Un rôle pour BATF3 dans la différenciation Tu9 et les pathologies L induites par les lymphocytes T MucOsal (Partie 2)

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DISCUSSION

Les cellules T#9 sont importantes pour le développement de maladies inflammatoires et allergiques. Cependant, le programme transcriptionnel et les déclencheurs inflammatoires qui entraînent la différenciation des cellules TH9 restent incomplètement compris. Dans cette étude, nous avons identifié la cytokine pro-inflammatoire TL1A comme un puissant inducteur de la différenciation du T -9 murin et humain et avons identifié BATF3 comme un important facteur de transcription impliqué dans la différenciation des cellules TH9. Le réseau transcriptionnel induit par TL1A comprenait les facteurs de transcription BATF et BATF3 et plusieurs gènes régulés par BATF (Figure 7 supplémentaire). In vivo, dans des expériences de transfert adoptif,Cellules Tμ9-TL1Aétaient hautement pro-inflammatoires entraînant une inflammation intestinale et pulmonaire. La propension pro-inflammatoire des cellules T-9-TL1A dépendait de la production d'IL-9. Les transferts de cellules Batf3-/T et 9-TL1A ont entraîné une réduction de l'inflammation des muqueuses et de l'expression des cytokines in vivo.

Bien que les cellules Tμ9 aient été identifiées comme un sous-ensemble distinct d'auxiliaires T, un facteur de transcription qui agit comme un régulateur principal ou identifie uniquement le phénotype TH9 n'a pas été identifié. Au lieu de cela, plusieurs facteurs de transcription agissent de concert pour réguler la différenciation des cellules T -9. Il a été démontré que BATF coopère fonctionnellement avec IRF4 et se lie à des éléments composites dans les régions promotrices des gènes réactifs. BATF avec IRF4 a été récemment proposé comme "facteurs pionniers" dans la différenciation des cellules Tp17 en contribuant à l'accessibilité initiale de la chromatine et en facilitant l'accès d'autres facteurs de transcription.36 } et IL-4 pour induire au maximum l'expression de BATF, particulièrement au début de la différenciation TH9. A l'appui de cette notion, la stimulation avec TL1A seul conduit à la liaison de BATF au promoteur II9 alors qu'elle n'a pas d'effet direct sur la liaison d'autres facteurs de transcription (IRF4 et BATF3). Cependant,TH9-TL1Ales conditions améliorent de manière synergique la liaison de BATF3 et IRF4, ainsi que l'acétylation de l'histone H3, une modification permissive de la chromatine qui est en corrélation avec l'activité du promoteur ll9.14 Conformément aux données publiées précédemment, BATF est nécessaire pour l'expression de IL-9 et IL-10 dans des conditions T,9.15 TL1A est au moins partiellement capable de surmonter l'exigence de BATF dans l'induction de IL-9 et IL-13 très probablement grâce à l'amélioration d'autres transcriptions. facteurs susceptibles de compenser la perte de BATF. Un candidat pour la compensation fonctionnelle est BATF3 qui est transcriptionnellement induit par TL1A. Il a été proposé que BATF et BATF3 sont fonctionnellement interchangeables pour le développement de Tu17 et Tp2 et la surexpression de BATF3 dans les cellules BATF-'- T peut restaurer la production d'IL-17 dans les cellules TH17 et IL-4 et IL{{ 23}} production dans les cellules T#2.18323738 Cependant, le rôle de BATF3 dans le développement des cellules Tu dans des conditions physiologiques et l'interaction potentielle entre BATF et BATF3 au cours de la différenciation TH9 n'ont pas été définis. Nous démontrons ici que TL1A facilite la liaison de BATF3 au promoteur ll9. En conséquence fonctionnelle, BATF3 contribue à la production d'IL-9 dans des conditions T-9, en particulier dans le contexte de la stimulation TL1A. Étonnamment, BATF3 est indispensable pour la différenciation précoce des cellules Tu9, mais pourrait être nécessaire pour stabiliser ou maintenir le phénotype TA9 et la sécrétion d'IL -9 à des moments ultérieurs. Nos conclusions sur le rôle de BATF3 dans la différenciation TH9 sont en contraste avec les rapports précédents selon lesquels BATF3 était indispensable pour la différenciation Tu1, TA2 et Tu17.2'3'Contrairement à BATF, BATF3 ne contribue qu'à la sécrétion d'IL-9 et pas à d'autres cytokines TH9 telles que IL-10 et IL-13, ce qui suggère que BATF3 se lie spécifiquement au promoteur ll9 et induit la sécrétion d'IL-9. D'autres études sont nécessaires pour déterminer les gènes cibles BATF3 supplémentaires au cours de la différenciation TH9 et son rôle dans d'autres sous-ensembles de Tu.

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Fig.7 Le déficit en Batf3 entraîne une réduction de l'inflammation des muqueuses provoquée par les cellules TH9-TL1A. Les cellules naïves WTor Batf3-/cellules ont été différenciées en cellules T_9-TL1A et injectées à des souris Rag1-7. a Taches H&E représentatives des poumons (panneaux supérieurs) et du gros intestin (panneaux inférieurs). Barre d'échelle : 200 mm. b Scores histologiques pour les poumons.c Nombre total de cellules (gauche, milieu), fréquence des lymphocytes T CD4* (droite). Les données représentent les moyennes ± SD.n=10/groupe.d Coloration intracellulaire de l'IL{{11} }, IL-13 et IL-17 de la rate, de la MLN et des poumons après restimulation ex vivo avec PMA plus lonomycine. Les données représentent les moyennes ± SD.n=5/groupe. Une expérience représentative parmi trois expériences indépendantes est présentée.*p<0.05,><0.01 as="" determined="" by="" student's="">

Bien que d'autres cytokines ou médiateurs pro-inflammatoires tels que IL-1, OX40 et TSLP aient été décrits pour améliorerDifférenciation TH9, TL1A semble être unique dans la régulation positive de BATF, ouvrant ainsi la chromatine pour le recrutement d'autres facteurs de transcription, y compris BATF3.353940 Nos données de séquençage d'ARN étayent cette conclusion identifiant un sous-ensemble de gènes dépendants de BATF significativement régulés positivement par TL1A. De plus, nos données de séquençage d'ARN révèlent que BATF3 régule l'activité des facteurs de transcription, la prolifération cellulaire et la transduction du signal intracellulaire suggérant un rôle important de BATF3 lors de la différenciation de T#9. In vivo, les cellules Batf3-'- TA9-TL1A ont entraîné une réduction de l'inflammation des muqueuses et de l'expression des cytokines. Nous n'avons pas observé d'altération de la migration des cellules Batf3-'- TH9-TL1A vers l'intestin, contrairement aux cellules BATF-'- CD4 plus T qui ne parviennent pas à réguler positivement les marqueurs de migration intestinale et ne peupler les intestins.4' Nos données confirment le rôle de BATF3 dans la fonction physiopathologique des cellules TA9-TL1A.

Les cellules IL-9 et TA9 ont été récemment associées à la pathogenèse des MII.*-10 IL-9 plus CD4 plus cellules T ont été enrichis chez les patients atteints de CU et de taux sériques élevés d'IL{{ 5}} en corrélation avec une maladie grave chez les patients atteints de MC.-10Dans un modèle expérimental de maladie de type UC induite par l'haptène, les souris déficientes en IL-9-et en PU.1-sont protégées contre les l'inflammation et les anticorps anti-IL-9 sont protecteurs dans un modèle de prévention chronique. degré Cependant, nous n'avons observé aucun effet de TL1A sur l'expression de PU.1 dans des conditions T9. Nous avons montré que la stimulation de TL1A entraîne une régulation positive de BATF et BATF3 mais pas de PU.1. Bien que PU.1 ait été décrit comme un régulateur principal de la différenciation TH9, il n'est requis que pour l'expression d'un sous-ensemble de gènes TH9 et de souris. suggérant que la liaison de PU.1 n'est pas modifiée dans l'indépendance complète de BATF de PU.1 et de BATF. 75

Nous démontrons que les cellules T,9-TL1A sont hautement pathogènes in vivo et induisent une inflammation intestinale et pulmonaire. Inflammation intestinale chezTH9-TL1Areceveurs était principalement confiné à l'intestin grêle. De plus, nous avons observé une augmentation du nombre de cellules CCR6* et CD103 chez les receveurs TH9-TL1A in vivo. Ces données démontrent de manière cohérente que le récepteur de chimiokine CCR6 et l'intégrine CD103 sont exprimés sur les cellules TH9 et facilitent la migration vers les sites inflammatoires et les surfaces muqueuses.15,42 L'augmentation du nombre de cellules CCR6 plus chez les receveurs Tμ9-TL1A in vivo est compatible avec notre observation de l'inflammation principalement de l'intestin grêle puisqu'il a été démontré que l'axe CCR6/CCL20 facilite spécifiquement la migration des cellules T,17 vers l'intestin grêle et il est plausible que des mécanismes similaires s'appliquent aux cellules Tμ9.3 Nos résultats sont également cohérents avec des découvertes récentes de taux sériques élevés d'IL-9 chez les patients atteints de MC, en particulier avec des maladies graves. ?

TL1A améliore la différenciation T, 1, TH2 et TA17 et bien que nous n'ayons vu aucune indication d'un changement global des cellules T9 vers d'autres sous-ensembles TH in vitro, cela pourrait suggérer que les cellules TH9 différenciées avec TL1A pourraient être instables in vivo et " trans -différencier" dans d'autres sous-ensembles. Le potentiel de trans-différenciation des cellules TH9 a été controversé et pourrait dépendre du contexte, du modèle de la maladie et du statut immunitaire de l'hôte. Dans l'EAE, la trans-différenciation de TH9 en cellules productrices d'IFN-Y se produit, cependant, le phénotype T,9 semble être stable dans les modèles de cancer.339 Étonnamment, les cellules T9-TL1A in vivo ont continué à produire de l'IL{ {18}} et des cytokines en aval telles que IL-17 et IL-13 et n'ont pas transdifférencié. Cette notion est également étayée par nos données montrant que le traitement anti-lL-9 seul est suffisant pour bloquer les effets pathogènes des cellules T9-TL1A. Le traitement par anticorps anti-Lil-9 seul a réduit la production d'IL-13 et atténué l'inflammation intestinale et pulmonaire à des niveaux de TH9. Le développement de l'inflammation pulmonaire allergique nécessite la corporation des cellules TH2 et TH9. Cependant, notre modèle d'inflammation pulmonaire chronique non allergique semble être principalement motivé par les cellules T.9 productrices d'IL-9-, bien que nous ne puissions pas exclure une contribution des cellules non T productrices d'IL-9- dans la pathogenèse de notre maquette.

En résumé, TL1A est un puissant inducteur de la différenciation T9 murine et humaine et nous avons élucidé les voies de signalisation impliquées. Compte tenu des propriétés pro-inflammatoires de la cellule TH9-TL1A in vivo, le ciblage de l'axe TL1A-BATF3-IL-9 pourrait être une approche thérapeutique prometteuse dans les pathologies induites par la T19- comme les MICI ou les maladies pulmonaires allergiques.

MÉTHODES

Souris C57BL/6, C57BL/6 Rag1-/, B6.SJL-Ptprc" Pepc/BoyJ(CD45.1),(B6.Cg-Nfkb1*m130l/J), Stat 6-/-(B6.129S2(C)-Stat6"miGr"/J), p50-/-B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/ (OT-I),Batrf/( Les souris B6.129s-Batm1.1kmm/) et Bat3-/(B6.129 S(C)-Batf3m1km"/) ont été achetées au Jackson Laboratory. Des souris Dr3-/-n ont été décrites ailleurs.4 Les souris ont été maintenues dans des conditions SPF. Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux du Cedars-Sinai Medical Center. Isolement et différenciation des lymphocytes T Des lymphocytes T naïfs (CD62LhichcD44'o"CD25~ ; clones MEL-14, IM7, PC61.5 ; eBioscience) ont été isolés de la rate et du MLN à l'aide du kit d'isolement EasySeptM Mouse CD4 plus (Stem Cell Technologies) suivi d'un tri cellulaire (MoFlo, Beckman Coulter). Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI -1640 (10 % de FBS) avec des anti-CD3 (145-2 C11 ; BD Biosciences), anti-CD28 (37,51 ; eBioscience) (conditions TH0) et TL1A murin (100 ng/ml ; R&D Systems) dans des conditions T-9 (TGF humain- 1 [3 ng/ml], Biolegend, IL{{66} } [20ng/ml, PeproTech).Après 2 jours, de l'IL-2(20 U/ml) a été ajoutée. Pour évaluer la prolifération cellulaire, les cellules triées ont été marquées avec de l'ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE ; Invitrogen), différenciées pendant 5 jours, et la dilution du CFSE a été évaluée par cytométrie en flux. Pour évaluer la différenciation spécifique de l'antigène T, 9, des lymphocytes T naïfs CD4 plus de souris OT-Il ont été stimulés pendant 3 jours avec 1 ug/ml d'OVA ; 23-339 peptide dans la présence d'APC syngéniques (rapport 1:3). e préparé par déplétion des cellules CD90.2T à partir de splénocytes (Stem Cell Technologies) suivie d'un traitement à la mitomycine C. isolement des lymphocytes T CD4 plus humains et différenciation Le sang a été prélevé sur des volontaires sains après consentement éclairé conformément aux procédures établies par le Cedars-Sinai Institutional Review Board (IRB # 3358, 2673). Des lymphocytes T CD4 plus naïfs (CD4 plus CD25-CD45RA plus CD45RO7) ont été isolés des PBMC à l'aide du kit d'enrichissement des cellules T CD4 humaines EasySepl (technologie des cellules souches), suivi d'un tri cellulaire. Les cellules ont été cultivées avec des anti-CD3 (5 ug/ml) et des anti-CD28 (2 ug/ml) avec du TL1A humain (100 ng/ml ; Fitzgerald) dans des conditions TH9 (TGF humain- 1 [5 ng/ml] , IL humaine-4 [10 ng/ml]). ELISA La concentration de cytokines dans les surnageants de culture a été dosée par ELISA pour l'IL-9 murin ou humain, l'IL-10 et l'IL-13(eBioscience). Coloration intracellulaire Les cellules ont été restimulées avec 50 ng/ml de PMA (phorbol 12-myristate 13-acétate), 500 ng/ml d'ionomycine et de monensine (eBioscience) pendant 4 h, colorées avec de l'anti-CD4 (RM{{ 117}},eBioscience),fixé et perméabilisé à l'aide du jeu de tampons de coloration FoxP3 (eBioscience), et coloré avec des anticorps contre l'IL murin-9 (RM9A4, BioLegend),IL-10(JES{{123} }E3),IL-13(13A),IL-17A (eBio17B7), IL-17F (eBio18F10),IFN-y(XMG1.2),IL{{136} } (BVD6-24G2),IL-22 (1H8PWSR),Ki67(SolA15),BATF(MBM7C7), IRF4 (3E4),IL humain-9(MH9A4, tous eBioscience), et BATF3(841792, R&D Systems). Les échantillons ont été analysés à l'aide d'un cytomètre en flux CyAnADP (Dako Cytomation) et du logiciel FlowJo (TreeStar Inc.).

RT-PCR quantitative

L'ARN total a été isolé à l'aide des kits RNeasy et transcrit en ADNc avec le kit Omniscript RT (tous deux Qiagen). La qPCR a été réalisée à l'aide du système Mastercycler" ep realplex² （Eppendorf). Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen) et les sondes et amorces TaqMan ont été utilisé pour Actb, I9, I10, 13 et BATF (IDT) (tableau supplémentaire 7). RT² SYBR"Green qPCR Mastermix (Qiagen) et des ensembles d'amorces ont été utilisés pour Actb et Batf3 (IDT). L'expression de l'ARNm des gènes cibles a été normalisée à l'expression de Actb. L'expression relative des gènes a été calculée par la méthode.

l'immunoprécipitation de la chromatine 2-AACt

Chloe a été réalisé à l'aide du kit d'immunoprécipitation de la chromatine EZ ChIP (Millipore) suivi d'une analyse qPCR. Au total, des cellules de 1 × 10 degrés ont été stimulées, fixées, soniquées et immunoprécipitées à l'aide de 2 ug d'anticorps de qualité ChIP : anti-BATF (sc-100974), anti-BATF3 (sc-162246), souris normale lgG(sc-2025), anti-IRF4(sc-6059), lgG de chèvre normale(sc-2028)(tous Santa Cruz Biotechnology), anti-acétyl-histone H3({{17 }}), et lgG de lapin normal (Milli-pore). L'ADN immunoprécipité a été réticulé en sens inverse, purifié à l'aide de colonnes de centrifugation et analysé par qPCR (séquences d'amorces : tableau supplémentaire 7). Pour quantifier l'ADN immunoprécipité, nous avons généré une courbe standard à partir de dilutions en série d'ADN d'entrée. Les données sont présentées sous forme de pourcentage d'ADN d'entrée basé sur la normalisation par rapport à la quantité d'ADN d'entrée.

Séquençage d'ARN (numéros d'accès GEO : GSE60362 et GSE106926)

ARN-Seg à faible entrée (TH9 vs TH9-TL1A) : le kit d'ARN à faible entrée SMARTer Ultra" de Clontech pour le séquençage v3 a été utilisé pour générer des bibliothèques d'ADNc double brin de 1,5 à 2,5 ng d'ARN total de chaque échantillon conformément aux recommandations du fabricant. Les bibliothèques d'ADNc double brin ont été individuellement fragmentées et ligaturées avec des adaptateurs de codes à barres lon Torrent lon Xpress" à l'aide du kit de bibliothèque de fragments lon Xpress" Plus avec des modifications limitées, y compris des bibliothèques finales sélectionnées en fonction de la taille avec un nettoyage à double bille et un volume V d'adaptateurs d'ions La concentration et la longueur des bibliothèques RNA-Seq ont été évaluées à l'aide du kit de test QubitdsDNA HS d'Invitrogen et d'AgilentKit ADN Haute Sensibilité, respectively. Samples were multiplexed to obtain >10 millions de lectures chacune pour le séquençage. Les bibliothèques regroupées ont été amplifiées sur lon Sphere" et séquencées à l'aide du lon PIM Sequencing 200 Kit v2, lon Torrent".

ARNm-Seg (WT vs.Baft3-7T,9-TL1A): Illumina TruSeq Stranded mRNA library preparation kit was employed for RNA-Seq. Of total RNA, 1 ug per sample was used for poly-A mRNA selection using streptavidin-coated magnetic beads. cDNA was synthesized from enriched and fragmented RNA using reverse transcriptase (Super-Script ll, Invitrogen) and random primers. The cDNA was converted into double-stranded DNA, and enriched with PCR for library preparation. The PCR-amplified library was purified using Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter). The concentration of the amplified library was measured with a NanoDrop spectrophotometer and on an Agilent 2100 Bioanalyzer. Samples were multiplexed to obtain >20 millions de lectures/échantillon et séquencé sur une plateforme NextSeq 500 (Illumina) en utilisant le séquençage à une extrémité de 75-bp.

L'analyse des données. Les lectures brutes ont été filtrées et coupées par la boîte à outils FASTX (http://hannonlab.cshl.edu/fastx{{0}}toolkit/) et alignées à l'aide de Tophat version 2.0.8 avec UCSC Annotation du génome de référence de la souris GRCm38/mm10 (http://genome.ucsc.edu). Le nombre de lectures de gènes a été généré à l'aide de HTSeq (v0.5.4), puis normalisé par la moyenne tronquée de la méthode de normalisation des valeurs M avec edgeR (v3.0.8) dans Bioconductor in R(v2.15), qui utilise une moyenne tronquée pondérée de les ratios d'expression logarithmique. Pour toutes les analyses, seuls les signaux de qualité (seuil : dix coups par million dans au moins deux échantillons sur quatre) ont été utilisés. Une analyse non supervisée a été effectuée à l'aide des 100 meilleurs gènes classés par la plage interquartile, puis un regroupement hiérarchique a été généré à l'aide de (v2.11) en utilisant des corrélations de Pearson bidirectionnelles pour visualiser des modèles d'expression génique envahissants impartiaux. Une analyse supervisée utilisant un test exact de Fisher modifié dans edgeR et un seuil de taux de fausse découverte de 10 % à l'aide de la procédure de Benjamini et Hochberg a été utilisée pour déterminer les expressions différentielles entre TH9 et T.9-TL1A ou WT et Batf{{23} }T,9-TL1A. L'analyse d'enrichissement des voies a été réalisée à l'aide de DAVID6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) avec un seuil de comptage =5 et un seuil de score de facilité=0.05.

Modèle de transfert de cellules T

Les cellules T CD4 plus CD62LighcD44"cD25- de souris CD45.1 ont été différenciées en cellules T9 ou T,9-TL1A pendant 3 jours. Male Rag{{10}}/souris receveuses ont reçu une injection ip de cellules TH9 ou TH9-TL1A de 0,5 × 10 degrés. Les souris ont été pesées pendant 6-8 semaines. Pour les expériences de neutralisation, les souris ont reçu une injection ip d'anti-IL-9 ou de contrôle lgG2b anticorps (tous deux 50 ug/dose ; R&D Systems) trois fois par semaine pendant 4 semaines et deux fois par semaine pendant le temps restant à partir du jour du transfert des lymphocytes T. Les tissus ont été fixés au formol, inclus en paraffine et colorés avec H&E ou AB-PAS.L'inflammation a été notée par un système de notation semi-quantitatif par un pathologiste qualifié ignorant les conditions expérimentales.45,46 Les LPMC ont été isolés du gros intestin comme décrit précédemment.7 Le tissu pulmonaire a été digéré pendant 45 min à 37 °C avec 10 ml de HBSS contenant 15 ug/ml Libérase"（Roche） et 25ug/ml DNase I （Sigma）et ​​filtrage à travers un tamis à cellules 40-μm suivi d'une lyse des globules rouges. Les suspensions unicellulaires ont été colorées avec anti-CD4, anti-CD45.1(A20), anti-CCR6 (29-2L17) et anti-CD103(2E7, tous eBioscience) et anti-Ki{{52 }}(SolA15, BD PharMingen) pour la cytométrie en flux ou restimulés avec des anticorps anti-CD3c/anti-CD28 pendant 3 jours. Les taux de cytokines dans les surnageants ont été mesurés par ELISA.

Statistiques

La signification statistique a été calculée à l'aide du logiciel SPSS (IBM SPSS Statistics 20, IBM Machines Corp., Armonk, NY, USA). Les données ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie d'un test t de Student bilatéral non apparié post hoc ou d'un test U de Mann-Whitney, comme indiqué. Les différences ont été considérées comme significatives à p<>

REMERCIEMENTS

Ce travail a été soutenu par le NIH (DK056328 à SRT) et la Fondation F. Widjaja (SRT et KSM). Anita Vibsig Neutzsky-Wulff a reçu des bourses postdoctorales de la Fondation Carlsberg (Danemark) et de la Fondation Lundbeck (Danemark). Jordan Nunnelee a reçu une bourse de recherche étudiante de la Crohn's and Colitis Foundation of America. La biobanque Cedars-Sinai MIRIAD IBD est soutenue par le F. Widjaja Foundation Inflammatory Bowel and Immunobiology Research Institute, les subventions NIH/NIDDK P01 DK046763, U01 DK062413 et The Leona M and Harry B Helmsley Charitable Trust.

LES CONTRIBUTIONS DE L'AUTEUR

MT, HH, LT, MW, BS, MW, BS, MW, JN, JS, AN-W, RB, YW, JT, VF et KM. ont effectué des expériences, analysé des données et examiné de manière critique le manuscrit. AP, J. T et YW ont effectué une analyse des données RNA-Seq. MT, ST et KM ont conçu les expériences. MT et KM ont rédigé le manuscrit.

INFORMATIONS COMPLÉMENTAIRES

La version en ligne de cet article (https://doi.org/10.1038/s41385-018-0122-4) contient du matériel supplémentaire, qui est disponible pour les utilisateurs autorisés.

Intérêts concurrents : Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Note de l'éditeur : Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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