Nous avons visualisé le gradient de pH intracellulaire des cellules vivantes sous une lamelle. Les cellules ont été traitées avec l'indicateur de pH intracellulaire pHrodo Green AM (p35373, ThermoFisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant, avant la mise en œuvre du modèle de lamelle. Un microscope à fluorescence inversé, BZ-X710 (Keyence Corporation) avec un filtre GFP a été utilisé pour observer la transition temporelle du gradient d'intensité de fluorescence sous une lamelle.

2.12|Analyse quantitative de l'anneau HIF

2.12.1|Site de l'anneau HIF

Nous avons mesuré la distance des anneaux HIF et des zones positives au pimonidazole à partir des bords de la lamelle en utilisant ImageJ, comme suit. Les aires des cercles extérieur et intérieur de l'anneau HIF et du cercle positif au pimonidazole ont été déterminées, et le rayon de chaque cercle a été calculé. Chaque valeur a été soustraite de 7,5 mm, qui est le rayon d'une lamelle de 15 mm, pour calculer sa distance à partir d'un bord de lamelle. Trois expériences indépendantes d'ICC de HIF dans chaque condition ont été réalisées.

2.12.2|Définition de l'anneau HIF

Nous avons utilisé des images fluorescentes obtenues à partir d'un modèle de lamelle incubé sous normoxie et pH neutre. Nous avons défini le site de l'anneau HIF et son extérieur et son intérieur comme une échelle de 2,5–3.0 (0.22–0.45 mm), 0.5 –1.0 échelle (1,12– 1,35 mm) et 5.0–5,5 échelle (2,24–2,47 mm) à partir d'un bord de lamelle, respectivement, à l'aide d'ImageJ. Nous avons mesuré cinq sites de signaux HIF-1 par échantillon et calculé la moyenne. Trois expériences indépendantes d'ICC de HIF ont été réalisées.

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2.13|Mesure de la pression d'oxygène par image PLIM

2.13.1|Construction d'une ligne d'étalonnage pour mesurer la pression d'oxygène

Une courbe d'étalonnage des cellules HK-2 a été réalisée, sur la base de la méthode décrite dans notre rapport précédent (Yoshihara et al., 2015). Des cellules HK-2 chargées de 500 nM de BTPDM1 pendant 30 min ont été cultivées dans un incubateur multigaz à concentration en oxygène variable équipé d'un microscope à fluorescence inversé connecté au système de mesure de la durée de vie. Une ligne d'étalonnage basée sur des analyses de Stern-Volmer a été construite en utilisant la durée de vie de phosphorescence (PL) des cellules HK-2 sous plusieurs tensions d'oxygène différentes en utilisant

Équation (1)

où τp représente le PL en pO2, τ0 représente le PL en désoxygénation, kq représente la constante de vitesse d'extinction et pO2 représente la pression partielle d'oxygène. En utilisant cette ligne d'étalonnage, la pression d'oxygène pourrait être calculée à partir du PL.

2.13.2|Image PLIM d'un modèle de lamelle

Des cellules HK-2 chargées avec 500 nM de BTPDM1 pendant 30 min ont été préparées. Un modèle de lamelle couvre-objet a été construit et cultivé dans un incubateur multigaz à concentration variable en O2 équipé d'un microscope à fluorescence inversé, connecté au système de mesure de la durée de vie.

Les images de microscopie d'imagerie à durée de vie de phosphorescence (PLIM) ont été enregistrées à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé équipé d'un système de balayage confocal (Hirakawa et al., 2018). Les images PLIM ont été obtenues après 30 minutes d'incubation dans 21 % d'O2 ou 4 % d'O2. Quatre images PLIM par échantillon, des régions supérieure, inférieure, gauche et droite près du bord de la lamelle, ont été prises pour déterminer le PL moyen, en tenant compte de la variation des PL dans une lamelle.

2.13.3|Identification de l'anneau HIF dans une image PLIM

Le pimonidazole était positif en dessous de 10 mmHg de pression d'oxygène. L'équivalent PL de 10 mmHg de pression d'oxygène était de 4034,6 ns, selon la ligne d'étalonnage, de sorte que la ligne extérieure du cercle de pimonidazole dans l'image PLIM pouvait être identifiée. Par la suite, les sites des anneaux HIF externes et internes dans l'image PLIM ont pu être trouvés en utilisant une analyse quantitative à distance. Nous avons mesuré la plage de PL moyens équivalents à l'anneau HIF dans 21 % d'O2 et 4 % d'O2.

2.13.4|Mesure de la pression d'oxygène de l'anneau HIF

Nous avons calculé la plage de pressions d'oxygène de l'anneau HIF à partir des PL, en utilisant la ligne d'étalonnage. Les images PLIM ont été analysées à l'aide de SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|analyses statistiques

Le test de Dunnett a été utilisé pour comparer les groupes expérimentaux et témoins, et les valeurs < 0,05="" ont="" été="" considérées="" comme="" indiquant="" des="" différences="" statistiquement="" significatives.="" les="" tests="" t="" de="" student="" ont="" été="" utilisés="" pour="" comparer="" trois="" groupes="" ou="" plus,="" et="" la="" valeur="" p="" ajustée="" de="" bonferroni="" a="" été="" appliquée.="" toutes="" les="" analyses="" statistiques="" ont="" été="" effectuées="" à="" l'aide="" de="" jmp="" pro="" version="" 13.2.1="" (sas).="" les="" valeurs="" ont="" été="" supposées="" être="" dérivées="" d'une="" population="" normalement="" distribuée="" et="" sont="" présentées="" sous="" forme="" de="" moyenne="" ±="" écart="" type="">

qu'est-ce qu'un cistanche

3|RÉSULTATS

3.1|Formation de gradient d'oxygène dans le modèle d'hypoperfusion

Nous avons confirmé l'existence d'un gradient d'oxygène dans le modèle d'hypoperfusion induit par le placement de lamelle en évaluant directement la tension d'oxygène, à l'aide de la phosphorescence. La mesure de l'intensité de la phosphorescence peut prédire une tendance approximative de la pression d'oxygène (Hirakawa et al., 2015 ; Yoshihara et al., 2015). Nous avons observé l'intensité de la phosphorescence d'un modèle de lamelle de cellules HK-2 traitées avec BTPDM1. Les images de l'intensité de la phosphorescence ont montré une hypoxie dans la majeure partie de la zone à l'intérieur de la lamelle, mais pas d'hypoxie près du bord, une observation qui suggérait l'existence d'un gradient d'oxygène autour du bord de la lamelle dans les cellules HK-2 recouvertes d'un lamelle (Figure 1a). Étant donné que l'intensité de la phosphorescence dépend de la concentration de la sonde et du temps d'excitation, une mesure de la durée de vie de la phosphorescence (PL) est utile pour l'analyse quantitative de la pression d'oxygène (Yoshihara et al., 2015). Ainsi, pour la mesure quantitative de la tension en oxygène des cellules cultivées autour du bord d'une lamelle, nous avons obtenu des images PLIM de cellules HK-2 recouvertes d'une lamelle pendant 30 min (Figure 1b). PL étendu à mesure que la distance du bord de la lamelle augmentait. Nous avons confirmé que la tension d'oxygène, calculée à l'aide d'une ligne d'étalonnage (figure S3), diminuait à mesure que la distance par rapport au bord de la lamelle augmentait, ce qui prouve l'existence d'un gradient d'oxygène autour du bord de la lamelle (figure 1c). L'examen du profil temporel de l'intensité de la phosphorescence a indiqué que le gradient d'oxygène a commencé à se former 10 min après la mise en place de la lamelle

(Figure 1d).

3.2|Distribution HIF-1 unique dans le modèle d'hypoperfusion, "anneau HIF"

Nous avons examiné la distribution HIF-1 dans le modèle d'hypoperfusion avec un gradient d'oxygène. L'ICC de HIF-1 dans les cellules HK-2 a montré une amélioration en forme de beignet sur le bord de la zone positive au pimonidazole, que nous avons appelée "l'anneau HIF" (Figure 2a). L'intensité du signal HIF -1 était significativement plus élevée sur l'anneau HIF que dans ses zones intérieures ou extérieures (Figure 2b). Ce phénomène a été confirmé à l'aide de l'ICC avec un autre anticorps HIF-1 (Figure S4a) ou d'autres lignées cellulaires tubulaires (Figure S4b,c). Nous avons également effectué une analyse ICC du HIF-1 dans d'autres types de cellules en culture, telles que les cellules cancéreuses du col de l'utérus HeLa. Bien que la faible adhérence de ces cellules à une lamelle couvre-objet ait rendu difficile une évaluation détaillée de la distribution de HIF-1, nous avons observé une amélioration en forme de beignet de HIF-1 dans les cellules HeLa (Figure S4d).

L'anneau HIF et la zone positive au pimonidazole ont commencé à se former plusieurs heures après le placement de la lamelle, et l'anneau HIF est apparu statique au bout de 3 h (Figure 2c). Le renversement HIF-1 a entraîné la disparition du signal HIF-1 , y compris l'anneau HIF (Figure 2d, Figure S4e), indiquant que l'anneau HIF dépendait de HIF-1 .

Pour étudier la possibilité que la formation de l'anneau HIF dépende de l'oxygène, nous avons étudié la distribution de HIF -1 dans le modèle de lamelle couvre-objet sous incubation avec différentes tensions d'oxygène. Nous avons placé un plat dans des chambres hypoxiques avec différentes tensions d'oxygène immédiatement après avoir fait un modèle de lamelle. Au cours de l'incubation hypoxique, nous avons observé que l'anneau HIF et la zone positive au pimonidazole semblaient s'étendre vers l'extérieur (figure 3a). Nous avons mesuré la distance de chaque anneau HIF et zone positive au pimonidazole à partir d'un bord de lamelle couvre-objet sous normoxie, 4 % d'O2 et 1 % d'incubation d'O2. L'anneau HIF et la zone positive au pimonidazole se sont étendus vers l'extérieur à mesure que la tension d'oxygène environnante diminuait (Figure 3b). Ces résultats ont indiqué que l'anneau HIF dépendait de HIF -1 et de la tension d'oxygène.

Afin de confirmer que l'accumulation en forme de beignet est un phénomène spécifique de HIF, nous avons effectué ICC avec des gènes de ménage dans le modèle de lamelle. Les signaux GAPDH et actine ont été maintenus sur toute la surface d'une lamelle et étaient comparables entre la région de l'anneau HIF et les autres régions (Figure S5a, b).

3.3|Mesure de la plage de pression d'oxygène de l'anneau HIF

Nous avons confirmé l'amélioration en forme d'anneau de l'accumulation de HIF-1 dans les cellules en culture recouvertes d'une lamelle, un phénomène dépendant de la tension en oxygène. Pour déterminer la plage de tension d'oxygène impliquée, nous avons analysé la pression d'oxygène de l'anneau HIF à l'aide d'une technique de durée de vie de phosphorescence. Nous avons obtenu des images PLIM du modèle de lamelle couvre-objet après 30 min d'incubation dans 21 % d'O2 ou 4 % d'O2 (Figure 4a). L'anneau HIF s'est formé sur le bord du cercle de pimonidazole dans l'ICC de HIF (Figure 3b). Nous avons identifié le site dans l'image PLIM qui était équivalent à la zone positive au pimonidazole dans l'ICC de HIF et ensuite identifié le site correspondant à l'anneau HIF (Figure 4b), en utilisant une analyse quantitative des données de distance entre l'anneau HIF et le zone positive au pimonidazole (Figure 3b). Nous avons également mesuré la plage de PL de l'anneau HIF, puis utilisé une ligne d'étalonnage (Figure S3) pour calculer la pression d'oxygène de l'anneau HIF dans 21 % d'O2 (4,20 [3,46–4,97] ~ 35,9 [28,5–44,9] mmHg) , et 4 % d'O2 (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] mmHg) (Figure 4c).

3.4|Accumulation de HIF-1 sous tension d'oxygène homogène

Alors que les signaux faibles de HIF-1 à l'extérieur de l'anneau HIF dans un modèle de lamelle peuvent être attribués à une hypoxie insuffisante, ceux à l'intérieur de l'anneau, où HIF-1 aurait dû être plus fortement activés par la tension d'oxygène plus faible, doivent être contrôlé par un phénomène indépendant de l'oxygène. Pour examiner les phénomènes qui provoquent une absence d'accumulation maximale de HIF-1 dans la zone anoxique survenant uniquement dans le modèle d'hypoperfusion, nous avons examiné s'il existait une relation inverse entre la tension en oxygène et l'accumulation de HIF-1 sous incubation avec une tension d'oxygène homogène. L'analyse Western blot des lysats cellulaires sous différentes tensions d'oxygène homogènes a montré une augmentation de l'accumulation de HIF -1 pendant l'incubation anoxique (figure 5a). Le dosage du rapporteur HRE-luciférase a également indiqué que l'accumulation de HIF -1 était augmentée avec une tension d'oxygène plus faible dans des conditions de tension d'oxygène homogène (Figure 5b). Ces résultats ont indiqué que l'accumulation de HIF -1 était dépendante de la tension d'oxygène, l'accumulation maximale étant observée dans la plage anoxique. Les caractéristiques du HIF-1 doivent varier entre un modèle d'hypoperfusion et un modèle avec une tension d'oxygène homogène. Nous avons émis l'hypothèse que le phénomène unique d'accumulation de HIF -1 dans ce modèle d'hypoperfusion pourrait être déterminé par un facteur autre que la tension en oxygène.

3.5|La formation de l'anneau HIF était indépendante du doctorat

Nous avons examiné si la dégradation HIF-1, un mécanisme possible de formation de l'anneau HIF, était régulée positivement à l'intérieur de l'anneau HIF. Cette idée semblait invalide, car l'hydroxylation par Ph.D., un processus limitant la vitesse de dégradation du HIF, nécessite de l'oxygène comme substrat. Le chlorure de cobalt est largement utilisé comme stabilisant chimique HIF. Nous avons construit un modèle de lamelle de cellules HK-2 traitées avec du chlorure de cobalt et effectué une analyse ICC de HIF. Le signal HIF-1 n'a pas augmenté à l'intérieur de l'anneau HIF, ce qui est devenu flou en raison de l'augmentation du signal HIF-1 à l'extérieur de l'anneau (Figure 6c). L'ICC des cellules HK -2 avec knockdown de PHD2, qui serait la principale prolyl hydroxylase HIF dans les expériences de culture cellulaire (Strowitzki et al., 2019), a produit des résultats similaires (Figure S6). Ces résultats ont indiqué que l'axe PHD-VHL de la dégradation du HIF n'était pas lié à la formation de l'anneau HIF.

3.6|Impact du pH sur l'accumulation de HIF-1

Un rapport précédent décrivait l'utilisation d'un modèle de lamelle de myocytes cardiaques présentant une baisse de pH à l'intérieur de la lamelle (Pitts & Toombs, 2004). Nous avons étudié le pH sous une lamelle et son impact sur la formation de l'anneau HIF. Nous avons traité des cellules HK-2 avec un indicateur de pH intracellulaire dont l'intensité de fluorescence permet l'évaluation du pH dans les cellules. L'imagerie en direct a montré que le pH diminuait sur la majeure partie de la zone intérieure, mais pas près du bord de la lamelle, suggérant l'existence d'un gradient de pH autour du bord dans le modèle de lamelle (figure 6a). L'analyse quantitative de la corrélation entre l'intensité de la fluorescence et la distance d'un bord de lamelle a montré que la première était élevée à mesure que la distance augmentait, une observation qui étayait l'existence de gradients de pH et d'oxygène autour du bord de la lamelle (Figure 6b). L'analyse Western blot des lysats cellulaires sous des concentrations d'oxygène homogènes a révélé que l'incubation avec un milieu à pH 5,0 supprimait l'accumulation de HIF -1 dans des conditions hypoxiques (Figure S7a – d). Nous avons également confirmé que l'accumulation de HIF-1 sous hypoxie dans différentes conditions de pH diminuait en dessous de pH 6,0 (Figure S8a–c).

Un rapport a souligné l'importance des conditions légèrement acides, à un pH d'environ 6.0. Selon cette étude, la réoxygénation après l'hypoxie a acidifié le milieu, ce qui a provoqué la séquestration nucléolaire du VHL. À son tour, la dégradation du HIF a été empêchée dans les myotubes C2C12, les neurones PC12 et les 786-0 cellules cancéreuses rénales (Mekhail et al., 2004). Dans notre étude, il n'y a pas eu de changement dans la distribution du VHL dans les cellules tubulaires entre les régions avec accumulation de HIF-1 et celles dans lesquelles il a été supprimé, dans un modèle de lamelle avec des valeurs de pH de 5.0 à 7,4 (Figures S9a–c). Les cellules tubulaires sont exposées à une large gamme de conditions de pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), nous avons donc étudié la variation de l'anneau HIF dans des milieux de pH différents. valeurs comprises entre 5,0 et 8,5. L'anneau HIF a été clairement observé dans les milieux à pH 8,5 et 7,4 (figure 6c). L'anneau HIF existait également à pH 6,5 mais était obscurci (Figure 6c). Le signal HIF-1 a été atténué dans toute la surface d'une lamelle à pH 5,0. (Figure 6c). Nous avons effectué une analyse quantitative plus poussée de la relation de position entre l'anneau HIF et le bord de la zone positive au pimonidazole (figure 7a) et découvert que la position de l'anneau variait en fonction du pH. Le cercle intérieur avait tendance à s'étendre vers l'extérieur à pH 6,5, par rapport à pH 7,4, tandis que le cercle extérieur rétrécissait de manière significative vers l'intérieur à pH 8,5, sur la base du bord de la zone positive au pimonidazole (Figure 7b, c). Nous avons également confirmé que les activités des gènes domestiques étaient maintenues dans un modèle de lamelle couvre-objet sous incubation acide (Figure S10). Par conséquent, le pH semble jouer un rôle important dans le mécanisme sous-jacent à la formation du cycle HIF.

4|DISCUSSION

Dans cette étude, nous avons identifié une distribution unique de HIF -1 dans les cellules tubulaires rénales, en utilisant un modèle d'hypoperfusion induite par le placement de lamelle. Nous avons constaté que la formation et le maintien de l'anneau HIF étaient régulés par la pression d'oxygène et le pH, qui existaient tous deux dans un gradient dans le bord de la lamelle d'un modèle de lamelle. Sur la base de ces résultats, nous proposons un mécanisme possible pour la formation de l'anneau HIF, impliquant l'accumulation de HIF -1 avec une tension d'oxygène décroissante, et l'accumulation étant supprimée en raison d'un pH bas à une certaine distance d'un bord de lamelle (Figure 8 ).

L'hypoperfusion est induite par la raréfaction de la microvascularisation dans l'IRC (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10 ; Nangaku, 2006). Dans nos travaux précédents, nous avons utilisé l'imagerie in vivo pour démontrer la présence d'un gradient d'oxygène dans les cellules tubulaires rénales de reins de souris normales (Hirakawa et al., 2018). On s'attend également à ce que la tension en oxygène soit hétérogène dans les cellules tubulaires de la MRC. Cependant, on ne sait pas si l'existence d'une hypoperfusion avec un gradient d'oxygène affecte le système de défense contre l'hypoxie, HIF. Dans cette étude, nous avons étudié la distribution HIF dans les cellules tubulaires proximales cultivées sous un modèle d'hypoperfusion et découvert que le gradient d'oxygène dans les cellules tubulaires rénales cultivées a été modélisé avec succès à l'aide d'une lamelle ronde en verre. Les preuves d'expériences utilisant une tension d'oxygène homogène ont indiqué que HIF -1 , dont l'hydroxylation et la dégradation ultérieure dépendent principalement de l'oxygène, s'accumule. C'est-à-dire que la quantité de HIF -1 augmente à mesure que la tension d'oxygène diminue. Dans notre modèle de lamelle, cependant, HIF -1 a été supprimé dans la zone anoxique et avait l'accumulation la plus élevée à une certaine distance d'un bord de lamelle. Cette accumulation de HIF en forme de beignet n'a jamais été montrée auparavant. Nous avons montré que le mouvement de l'anneau HIF pouvait être observé quelle que soit la tension en oxygène de l'atmosphère d'incubation, mais que son emplacement dépendait de la tension en oxygène. La plage de tension d'oxygène sur l'anneau HIF a été mesurée à environ 4–20 mmHg en utilisant PLIM avec BTPDM1. La plupart des études précédentes, qui portaient sur des cellules cultivées dans une atmosphère avec une tension d'oxygène homogène, ont montré que la quantité de protéine HIF-1 augmentait dans les plages hypoxiques ou anoxiques (Ameri et al., 2002 ; Carrera et al. , 2014). Ainsi, dans notre modèle, la formation de l'anneau HIF doit avoir été affectée par un facteur autre que la tension d'oxygène ; il était indépendant du doctorat, un processus limitant la vitesse de dégradation du HIF. Une percée dans l'élucidation du mécanisme de formation de l'anneau HIF a été notre découverte du rôle du gradient de pH, ainsi que du gradient d'oxygène, dans le modèle de la lèvre couvre-objet, qui limitait l'afflux du milieu similaire à une hypoperfusion in vivo maquette. Dans ce modèle d'hypoperfusion, le pH intracellulaire a diminué à mesure que la distance du bord de la lamelle augmentait, et un gradient de pH a été observé autour du bord de la lamelle. Nous avons montré que l'accumulation de HIF -1 était supprimée à un pH bas, autour de pH 5,0, par rapport à une incubation à environ pH neutre sous une tension d'oxygène homogène. Le bord extérieur de l'anneau HIF s'est étendu vers l'extérieur à pH 6,5 et le bord intérieur de l'anneau HIF s'est rétréci vers l'intérieur à pH 8,5, sur la base du bord de la zone positive au pimonidazole. L'anneau HIF a été obscurci dans des conditions acides et le signal HIF -1 a disparu à pH 5,0. Ainsi, nous avons élucidé l'importance du pH pour la formation de l'anneau HIF dans un modèle de lamelle. Nous avons démontré la possibilité que l'anneau HIF soit formé par la suppression de l'accumulation de HIF -1 par un pH bas à l'intérieur de l'anneau.

Plusieurs études antérieures utilisant la méthode de la lamelle ont utilisé des cellules cancéreuses. Selon un rapport utilisant la lignée cellulaire d'hépatome humain Hep3B, qui exprime le décalage vers le rouge dépendant de l'oxygène de la protéine fluorescente verte (AcGFP1), l'imagerie en direct de cellules recouvertes d'une lamelle rectangulaire a montré un décalage vers le rouge à mesure que la distance d'un bord de la lamelle augmentait (Takahashi & Sato, 2010). Le spectre d'émission des cellules d'hépatome est passé de la longueur d'onde de la fluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP) à celle du rouge lorsque la tension en oxygène a diminué. Dans une autre étude, la tension en oxygène des cellules SCC -7 avec une lamelle ronde de 15- mm a été mesurée à l'aide d'une technique de durée de vie de phosphorescence. La tension d'oxygène était de 6,9 ​​mmHg et 166 mmHg, calculée à partir de PL, qui était de 3,89 µs et 893 µs, 0–2 mm à l'intérieur et 0–1 mm à l'extérieur du bord de la lamelle, respectivement (Yoshihara et al., 2015). La méthode de la lamelle couvre-objet a également été utilisée avec des myocytes cardiaques, un système qui a attiré l'attention en tant que modèle prometteur d'ischémie-reperfusion in vivo. Kelly et al ont montré que les myocytes recouverts d'une lamelle ont subi des changements morphologiques marqués au fil du temps, accompagnés d'altérations du potentiel de la membrane mitochondriale et de la dynamique de la membrane plasmique, entraînant finalement la mort des myocytes. Ils ont également démontré que le pH intracellulaire des myocytes recouverts d'une lamelle chute rapidement jusqu'à environ pH 4 au centre d'une lamelle (Pitts & Toombs, 2004). Un modèle de lamelle, inhibant l'oxygène ou la diffusion nutritionnelle aux cellules cultivées sous une lamelle, peut imiter un modèle in vivo de zones ischémiques, normales et marginales au centre, à l'extérieur et au bord d'une lamelle respectivement. Plusieurs études ont utilisé ce modèle comme modèle d'ischémie-reperfusion de myocytes in vitro (Chun et al., 2015 ; Pitts et al., 2008 ; Solhjoo & O'Rourke, 2015 ; Wang et al., 2012). À notre connaissance, notre étude est la première à appliquer une méthode de lamelle couvre-objet aux cellules tubulaires. Dans notre système, la distance entre un bord de lamelle et une région équivalente à 10 mmHg de tension d'oxygène, où le pimonidazole devrait devenir positif, était de 1,22 mm, et la tension d'oxygène a diminué jusqu'à zéro à une distance de 2 mm du bord de la lamelle . Ce résultat peut être compatible avec les rapports précédents utilisant une lamelle d'environ 15 mm, démontrant l'existence d'un gradient d'oxygène au moins à 2 mm du bord (Akiyama et al., 2018 ; Yoshihara et al., 2015). Nous avons examiné le taux d'apoptose des cellules sous des lamelles (Figure S11) et découvert que la GAPDH et l'actine étaient maintenues même à l'intérieur de l'anneau HIF, indiquant que l'anneau HIF n'était pas causé uniquement par l'apoptose cellulaire ou la mort à l'intérieur de l'anneau HIF.

Plusieurs études ont mesuré la tension d'oxygène dans les reins en utilisant différentes méthodes. Quelques exemples de mesure de la tension en oxygène de reins normaux étaient les suivants : 50 mmHg et 30 mmHg dans le cortex et la moelle à l'aide de microélectrodes ; et 49 mmHg et 41 mmHg dans les segments S1 et S2 des cellules tubulaires du cortex en utilisant PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018 ; Zhang et al., 2014). La tension en oxygène des reins malades serait plus faible. Selon un précédent rapport utilisant des microélectrodes à oxygène, les rats diabétiques avaient une tension d'oxygène parenchymateuse rénale plus faible : 36 mmHg et 11 mmHg dans le cortex et la médulla respectivement (Heyman et al., 2013 ; Palm et al., 2003). Étant donné que les microélectrodes à oxygène mesurent la tension moyenne en oxygène du parenchyme, une plage plus large est attendue dans les reins malades. La tension d'oxygène intracellulaire a diminué à zéro mmHg dans un modèle de rein ischémique dont l'artère et la veine rénales latérales ont été clampées (Hirakawa et al., 2015). Compte tenu de ces résultats, la plage de tension d'oxygène sur l'anneau HIF, d'environ 4 à 20 mmHg, semblait plausible in vivo.

Nous avons en outre découvert que le pH affectait la formation du cycle HIF ainsi que la tension en oxygène. Étant donné que les cellules épithéliales tubulaires du rein sont continuellement exposées au liquide urinaire, le pH des cellules tubulaires devrait être affecté par celui de l'urine. Compte tenu de la large gamme de pH dans l'urine, nous avons décidé d'étudier les cellules incubées à une gamme de pH de 5.0–8.5. Il y a eu des études sur la gamme de pH dans les reins normaux. Une étude a révélé que le pH du cortex était de 7,39 ± 0.{{10}}8, et celui de la moelle était de 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, tel que mesuré à l'aide de microélectrodes (Burke et al., 1999). Une autre étude, utilisant l'imagerie du pH basée sur l'IRM, a montré des valeurs de pH de 7,3 ± 0.13 et 7.0 ± 0,29 respectivement (Raghunand et al., 2003). Il a été rapporté que le pH rénal a diminué de 6,5 à 6,32, et jusqu'à 5,83 dans un cas grave, dans un modèle murin d'IRC avec acidose (Pavuluri et al., 2019). Ces observations ont fourni la preuve d'une chute du pH et d'une variation de la CKD. Cependant, l'impact du pH sur le HIF-1 induit par l'hypoxie chronique dans l'IRC n'a pas été suffisamment bien étudié. Dans la présente étude, un déplacement de l'anneau HIF a été observé entre pH 6,5 et pH 7,4, une plage de pH plausible dans l'IRC. Ce résultat appuie l'hypothèse selon laquelle une légère diminution du pH affecte l'accumulation de HIF-1 dans la MRC. Sur la base des preuves d'une chute du pH en dessous de 6,0 dans les cas graves d'IRC, il est également nécessaire d'évaluer l'état physiologique du HIF -1 à un pH inférieur. Bien qu'il ait été rapporté qu'un environnement acide, même en normoxie, stabilise HIF -1, la plupart de ces rapports ont étudié des conditions d'acidité légère, au-dessus de pH 6,0 (Filatova et al., 2016 ; Mekhail et al., 2004) . Dans ce travail, nous avons montré la suppression de l'accumulation de HIF-1 dans les cellules tubulaires à pH 5,0 et l'atténuation des signaux HIF-1 dans un modèle de lamelle incubé à pH 5,0. Par conséquent, la diminution du pH rénal dans l'IRC in vivo pourrait être corrélée à une activation insuffisante du HIF, ainsi qu'à des toxines urémiques dans le rein hypoxique, aggravant la progression de l'IRC (Tanaka et al., 2013).

Notre étude a plusieurs limites. Premièrement, dans le domaine de l'hypoperfusion, les milieux de culture doivent être déficients en nutriments, en plus de la présence d'un manque d'oxygène et d'une diminution du pH. Cependant, il est difficile de délimiter les effets du pH, de la tension en oxygène et d'autres facteurs induits par l'hypoperfusion. Dans le corps, l'ischémie, hypoperfusion pathologique du sang causée par une combinaison de faible teneur en oxygène et de faible teneur en nutriments, se produit dans les organes et les cellules. Il est important de comprendre les différences entre la détection d'hypoxie et la détection d'ischémie. Malgré la difficulté d'élucider l'effet biologique de chaque facteur, notre modèle d'hypoperfusion est physiologiquement plausible, imitant l'état pathologique in vivo. Deuxièmement, la fabrication d'un modèle de lamelle couvre-objet nécessite des compétences et de la pratique, car la majorité des cellules se sont parfois détachées lors du retrait d'une lamelle, en particulier lors de l'utilisation de la méthode traditionnelle (Figure S2a). Ce problème dépendait de la lignée cellulaire utilisée. Par exemple, il nous était difficile d'appliquer un modèle de lamelle aux cellules HEK 293 car leur adhérence à une lamelle était relativement faible. Troisièmement, il était souhaitable de minimiser les dommages aux cellules cultivées sous une lamelle. Le nombre de cellules endommagées augmentait à mesure que la période pendant laquelle elles étaient recouvertes augmentait, comme le montre l'analyse de l'apoptose. Nous avons déterminé que 3 h étaient appropriées pour estimer l'anneau HIF lorsqu'il semblait être statique, et environ 10 % des cellules sont devenues apoptotiques (Figure S11). La quatrième limitation était la difficulté d'attacher des cellules cultivées à une lamelle de manière uniforme dans chaque échantillon (Figure S2b, c). La différence d'attachement entre une méthode traditionnelle et une méthode alternative de fabrication d'un modèle de lamelle couvre-objet pourrait également avoir affecté l'étude. Nous avons mesuré la plage de tension d'oxygène équivalente à l'anneau HIF par une technique de durée de vie de phosphorescence, dans laquelle nous avons créé un modèle de lamelle en utilisant une méthode traditionnelle. Étant donné que l'anneau HIF au cours de l'immunocytochimie a été visualisé à l'aide d'une méthode alternative, la véritable tension d'oxygène pourrait être différente. Nous avons minimisé ces erreurs en utilisant la preuve que le pimonidazole était positif à 10 mmHg ou moins de la tension d'oxygène. La cinquième limitation est que le pH intracellulaire n'est pas nécessairement le même que le pH du milieu de culture. Plusieurs rapports antérieurs ont montré que le pH intracellulaire est compatible avec le pH moyen dans une certaine mesure dans les cellules en culture (Michl et al., 2019), nous ne pouvions évaluer que la tendance du pH intracellulaire en modifiant le pH moyen. In vivo, la relation entre le pH des régions intracellulaires et extracellulaires, telles que l'urine ou les fluides corporels, est plus compliquée que dans les cellules cultivées. Ainsi, d'autres études sur la manière dont le changement de pH régule l'accumulation de la protéine HIF -1 in vivo seront nécessaires à l'avenir.

Bénéfice Cistanche : améliorer un reinfonction

Une autre limitation est que le pH devrait avoir un effet sur le marqueur de l'hypoxie, le pimonidazole. Nous avons comparé la distance entre le bord de la zone positive au pimonidazole et le centre d'une lamelle dans différentes conditions de pH dans notre modèle de lamelle. Le bord de la zone positive au pimonidazole était comparable entre pH 6, 5, 7, 4 et 8, 5 (Figure S12a, b). Une étude précédente a également démontré le maintien de la liaison du pimonidazole à différentes valeurs de pH (Kleiter et al., 2006). Sur la base de ces preuves, nous avons conclu que le pimonidazole est un marqueur d'hypoxie approprié pour nos expériences de lamelle couvre-objet. La dernière limitation est que, compte tenu d'une plage de tension d'oxygène comprise entre environ 4 mmHg et 20 mmHg (0,52 % O2 à 2,6 % O2) de l'anneau HIF, les porphyrines Pt(II) et Pd(II), qui sont largement utilisées comme agents biologiques. les sondes à oxygène, présentent des avantages pour mesurer de très faibles concentrations d'oxygène en raison de leurs durées de vie de phosphorescence nettement plus longues par rapport à celles utilisant des complexes Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). Cependant, en général, une mesure quantitative de l'oxygène basée sur la phosphorescence, calculée à l'aide de l'équation de Stern-Volmer, a de meilleures performances à de faibles plages d'O2 (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Plusieurs études antérieures ont démontré la mesure basée sur le complexe Ir(III) des tensions d'oxygène aussi basses qu'environ 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Par conséquent, nous pensons que la plage de tension d'oxygène de l'anneau HIF devrait être un résultat précis.

5|CONCLUSION

En résumé, nous avons constaté que la compréhension des rôles de l'oxygène et du pH est essentielle pour comprendre l'état physiologique HIF-1 dans l'IRC, et peut être acquise en étudiant les cellules tubulaires avec hypoperfusion. Le modèle de lamelle couvre-objet, avec ses limitations de l'afflux de milieu, était un bon modèle d'hypoperfusion in vivo, en particulier dans les tubules de l'IRC, car la raréfaction des capillaires péritubulaires est une caractéristique majeure de l'IRC (Mimura & Nangaku, 2010 ; Nangaku, 2006). Ce modèle d'hypoperfusion peut également imiter les gradients d'oxygène et de pH in vivo, tels que les tumeurs et les lésions ischémiques. Le modèle fournit une approche prometteuse pour l'élucidation de ces mécanismes biologiques.

CONFLIT D'INTÉRÊT

Tous les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à déclarer.

CONTRIBUTIONS DES AUTEURS

Tous les auteurs ont contribué à la formation du concept global. TH a réalisé l'ensemble des expériences. TH et YH ont analysé les résultats et ont fait les chiffres. TH a écrit le manuscrit original. KM, TY et ST ont réalisé l'expérience en utilisant une technique de durée de vie de phosphorescence et ont édité la partie du manuscrit. YH, TT et MN ont édité l'ensemble du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

RÉFÉRENCE

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