Une nouvelle stratégie de dépistage des composants actifs dans Cistanche Tubulosa basée sur l'analyse de la relation spectre-effet et la pharmacologie de réseau Ⅱ

3. Résultats et discussion

3.1. Empreintes digitales HPLC

3.1.1. Validation de la méthode

La validation de la méthode HPLC a montré que l'écart type relatif (RSD) pour la précision, la reproductibilité et la stabilité de la méthode était inférieur à 2,85 % pour la zone de pic relative (n = 11) et 0,77 %. pour le temps de rétention relatif (n = 11). La précision de la même solution d'échantillon est apparue dans la plage de 0.05–{{10}}.77 % pour le temps relatif et 0.28– 2,70 % pour l'aire relative des pics communs. La reproductibilité de l'expérience était comprise entre 0.03–0.20 % pour le temps relatif et 0,23-2,59 % pour l'aire relative des pics communs. La stabilité de l'échantillon était de 0,09 à 0,24 % pour le temps de rétention relatif et de 0,75 à 2,85 % pour la surface relative des pics communs. Ces résultats ont indiqué que l'empreinte digitale établie était satisfaite. Les relations linéaires pour l'acide géniposidique,échinacoside, actéoside, tubuloside A, etisoacteosidesont présentés dans le tableau S4. La valeur de R au carré était de 1.0000, indiquant une bonne linéarité. Les résultats de la récupération des échantillons ont montré que les récupérations moyennes de l'acide géniposidique, de l'échinacoside,actéoside, tubuloside A, etisoacteosideétaient de 100,37 % , 103,59 % , 98,46 % , 100,81 % et 101,19 % , et le RSD pour les récupérations d' échantillons était inférieur à 2,68 % .

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3.1.2. Surface de pic (PA) et temps de rétention relatif (RRT)

Les empreintes digitales de référence et les empreintes digitales des HM, WE et HR de 11 lots de C. tubulosa sont présentées à la figure 2. Onze pics, qui présentaient une bonne séparation et résolution, ont été identifiés comme des pics communs parmi les HM, WE et HR. Les cinq composés standards ont été identifiés comme étant l'acide géniposidique (A2),échinacoside(A8),actéoside (A9), tubulosideA (A10), etisoacteoside(A11). Le composé standard,échinacoside, qui était présent dans tous les chromatogrammes (temps de rétention moyen 12,86 min) avec une surface de pic appropriée et une bonne stabilité, a été sélectionné comme pic de référence et utilisé pour calculer les temps de rétention relatifs (RRT) des dix autres sommets communs. Les RRT de ces différentes formes se situent dans la plage 0.16–1.51. Le PA et le coefficient de variance (pourcentage CV) de ces pics communs sont répertoriés dans les tableaux S5 à S7. D'après les données, les valeurs de pourcentage de CV pour l'AP sous diverses formes sont de 25,78 % -142,02 %, 23,36 % -150,38 % et 28,91 % -112,78 % pour les HM, les WE et les HR, respectivement. Ces résultats révèlent des différences significatives dans la concentration de chaqueCistanche tubulosacomposé parmi les différentes formes. Les empreintes digitales des HM, WE et HR sont présentées à la figure 3.

Figure 2 Empreintes HPLC d'échantillons standard

3.1.3. Contenu des HM, WE et HR

Cinq constituants standards deC. tubulosaont été mesurés. Le contenu des principaux composants est présenté dans le tableau 1. La comparaison entre les HM, les WE et les HR est présentée dans le tableau 2 et la figure 4. Les PhG de C. tubulosa sont biologiquement actifs mais thermosensibles. Les composants thermosensibles se dissolvant dans l'eau peuvent être efficacement extraits en utilisant une méthode raisonnable. Généralement, Cistanche herba est extrait avec de l'eau puis évaporé dans une solution concentrée pour l'analyse chimique suivante [26, 27, 30]. Après extraction et concentration, la technologie de séchage par pulvérisation a été utilisée et la procédure a été modifiée par rapport à l'article précédent. L'eau a été rapidement éliminée de la vapeur liquide, puis des extraits secs de matières premières de plantes ont été obtenus. Dans cette étape, l'ajout de maltodextrine est considéré comme un support commun pour améliorer la dispersion et prolonger le temps de stockage. Grâce à une série de processus de fabrication, les plantes à base de plantes ont ensuite été pressées en granulés de formule avec des additifs. Cette étape d'ajout d'excipients n'a pas été incluse dans l'expérience. D'une manière générale, notre processus de production comprend l'extraction, la concentration et le séchage par atomisation, comme décrit dans la section 2.2, en parallèle avec un processus de production de granulés de formule. Afin de produire ces produits semi-finis, les trois étapes ci-dessus doivent être suivies. La procédure de formation des WE implique une concentration et un séchage par pulvérisation, ce qui entraîne facilement la perte de composants thermosensibles, mais les HR sont obtenus après extraction et séchage des HM. Nous nous demandons s'il est possible que des composants actifs restent dans les HR. Selon nos résultats, la teneur en verbascoside a considérablement diminué des HM aux WE et HR ( et , respectivement). La stabilité thermique du verbascoside est étudiée en surveillant les changements dans la surface du pic par HPLC pendant le processus de chauffage. Après chauffage pendant 4 h, il reste 41,6 % de verbascoside. Il indique que le verbascoside est thermosensible [31]. L'isoacteoside, le tubuloside A et l'échinacoside dans les WE sont restés stables après des procédures de traitement complexes. Au cours du processus de séchage à long terme, l'accumulation de PhG a montré une diminution significative, ce qui pourrait être attribué à la dégradation thermique de ces composants thermosensibles [32]. En ce qui concerne les autres composants cibles, les HR et les WE ne différaient pas significativement, sauf pour le verbascoside. Notre compréhension de cette différence nous permettra de développer à l'avenir de meilleures normes de qualité pour les restes d'herbes et de les transformer en produits.

Tableau 1 Contenu de 11 lots de C. tubulosa

Tableau 2 Comparaison du contenu des composants principaux (n = 11).

,

Figure 4 Détermination du contenu de cinq composants de différentes formes (n = 11). , ns : non significatif.

3.1.4. Analyse de similarité d'empreintes digitales

Les similitudes entre les trois groupes de C. tubulosa ont été évaluées. Les valeurs de similarité matière végétale-extrait aqueux, matière végétale-résidu végétal et extrait aqueux-résidu végétal se situaient dans les plages 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995 et 0.938–1.000, respectivement (tableau 3).

Tableau 3 Similitudes de HM-WE, HM-HR et WE-HR pour 11 lots de C. tubulosa.

3.2. Résultats des tests d'activité antioxydante

Les activités antioxydantes des différentes formes de C. tubulosa ont été déterminées à l'aide des tests DPPH, et de capacité de piégeage, et les résultats pertinents sont présentés à la figure 5. Dans le tableau S8, les plages de DPPH et les résultats des tests de capacité de piégeage étaient { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 et 0,32–27,65 mg/mL pour les trois formes différentes parmi les 11 lots de C. tubulosa. Dans trois tests d'activité antioxydante, les HM et les WE ont montré une activité d'inhibition étroite, tandis que les HR ont montré l'inhibition la plus faible.

Les WE séchés par pulvérisation se sont avérés présenter des activités significatives même à de faibles concentrations. Un rapport précédent indiquait qu'un Vernonia amygdalina WE séché par pulvérisation obtenait 50 pour cent d'inhibition de piégeage à 0,17 mg/mL [33]. L'application de temps d'extraction longs et de températures élevées est une épée à double tranchant. D'une part, l'augmentation du temps d'extraction et de la température d'entrée du séchage par atomisation améliore le rendement et l'efficacité. De plus, les extraits atteignent une forte activité antioxydante et des concentrations plus élevées de composants biologiques que ces plantes [34]. D'autre part, un air d'admission trop chaud dégrade les composés bioactifs. Ces températures d'entrée d'air élevées ont entraîné des pertes d'activité antioxydante de l'extrait de Bidens pilosa et ont été attribuées à des diminutions des composés phénoliques [35]. Les résultats actuels sont cohérents avec le rapport susmentionné. Par exemple, le WE dans S6 présentait des capacités d'inhibition radicalaire plus faibles que HM et HR. De plus, HR dans S5 présentait des capacités de piégeage des anions DPPH et superoxyde plus fortes que HM et WE. La structure des PhG est constituée de liaisons glycosidiques et de groupes acétyle qui sont facilement hydrolysés sous action enzymatique ou décomposés à haute température. Ces réactions peuvent expliquer les diminutions de certains composants principaux lors d'une production à grande échelle. Cependant, l'hydrolyse ou l'isomérisation de certains composants pourrait accélérer la synthèse d'autres composants. De telles transformations sont courantes lors du traitement des herbes Cistanches [36–38]. Le fait que les PhG soient solubles dans l'eau implique que la plupart des composants biologiques peuvent être utilisés via l'extraction de l'eau. L'affirmation selon laquelle la majorité des composants actifs restent dans les WE persiste depuis des décennies, il semble donc raisonnable de supposer que les matières résiduelles humides peuvent être jetées après l'extraction. Cependant, il est incorrect de considérer les HR de C. tubulosa comme des déchets. Les chercheurs soulignent que les PhG sont instables et qu'ils sont sensibles à la dégradation enzymatique ou hydrolytique [39]. Les réactions d'hydrolyse ou d'isomérisation qui contribuent à la diminution des ingrédients biologiques dans les phytomédicaments pendant le traitement pourraient en même temps présenter de nouvelles opportunités pour exploiter les ressources humaines. En convertissant les méthodes d'extraction traditionnelles, les résidus médicinaux peuvent être développés et utilisés plus efficacement. Une hydrolyse enzymatique a été réalisée pour convertir le résidu de Panax ginseng en mono sucres. Les rendements en polysaccharides et en ginsénosides ont augmenté, tels que le sucre, l'acide succinique, les polysaccharides de ginseng et les ginsénosides [40]. Les résidus de Sophora flavescens sont réextraits par ultrasons avec de l'acétate d'éthyle [41]. Les technologies mises à jour pour l'utilisation des résidus de plantes sont résumées par Huang et al. [42].

Sur la base des résultats PLSR et BCA, les cinq premiers pics de différentes formes ont été criblés à l'aide des tests de DPPH, d'anion superoxyde et de piégeage des radicaux hydroxyle pour identifier les pics les plus importants. Les résultats sont illustrés dans le diagramme de Venn (Figure 7). A2, A6, A8 et A10 sont les pics communs partagés par HM, WE et HR (figures 7 (a) et 7 (c)) dans les analyses de piégeage des anions superoxydes et des radicaux hydroxyles, alors que HM, WE et HR ne partage aucun pic de dosage DPPH. Pendant ce temps, les modèles BCA montrent que A1, A2, A3 et A6 sont les pics communs partagés par HM, WE et HR (Figures 7(d)–7(f)). Notamment, les chevauchements dans le diagramme de Venn indiquent que le modèle BCA apparaît plus adapté que le modèle PLSR, le premier présentant plus de répétitions. Les coefficients du modèle BCA et les valeurs IC50 de la capacité antioxydante ont été analysés via RDA. Comme le RDA illustré à la figure 8, A1, A3 et A6 de HM et HR sont liés positivement aux indices antioxydants, sauf que A3 est lié négativement à la capacité de piégeage des radicaux hydroxyles. A1 et A6 de WE ont de fortes corrélations avec DPPH et l'anion superoxyde. Les pics A6 notés à partir des différentes formes présentent la connexion la plus forte avec le DPPH, l'anion superoxyde et les radicaux hydroxyle. A1 et A3 présentent également une connexion similaire.

Figure 7

Diagrammes de Venn du modèle PLSR et BCA : (a) test DPPH. (b) essai de piégeage. (c) les tests de piégeage ont été analysés par le modèle PLSR. (d) Dosage DPPH. (e) essai de piégeage. (f) les tests de piégeage ont été analysés par le modèle BCA. La section qui se chevauchait était le fragment de pics commun par HM, WE et HR.

3.4. Analyse basée sur la pharmacologie du réseau

3.4.1. Construction du réseau CT

Un total de 4359 cibles liées à l'activité antioxydante ont été obtenues à partir de la base de données GeneCards et de la base de données OMIM. Dans le même temps, les composants actifs ont été criblés à partir de la base de données TCMSP et de la base de données SwissTargetPrediction. Ensuite, 198 cibles ont été collectées et standardisées via la base de données UniPort. Il y avait 159 gènes cibles partagés par les composants actifs et les maladies liées aux antioxydants (voir Figure S1). Le réseau CT a été construit pour illustrer la corrélation entre les composés et les cibles génétiques clés (Figure 9).

Figure 9 Réseau TC. Le réseau a montré la corrélation entre les composants actifs et les cibles génétiques clés.

3.4.2. Construction du réseau PPI et sélection des cibles clés

Le PPI a été visualisé à l'aide de la base de données STRING (Figure 10). Le réseau comprenait 159 nœuds et 2528 bords. Dans l'ensemble du réseau d'interaction, les composants de connexion ou les nœuds avec plus de points cibles peuvent être le composant clé ou le gène cible qui joue un rôle antioxydant dans C. tubulosa. Les résultats ont été téléchargés et introduits dans Cytoscape pour visualisation. Plus la valeur DC est élevée, plus la couleur est sombre et plus la valeur du score combiné est élevée, plus le bord est épais. Nous avons constaté que la RAC-alpha sérine/thréonine-protéine kinase (AKT1), l'interlukine -6 (IL6), le facteur de nécrose tumorale (TNF) et le facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGFA) étaient situés au centre (Figure 11), indiquant qu'ils étaient des cibles clés lorsque les composants actifs exerçaient un effet antioxydant. Il est rapporté que l'échinacoside réduit le dysfonctionnement mitochondrial via la régulation des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) et AKT et leurs formes phosphorylées [43]. Les chercheurs ont émis l'hypothèse que l'effet antidiabétique des glycosides de C. tubulosa pourrait être dû à l'activité antioxydante des PhG en régulant à la baisse les cytokines pro-inflammatoires, telles que l'IL-6 et le TNF- [44]. De plus, l'échinacoside pourrait altérer la croissance des cellules cancéreuses de l'ovaire en régulant à la baisse l'expression du VEGFA pour inhiber l'angiogenèse [45], qui est étroitement corrélé au système ROS car le ROS induit l'expression de la signalisation VEGF [46].

Figure 10 Réseau PPI.

3.4.3. Analyse de l'enrichissement et mise en place du réseau CTP

Les composés antioxydants potentiels ont agi sur de nombreuses fonctions biologiques, notamment BP, CC et MF. Sur la figure 12(a), les 10 voies principales sont représentées. Les cibles prédites du réseau PPI ont principalement répondu à de nombreux processus biologiques, tels que les composés cycliques organiques, les stimuli xénobiotiques, les substances inorganiques, les niveaux d'oxygène et la régulation positive du mouvement des composants cellulaires. L'analyse des composants cellulaires a montré que les gènes étaient principalement liés au radeau membranaire, à la matrice extracellulaire, à la lumière des granules sécrétoires, au complexe régulateur de transcription et à la partie apicale de la cellule. Ces cibles sont également impliquées dans de nombreuses fonctions moléculaires, notamment la liaison du facteur de transcription de liaison à l'ADN, l'activité d'homodimérisation des protéines, la liaison spécifique au domaine protéique et la liaison aux récepteurs de cytokines.

Figure 12 Analyse d'enrichissement : (a) Analyse d'enrichissement GO. (b) Analyse d'enrichissement KEGG.

Pour étudier les fonctions biologiques de ces hubs majeurs, une analyse d'enrichissement des voies a été réalisée. À partir des résultats de l'enrichissement KEGG, un diagramme à bulles a été dessiné pour montrer les 20 principales voies. Plus la tache était grande, plus il y avait de gènes inclus dans la voie. Comme le montre la figure 12 (b), les voies clés de C. tubulosa étaient liées aux voies du cancer, des lipides et de l'athérosclérose, à la voie de signalisation AGE-RAGE dans les complications du diabète, à l'activation des récepteurs de la carcinogenèse chimique et à la voie de signalisation MAPK. Les effets de C. tubulosa sur l'apoptose et l'homéostasie redox cellulaire ont été étudiés. Les données suggèrent que C. tubulosa peut être un candidat prometteur pour la thérapie anticancéreuse du côlon [47]. L'extrait de C. deserticola se trouve chez les personnes âgées [48].

La figure 13 illustre la corrélation entre les voies et leurs cibles associées et la relation entre les gènes cibles qui se chevauchent et les composants biologiquement actifs de C. tubulosa. Une vue globale du réseau CTP a été générée, composée de 12 ingrédients, 159 cibles et 20 voies. La plupart des cibles étaient partagées par les composés actifs candidats. Ces ingrédients actifs candidats avec des degrés d'interconnexion élevés étaient responsables de la forte interconnexion du réseau CTP, en particulier la quercétine (degré = 131). La majorité des cibles, telles que AKT1, IL6, TNF et VEGFA, ont été cartographiées sur les voies KEGG associées aux voies du cancer.

Figure 13 Réseau CTP.

4. Conclusions

Dans cette étude, nous avons principalement sondé des situations complexes lors de l'examen des relations spectre-effet entre HM, WE et HR deC. tubulosa. Les empreintes HPLC etdosages d'antioxydantsont été utilisés pour identifier les différences entre Hs, WEs et HRs deC. tubulosa. Selon les empreintes digitales HPLC, 11 pics étaient communs parmi les 11 lots de Hs, WEs et HRs. Acide géniposidique,échinacoside, verbascoside, tubuloside A, etisoacteosideont été identifiés parmi ces pics. Le contenu de ces cinq composants a été déterminé. De plus, les effets antioxydants de laC. tubulosaHs, WEs et HRs variaient en raison des altérations des compositions chimiques causées par des conditions de fabrication complexes. Basée sur des modèles statistiques diversifiés, l'étude de la relation spectre-effet a indiqué que le pic A6 pourrait être la composante la plus décisive parmi les trois formes deC. tubulosa. L'étude était basée sur la pharmacologie de réseau pour explorer les mécanismes potentiels deC. tubulosasurantioxydantgrâce au criblage de composés, à la prédiction de cibles clés, à la construction de réseaux et à la réalisation d'analyses d'enrichissement. Nos résultats fournissent une base théorique pour le recyclage des résidus de plantes et le potentiel deC. tubulosadans le traitement demaladies liées aux antioxydants.