ACKR4a induit l'autophagie pour bloquer la signalisation NF-kB et l'apoptose pour faciliter l'infection par Vibrio Harveyi

RÉSUMÉ

L'autophagie et l'apoptose sont deux mécanismes reconnus de résistance à l'invasion bactérienne. Cependant, les bactéries ont également développé la capacité d’échapper à l’immunité. Dans cette étude, nous identifions ACKR4a, membre d'une famille atypique de récepteurs de chimiokines, comme suppresseur de la voie NF-kB, qui coopère avec Beclin-1 pour induire l'autophagie afin d'inhiber la signalisation NF-kB et de bloquer l'apoptose, facilitant ainsi Infection à Vibrio harveyi. Mécaniquement, Ap-1 induit par V. harveyi active la transcription et l'expression d'ACKR4a. ACKR4a forme un complexe avec Beclin-1 et MyD88, respectivement, induisant l'autophagie et transportant MyD88 dans le lysosome pour dégradation afin de supprimer la production de cytokines inflammatoires. Pendant ce temps, l’autophagie induite par ACKR4a bloque l’apoptose en inhibant la caspase8. Cette étude prouve pour la première fois que V. harveyi utilise à la fois l'autophagie et l'apoptose pour échapper à l'immunité innée, ce qui suggère que V. harveyi a développé la capacité de lutter contre l'immunité des poissons. 

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INTRODUCTION

Le système immunitaire est généralement divisé en immunité innée et acquise, la plupart des organismes s'appuyant principalement sur l'immunité innée pour survivre.1 L'immunité innée est un mécanisme de défense formé dans les organismes. Il reconnaît le modèle moléculaire associé à l'agent pathogène (PAMP) via les récepteurs de reconnaissance de formes (PRR), répond rapidement à une infection pathogène et protège l'hôte de l'infection.2,3 En tant que PRR important, les récepteurs de type péage (TLR) peuvent initier un large éventail de réponses allant de la phagocytose à la production de cytokines, renforçant ainsi davantage les réponses inflammatoires et immunitaires innées.4 Dans la plupart des cas, les TLR signalent principalement via une voie dépendante de MyD88-, qui transmet des signaux via des réactions en cascade pour activer le noyau. facteur-kappa B (NF-kB).5 NF-kB est l'un des facteurs clés dans l'initiation de l'immunité innée et est essentiel à la coordination de la réponse inflammatoire, de l'immunité innée, de la différenciation cellulaire, de la prolifération et de la survie. considéré comme le principal initiateur de la réponse inflammatoire.6 Lorsque les bactéries infectent l’hôte, les effecteurs en aval de la réponse immunitaire innée, tels que les cytokines et les chimiokines, sont synthétisés et conduisent finalement à une réponse inflammatoire pour bloquer la croissance des bactéries. Cependant, en coévolution avec leurs hôtes, les bactéries ont également développé diverses stratégies de régulation pour échapper et subvertir les défenses de leur hôte.

On pense que l’autophagie et l’apoptose sont les deux voies importantes contre l’invasion bactérienne.7 L’autophagie est un processus conservateur qui transporte des protéines anormales vers les lysosomes pour dégradation et joue un rôle important dans l’immunité innée des eucaryotes contre l’invasion bactérienne.8,9 Cependant, certains les bactéries échappent à l’immunité en utilisant l’autophagie chez les mammifères. Normalement, les cellules visent à éliminer les bactéries extracellulaires envahissantes et les bactéries colonisatrices du cytoplasme par l'autophagie,10 mais certaines bactéries peuvent « détourner » l'autophagie pour achever leur auto-croissance et leur reproduction.11-13. Par exemple, Unc-51-comme la kinase 1 (ULK1), Beclin1, la chaîne légère 3 (LC3) associée aux microtubules et les protéines liées à l'autophagie (ATG) coopèrent pour former des autophagosomes, qui encapsulent les micro-organismes envahisseurs et les transportent vers les lysosomes pour dégradation.14–16 Cependant, Mycobacterium tuberculosis -régule Beclin-1 pour empêcher la formation d'autophagosomes, inhibant finalement l'autophagie et favorisant l'infection.17 Contrairement à l'inhibition de la formation d'autophagosomes, certaines bactéries utilisent les autophagosomes pour compléter les sites d'auto-réplication afin de favoriser la prolifération.11,18 En plus de En autophagie, l'apoptose est également un moyen de défense de l'hôte contre les agents pathogènes envahisseurs.7 L'apoptose est un modèle de mort cellulaire utilisé pour éliminer les cellules endommagées afin de maintenir la stabilité de l'environnement systémique.19 Lorsqu'il reçoit un signal d'invasion bactérienne, l'hôte induit l'apoptose des cellules infectées. cellules pour inhiber l’infection bactérienne.20 Par conséquent, le succès d’une colonisation bactérienne dépend de sa capacité à prévenir l’apoptose et à protéger la réplication bactérienne. Par exemple, Edwardsiella tarda assure sa survie en inhibant l’apoptose après l’infection des cellules ZF4 du poisson zèbre,21Shigella réussit sa colonisation en inhibant l’apoptose22, et la protéine S produite par le streptocoque du groupe A (GAS) se lie à la membrane érythrocytaire pour échapper à la détection du système immunitaire de l’hôte. système.23 Bien qu’il ait été prouvé que de nombreuses bactéries ont développé la capacité d’échapper à l’immunité, il existe quelques rapports faisant état d’agents pathogènes marins. Vibrio harveyi appartient à la famille des Vibrionaceae, reconnue comme agent hautement pathogène des poissons marins ; elle provoque des gastro-entérites, des nécroses musculaires et des ulcères cutanés, et constitue l’une des principales causes de mortalité des poissons marins.24

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À l'exception de l'autophagie et de l'apoptose, certaines bactéries (par exemple Staphylococcus aureus) peuvent même utiliser les récepteurs de chimiokines de leur hôte pour échapper à l'immunité.25 Les récepteurs de chimiokines sont des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) que l'on trouve principalement à la surface des leucocytes. Ils contiennent sept structures transmembranaires, qui sont impliquées dans la liaison et la signalisation du ligand, et jouent un rôle clé dans l'initiation et le maintien des réponses immunitaires et inflammatoires.26 Au fur et à mesure que la recherche sur les chimiokines progressait, des récepteurs atypiques de chimiokines (ACKR) ont été découverts.27 Bien que les ACKR soient structurellement similaires à d'autres récepteurs de chimiokines et peuvent internaliser des ligands, ils ne peuvent pas activer la voie de transduction du signal en raison de l'absence du domaine DRYLAIV, également appelé « récepteur silencieux ».28 La fonction des ACKR peut se refléter de la manière suivante : 1. Ils peuvent entrer en compétition avec les récepteurs typiques pour se lier à la chimiokine et ainsi réguler la transduction du signal de chimiotaxie cellulaire ; 2. En internalisant la chimiokine dans les cellules, la concentration de chimiokine dans l’environnement est réduite pour affecter le recrutement cellulaire et agir comme un piégeur de chimiokine. 3. Ils aident les chimiokines à compléter le transport intercellulaire à travers la barrière cellulaire stromale.29 La famille des ACKR comprenant principalement DARC,30 D6 31,32, CXCR7,33 et CCRL1,34 CCRL1 est également connue sous le nom de récepteur de chimiokine atypique. 4 (ACKR4). À l’heure actuelle, certaines études ont montré qu’ACKR4 semble réaliser la transduction du signal par la voie indépendante de la protéine G35-37 et qu’il joue un rôle non redondant dans le contrôle de l’inflammation et de la réponse immunitaire.38 Son rôle dans l’immunité adaptative est bien connu, mais son rôle dans l’immunité adaptative est bien connu. la fonction dans l’immunité innée est rarement étudiée.

Dans l'immunité innée, la transduction du signal de la voie TLR est hautement conservée des invertébrés aux mammifères. En tant que protéine centrale de la signalisation TLR, MyD88 a été largement étudiée chez les vertébrés. De plus, en raison de la structure hautement conservée de MyD88, ses homologues chez les poissons peuvent avoir des fonctions similaires à celles des mammifères.39,40 Chez le poisson zèbre, MyD88 est impliqué dans l'élimination des infections bactériennes.41 Des études antérieures ont également confirmé que V. harveyi échappe à l'immunité en détruisant la transduction du signal de MyD88.42 Cependant, les mécanismes par lesquels V. harveyi échappe à l'immunité restent mal compris chez les poissons téléostéens. Dans cette étude, ACKR4a a été rapidement régulé positivement dans Miichthys muy stimulé par V. harveyi. L'ACKR4a régulé positivement a à la fois supprimé l'immunité innée en induisant l'autophagie pour bloquer la voie NF-kB médiée par MyD88- et en induisant l'autophagie pour bloquer l'apoptose, afin d'améliorer l'infection par V. harveyi. Au meilleur de nos connaissances, ce rapport est le premier à expliquer que V. harveyi utilise à la fois l’autophagie et l’apoptose pour échapper à l’immunité innée.

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RÉSULTATS

L'infection à V. harveyi induit l'expression d'ACKR4a pour favoriser l'auto-prolifération

Pour identifier les gènes potentiellement impliqués dans la régulation de l'infection à V. harveyi, nous avons traité miiuy croaker avec V. harveyi pendant 48 h, puis utilisé l'analyse ARN-seq pour cribler les différents gènes d'expression (DEG) entre V. harveyi traité et non traité. des échantillons de rate. À partir des données de séquençage en profondeur, nous avons identifié 145 gènes régulés positivement et 28 0 gènes régulés négativement (Figure 1A). Sur cette base, nous avons sélectionné les 10 plus grands et les 10 moins DEG (log2 du changement de pli était de 1,0) pour la carte thermique de regroupement, et le résultat a montré que les échantillons respectifs dans les échantillons traités et non traités par V. harveyi étaient bien répliqués (Figure 1B) . Les ARNm d'ACKR4a ont été examinés et ont révélé qu'ils étaient fortement exprimés dans le cerveau musical de M après une infection par V. harveyi (Figure S1A). Ainsi, la lignée cellulaire cérébrale de M. muiiy (MBrC) a été utilisée pour des expériences ultérieures. L'efficacité d'inactivation de ACKR4a-si1 est de 46,1 % et ACKR4a-si2 est de 63,7 % dans MBrC (Figure S1B), donc ACKR4a-si2 (nommé ACKR4a-si) a été utilisé pour des expériences ultérieures. Par la suite, nous nous sommes concentrés sur le gène ACKR4a, qui pourrait avoir une fonction immunitaire, et les résultats du test des unités formant colonies (UFC) ont révélé qu'ACKR4a favorisait la prolifération de V. harveyi (Figures 1C, 1D et S1C). Pour étudier plus en détail le mécanisme par lequel ACKR4a favorise la prolifération de V. harveyi, le modèle d'expression d'ACKR4a a été analysé. ACKR4a dans les cellules MBrC était régulée par V. harveyi. Les résultats ont montré une infection par V. harveyi dépendant du temps aux niveaux de l'ARNm et des protéines (figures 1E et 1F). De plus, l'inactivation d'ACKR4a a efficacement supprimé l'expression d'ACKR4a aux niveaux de l'ARNm et des protéines (figures 1E et 1G). Les résultats ci-dessus indiquent que la régulation positive d'ACKR4a peut faciliter l'infection par V. harveyi.

Figure 1. ACKR4a induit par V. harveyi facilite son auto-prolifération

ACKR4a inhibe la signalisation NF-kB déclenchée par V. harveyi 

Nous avons constaté que le taux de prolifération cellulaire était affecté lorsque MBrC était infecté par V. harveyi et, pour vérifier cette découverte, nous avons effectué des tests de prolifération cellulaire. Les résultats ont montré que l'infection par V. harveyi réduisait la prolifération de MBrC (Figure S1D). Des expériences ultérieures ont confirmé que la surexpression d'ACKR4a réduisait la prolifération cellulaire, tandis que l'inactivation d'ACKR4a augmentait la prolifération cellulaire (Figure 2A et S1E). Plusieurs études ont démontré que l'activation de NF-kB favorise la prolifération cellulaire. Il a été constaté que BAY 11–7082, l'inhibiteur de NF-kB, pourrait également réduire la prolifération de MBrC (Figure 2A et S1E). Semblable aux rapports précédents43, l'augmentation de NF-kB-luc était associée à l'infection par V. harveyi de manière dépendante du temps (Figure S1F).

Figure 2. ACKR4a inhibe la signalisation NF-kB déclenchée par V. harveyi

Pour déterminer davantage l'effet de ACKR4a sur la signalisation NF-kB déclenchée par V. harveyi, un test rapporteur luciférase a été réalisé. ACKR4a a inhibé de manière significative l'activité de la luciférase NF-kB déclenchée par V. harveyi et le LPS ; L'activité de l'IL-1b et de la TNFa luciférase déclenchée par V. harveyi a également été inhibée par ACKR4a (Figures 2B à 2D). L'ACKR4a endogène a été réduit au silence pour valider son rôle dans l'immunité innée. Ensuite, les modèles d'expression de p65 et des cytokines pro-inflammatoires (IL-1b et TNFa) ont été détectés davantage, l'inactivation d'ACKR4a a considérablement augmenté les ARNm de p65, les ARNm d'IL-1b et les ARNm de TNFa (Figures 2E à 2G). ). Les résultats dans MLC et MKC ont également indiqué qu'ACKR4a pourrait inhiber la signalisation NF-kB (figures S1G à S1J). Les résultats ELISA étaient également similaires ; L'inactivation d'ACKR4a a augmenté de manière significative le TNFa et la surexpression d'ACKR4a a inhibé le TNFa (Figure 2H). Pour évaluer l'activation de NF-kB, il est davantage nécessaire d'analyser la forme translittérée, c'est-à-dire le NF-kB phosphorylé, et c'est une mesure de l'activité de NF-kB sur les gènes cibles. Lors de la stimulation de NF-kB, p65 est phosphorylée et pénètre dans le noyau pour réguler la transcription des cytokines pro-inflammatoires. Pour explorer la régulation de la phosphorylation de p65 par ACKR4a, nous avons mesuré le niveau de phosphorylation de p65 après inactivation de ACKR4a et surexpression de ACKR4a par immunoblot. L'infection par V. harveyi a amélioré la phosphorylation de p65, ce qui a prouvé que V. harveyi activait efficacement NF-kB. Sur cette base, l'inactivation d'ACKR4a a amélioré la phosphorylation de p65, tandis que la surexpression d'ACKR4a a diminué la phosphorylation de p65, indiquant qu'ACKR4a est un inhibiteur de la signalisation NF-kB (figures 2I et 2J). Chez le poisson zèbre, l’inactivation d’ACKR4a a augmenté la phosphorylation de p65. De plus, le test CFU a montré que BAY 11–7082 augmentait significativement la prolifération de MBrC (Figure 2K). Dans l’ensemble, ces données suggèrent qu’ACKR4a fonctionne comme un régulateur négatif de la signalisation NF-kB pour inhiber l’immunité innée lors d’une infection par V. harveyi.

Figure 3. ACKR4a interagit avec MyD88 et favorise la dégradation de MyD88 dans l'autophagie

ACKR4a interagit avec MyD88 et favorise MyD88 pour la dégradation autophagique

Ensuite, nous avons cherché à déterminer quelle cible de la signalisation NF-kB assure la médiation de la fonction suppressive de ACKR4a0. Le test rapporteur NF-kB-luciférase a révélé que la surexpression de ACKR4a provoquait une réduction de l'activité de la luciférase, induite par MyD88 de manière dose-dépendante (Figure 3A). Cependant, la surexpression de ACKR4a n'a montré aucun effet sur l'activité de la luciférase entraînée par TRAF6 ou TAK1 (figures 3B et 3C). Un résultat d’immunoblot était similaire à celui du test rapporteur luciférase ; la surexpression de ACKR4a a inhibé MyD88 de manière dose-dépendante, mais il n'y a eu aucun effet sur TRAF6 et TAK1 (Figure 3D). Ces résultats suggèrent que ACKR4a fonctionne au niveau MyD88.

Tous les TLR de mammifères, à l'exception du TLR3, dépendent au moins en partie de l'adaptateur MyD88 pour transmettre les signaux, ce qui rend la régulation directe de MyD88 plus efficace.44 Nous avons ensuite examiné l'expression de MyD88 à différents moments de l'infection par V. harveyi et avons découvert l'inactivation d'ACKR4a. amélioré l'expression de MyD88 (Figure 3E) et la surexpression d'ACKR4a a inhibé l'expression de MyD88 de manière dépendante du temps (Figure 3F). Un résultat intéressant a été constaté : bien que l'inactivation d'ACKR4a ait amélioré l'expression de MyD88 déclenchée par V. harveyi, cette amélioration n'était pas présente lorsque les cellules étaient au repos (figures 3G et 3H). Pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire sous-jacent à l'action d'ACKR4a dans la signalisation NF-kB médiée par MyD88-, nous avons effectué des tests de co-immunoprécipitation (Co-IP) pour déterminer si ACKR4a interagit avec MyD88. Le Flag-ACKR4a pourrait immunoprécipiter avec Myc-MyD88 (Figures 3I et S1K). Conformément à cela, nous avons constaté que Flag-MyD88 pouvait interagir avec ACKR4a endogène (Figure 3J). Des expériences de localisation subcellulaire ultérieures ont montré qu'ACKR4a n'avait pas de colocalisation significative avec MyD88 (Figure S1L). Ainsi, ces résultats confortent le concept selon lequel ACKR4a interagit physiquement avec MyD88 et leur interaction se produit probablement dans le cytoplasme. Nous avons ensuite étudié le mécanisme par lequel ACKR4a supprimait l’expression de MyD88. Le NH4Cl ou la 3-méthyladénine (3-MA), inhibiteurs de la voie de dégradation dépendante de l'autophagie-lysosome, ont entraîné une accumulation significative de MyD88 en présence d'ACKR4a, et le MG132 n'a pas affecté la dégradation de MonD88 (Figure 3K). De plus, des résultats similaires ont montré que 3-MA et NH4Cl bloquaient de manière significative la dégradation de MyD88 de manière dose-dépendante (figures 3L et 3M). Ces résultats semblent suggérer que le blocage de l'autophagie empêche efficacement la dégradation de MyD88 ciblée par ACKR4a. Le flux autophagique désigne le processus dynamique de l'autophagie, qui est un indicateur fiable de l'activité autophagique. Étant donné que la fluorescence de la GFP est désactivée dans le lysosome, le stade de l'autophagie peut être déterminé à partir de la fluorescence de la GFP et du RFP.42 L'observation de la fluorescence jaune dans le panneau Merge a montré une fluorescence plus rouge en présence d'ACKR4a, indiquant qu'ACKR4a favorisait la fusion de les autophagosomes et les lysosomes ; tandis que la chloroquine (CQ), un inhibiteur de l’autophagie, a empêché la fusion des autophagosomes et des lysosomes, montrant une fluorescence plus jaune (Figure 3N). Pour valider davantage que ACKR4a cible MyD88 pour la dégradation autophagique, un test de localisation lysosomale a été réalisé, MyD88 (vert) et les lysosomes (rouges) ont été co-localisés dans la cellule MBrC (Figure 3O), suggérant que MyD88 a été transporté vers les lysosomes. Pris ensemble, ces résultats suggèrent qu'ACKR4a interagit avec MyD88 et cible MyD88 pour la dégradation autophagique.

Figure 4. ACKR4a participe à la régulation de l'autophagie via Beclin-1

ACKR4a participe à la régulation de l'autophagie via Beclin-1

Certaines bactéries utilisent l'autophagie pour favoriser leur croissance et leur infection, leur réplication sera réduite lorsque l'autophagie est absente.13 Pour tester si V. harveyi participe à la régulation de l'autophagie dans les cellules MBrC, les cellules ont été infectées par V. harveyi, puis le modèle d'expression de LC3 a été examiné. Dans les cellules MBrC, l'exposition à V. harveyi a augmenté l'autophagie, comme l'indique l'accumulation de GFP-LC3 puncta, qui s'est accompagnée d'une augmentation dépendante du temps de l'infection par V. harveyi (Figure 4A). La surexpression d'ACKR4a a amélioré l'autophagie induite par V. harveyi, comme le montre une augmentation remarquable des accumulations de puncta de RFP-LC3, contrairement à l'inactivation d'ACKR4a qui a considérablement réduit l'autophagie induite par V. harveyi (Figures 4B et 4C). De plus, l'inactivation d'ACKR4a a entraîné une réduction de l'expression de LC3-II induite par V. harveyi (Figure 4D).

ULK1, Beclin-1 et ATG5 étaient les principales protéines régulatrices de l'autophagie. Les résultats de la qPCR ont montré qu'ACKR4a améliorait significativement l'expression de Beclin-1, mais pas ULK1 et ATG5 (Figure 4E). Le test rapporteur luciférase de ULK1, ATG5 et Beclin-1 a révélé que la surexpression de ACKR4a n'a provoqué qu'une augmentation de l'activité luciférase de Beclin-1 (Figure 4F). Ensuite, nous avons détecté que la surexpression de ACKR4a améliorait l'expression de Beclin-1, mais pas ULK1 et ATG5 (Figure 4G). De plus, l'autophagie induite par ACKR4a était inhibée par Beclin-1-si, alors qu'ATG5-si n'avait qu'une inhibition partielle (Figure 4H). Les résultats ci-dessus indiquent qu'ACKR4a était ciblé sur Beclin-1. Par conséquent, la fonction et le mécanisme de Beclin-1 dans la dégradation autophagique de MyD88 médiée par ACKR4a ont été étudiés. Chez le poisson zèbre infecté par V. harveyi, l'inactivation d'ACKR4a n'a pas entraîné de modifications significatives de ULK1 tout en réduisant considérablement Beclin-1 et ATG5 (figures S2B à S2D). Beclin-1 a encore amélioré le flux autophagique induit par ACKR4a avec Baf1A et CQ traités (Figure 4I), et Beclin-1 a amélioré la dégradation de MyD88 par ACKR4a (Figure 4J). Nous avons ensuite effectué les tests Co-IP pour déterminer si ACKR4a interagit avec Beclin-1, et avons découvert qu'ACKR4a interagit avec Beclin-1 et que l'infection par V. harveyi a amélioré l'interaction entre ACKR4a et Beclin{{51. }} (Figure 4K). Un test de localisation lysosomale a indiqué qu'ACKR4a améliorait la fusion de l'autophagosome avec le lysosome (Figure 4L). Par la suite, ACKR4a augmente l'expression endogène de Beclin -1 (Figure 4M) et l'inactivation d'ACKR4a atténue l'expression de Beclin -1 induite par V. harveyi (Figure 4N). De plus, le silençage Beclin -1 a amélioré la phosphorylation de p65 déclenchée par V. harveyi, ce qui suggère en outre que V. harveyi induit l'autophagie pour réguler négativement la signalisation NF-kB (Figure 4O). Nous avons ensuite cherché à déterminer l'importance biologique de Beclin-1 dans l'infection à V. harveyi, en particulier dans le contrôle de la prolifération de V. harveyi. Le test CFU a été effectué et a révélé que le silençage Beclin -1 et l'autophagie bloquée par CQ réduisaient la prolifération de V. harveyi, ce qui prouve que V. harveyi utilise l'autophagie pour favoriser sa prolifération (Figure 4P). Les résultats ci-dessus révèlent ensemble qu'ACKR4a induit et forme des complexes avec Beclin-1 pour favoriser l'autophagie, puis faciliter l'infection par V. harveyi.

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ACKR4a a induit l'autophagie pour bloquer l'apoptose

La mort cellulaire autophagique est considérée comme une alternative raisonnable à l'apoptose, et l'apoptose est également un mécanisme antibactérien reconnu ; les infections bactériennes réussies complètent l'auto-réplication en inhibant l'apoptose.22 Pour déterminer la relation entre l'autophagie induite par V. harveyi et l'apoptose, l'apoptose des cellules MBrC avec différents traitements avant et après l'infection par V. harveyi a été déterminée, et l'inactivation d'ACKR4a a augmenté V. apoptose induite par Harveyi (Figures 5A et 5B, panneau de gauche). La caspase3 et la caspase7 étant importantes dans l’initiation de l’apoptose, elles sont largement acceptées comme indicateurs fiables de l’apoptose. Un test de la caspase Glo 3/7 a montré que la surexpression de ACKR4a inhibait l'activité de la caspase3/7 induite par V. harveyi, tandis que l'inactivation d'ACKR4a améliorait l'activité de la caspase3/7 induite par V. harveyi (Figure 5B, panneau de droite). L'activité de la caspase3/7 induite par la caspase8 active recombinante ajoutée de V. harveyi et de manière exogène a été inhibée par ACKR4a (Figure 5C), ce qui suggère qu'ACKR4a est capable de bloquer efficacement la signalisation de l'apoptose. Bien que l'autophagie induite par ACKR4a ait été démontrée, des études supplémentaires sont nécessaires pour étudier le rôle de l'autophagie dans le blocage de l'apoptose. Comme le montre la figure 5D, l'inactivation d'ACKR4a a augmenté de manière significative les caspases effectrices (caspase7) et les caspases initiatrices (caspase8). De plus, la surexpression d'ACKR4a a inhibé les ARNm de la caspase7 et de la caspase8 (Figure 5E) et l'inactivation d'ACKR4a a significativement augmenté la caspase7 et la caspase8 chez le poisson zèbre (Figures S2E et S2F). Des études antérieures ont montré que Beclin-1 est un commutateur moléculaire qui intervient dans les processus d'apoptose et d'autophagie45. L'implication de Beclin-1 dans la régulation de l'apoptose a donc été explorée. Dans notre étude, la surexpression de Beclin -1 a régulé à la baisse la caspase8 induite par V. harveyi, tandis que Beclin -1 a fait taire la caspase8 induite par V. harveyi régulée à la hausse (Figure 5F). Un résultat intéressant a été constaté : la caspase8 était significativement régulée positivement après 3 heures d'infection par V. harveyi ; il a de nouveau été inhibé avec l'augmentation de la durée de l'infection et la LC3-II était négativement corrélée à la caspase8 (Figure 5G). Selon les résultats ci-dessus, ACKR4a a induit l'autophagie pour bloquer la signalisation apoptotique et faciliter l'infection par V. harveyi, et Beclin-1 pourrait être une cible potentielle dans la cascade de l'autophagie et de l'apoptose.

Figure 5. ACKR4a induit l'autophagie pour bloquer l'apoptose

Ap-1 améliore l'autophagie induite par ACKR4a lors d'une infection à V. harveyi

Par la suite, le mécanisme de l’expression d’ACKR4a induite par l’infection par V. harveyi a été étudié. Quatre plasmides promoteurs ACKR4a différents ont d'abord été construits selon les séquences de prédiction du promoteur (Figure 6A). Le test de luciférase a montré que l'activité ACKR4a-p-3 était la plus élevée (Figure 6B). Pour identifier l'activateur en amont de l'expression d'ACKR4a lors de l'infection par V. harveyi, la région promotrice d'ACKR4a a été analysée et a révélé qu'ACKR4a possède des sites de liaison potentiels de Sp-1 et Ap-1 (Figure 6C). Le test ACKR4a-luc a montré que Sp-1 ne pouvait pas améliorer l'activité luciférase et que Ap-1 augmentait l'activité luciférase (Figures 6D et 6E), ce qui soulevait la possibilité qu'ACKR4a puisse être une cible directe d'Ap. -1. Pour examiner cela, deux vecteurs luciférase constitués du mutant ACKR4a ont été construits (Figure 6F). Le test de luciférase a montré que les mutants dépourvus de sites de liaison Ap-1 inhibaient l'activité de la luciférase contrairement au type sauvage (Figure 6G). Pour confirmer qu'Ap-1 favorise l'expression d'ACKR4a, nous avons réduit au silence ou amélioré l'expression de Ap-1 via une surexpression ou un knockdown, et l'expression d'ACKR4a a été évaluée dans des cellules MBrC transfectées. L'inactivation d'Ap-1 a réduit de manière significative l'expression d'ACKR4a induite par V. harveyi (Figure 6H), tandis que la surexpression d'Ap-1 a considérablement amélioré l'expression d'ACKR4a (Figure 6I). Les résultats de l'immunoblot étaient cohérents avec les résultats de la qPCR, la surexpression de Ap-1 augmentait l'expression de ACKR4a, tandis que l'inactivation de Ap-1 diminuait l'expression de ACKR4a (Figure 6J). L'analyse par puce a montré que Ap-1 se lie au promoteur ACKR4a dans les cellules MBrC dans des conditions physiologiques normales, et que la stimulation de V. harveyi a amélioré la liaison de Ap-1 au promoteur ACKR4a (Figure 6K). Les résultats ci-dessus ont confirmé qu'ACKR4a est une cible transcriptionnelle potentielle d'Ap-1. La fonction de Ap-1 dans l'autophagie a ensuite été explorée ; L'inactivation d'Ap-1 a efficacement réduit l'accumulation de GFP-LC3 induite par l'infection par V. harveyi (Figure 6L), et a également atténué la régulation positive de LC3-II induite par l'infection par V. harveyi (Figure 6M). ). Le test CFU a été réalisé pour explorer le rôle de Ap-1 dans l'infection à V. harveyi et a révélé que AP-1 facilite la prolifération de V. harveyi (Figure 6N). Pris ensemble, les résultats ci-dessus indiquent qu'Ap-1 active la transcription et l'expression d'ACKR4a et contribue à l'infection par V. harveyi.

Figure 6. Ap-1 a amélioré l'autophagie induite par ACKR4a lors d'une infection à V. harveyi

Figure 7. Un modèle fonctionnel montrant comment ACKR4a facilite l'infection par V. harveyi

DISCUSSION

Il a été démontré que les ACKR sont impliqués dans plusieurs processus biologiques tels que la régulation du système de chimiokines, l’internalisation des ligands de chimiokines, la dégradation intracellulaire et la réponse inflammatoire4,26, ce qui est important non seulement pour l’immunité adaptative, mais également en tant que composant important du système immunitaire inné. .33,34 Cependant, le rôle des ACKR dans la réponse inflammatoire à une infection bactérienne chez le poisson n'a pas été étudié. Cette étude démontre pour la première fois qu'ACKR4a, membre de la famille ACKR, favorise l'infection de V. harveyi chez les poissons téléostéens par autophagie et apoptose. Mécaniquement, la transcription d'ACKR4a était régulée positivement par le facteur de transcription AP-1. Ensuite, l'ACKR4a régulé positivement a été mis en synergie avec Beclin-1 pour induire l'autophagie et transporté MyD88 vers les lysosomes pour dégradation. Pendant ce temps, ACKR4a induit l'autophagie pour bloquer l'apoptose et facilite ensuite l'infection par V. harveyi (Figure 7). L'immunité innée joue un rôle crucial dans la protection des eucaryotes contre les invasions pathogènes endogènes et exogènes.46 À la suite d'une exposition à long terme à des micro-organismes, les poissons ont développé une immunité innée plus optimisée pour les protéger de l'infection.47 Les TLR reconnaissent le PAMP lorsqu'une infection bactérienne se produit, et a initié une réponse immunitaire innée via des voies dépendantes et indépendantes de MyD88-, qui ont induit la production de cytokines pro-inflammatoires pour éliminer l'infection bactérienne. MyD88 est un adaptateur essentiel dans la signalisation TLR, à l'exception de TLR3, tous les TLR de mammifères utilisent MyD88 pour activer la signalisation NF-kB.48 Par conséquent, il peut être le plus efficace pour réguler directement MyD88. Par exemple, la S-1-acétylcystéine inhibe la production d'IL-6 en induisant la dégradation de MyD88. De même, chez les poissons, IRF3 et eIF3k inhiberaient la signalisation NF-kB en ciblant MyD88.42,49. Des preuves accumulées suggèrent également que MyD88 était important pour l'élimination des infections bactériennes. Par exemple, les souris déficientes en MyD88- ne pouvaient pas reconnaître les composants bactériens et étaient très sensibles à S. aureus. 50 En outre, il a également été démontré que MyD88 est impliqué dans l'élimination des infections bactériennes chez le poisson zèbre.41 L'activation du système immunitaire inné favorise la clairance bactérienne, ce qui constitue une pression sélective majeure, les favorisant pour développer la capacité de supprimer l'immunité innée. .51,52 Il a été démontré que les salmonelles peuvent réguler les réponses immunitaires et manipuler les réponses inflammatoires après avoir infecté les cellules hôtes. La virulence de la salmonelle, SpvC, déphosphoryle de manière irréversible ERK, p38 et MAPK, inhibant ainsi la transcription des cytokines pro-inflammatoires.53 Dans cette étude, l'ACKR4a régulé positivement chez M. miiuy infecté par V. harveyi a été combiné avec MyD88 pour inhiber la phosphorylation de p65. et bloquer la signalisation NF-kB. Cela suggère que les bactéries peuvent également supprimer l'immunité innée des poissons en interférant avec la stabilité des adaptateurs dans la signalisation TLR dans le but d'échapper au système immunitaire.

L'autophagie et l'apoptose sont deux mécanismes reconnus de résistance à l'invasion bactérienne, l'autophagie antimicrobienne constituant une barrière contre les micro-organismes envahisseurs. Les PRR peuvent induire l'autophagie à différentes étapes du contact hôte-bactérie et inhiber la croissance intracellulaire des bactéries.54 À l'inverse, les bactéries ont également développé des mécanismes efficaces pour prévenir, combattre ou commander l'autophagie. Ces mécanismes impliquent souvent de cibler Beclin-1 pour bloquer l'autophagie,55 empêchant la maturation des autophagosomes56 et même activant l'autophagie dans certains cas pour fournir la nutrition nécessaire à la croissance bactérienne.57 Différemment, nous avons constaté que V. harveyi induisait Beclin{{6} }autophagie activée via ACKR4a, qui cible MyD88 pour la dégradation autophagique, bloquant ainsi la signalisation NF-kB et favorisant l'auto-réplication. Une autre stratégie de défense est la mort cellulaire programmée (apoptose), qui est activée lorsque des agents pathogènes utilisent des cellules hôtes pour survivre et se répliquer. Par exemple, l’infection des macrophages par les mycobactéries provoque l’apoptose, qui contribue à l’élimination des bactéries des cellules.58 De plus, l’apoptose des macrophages médiée par le TNF-a détruit l’environnement intracellulaire des répliques des mycobactéries et réduit le taux de croissance des mycobactéries infectées.59 Pour lutter contre En raison de la pression de survie de l'apoptose, de nombreux agents pathogènes efficaces codent pour des gènes dont les produits inhibent l'apoptose dans les cellules hôtes, maintenant ainsi la viabilité de la réplication de l'agent pathogène.60 Bien que ces mécanismes aient été bien étudiés chez les mammifères, on sait peu de choses sur l'inhibition bactérienne de l'apoptose chez les poissons. Dans notre étude, l'autophagie induite par V. harveyi joue un rôle dans les étapes apoptotiques et bloque la signalisation apoptotique. L’apoptose et l’autophagie se favorisent et s’opposent mutuellement. Aux stades pré-apoptotiques, les cellules bloquent la voie apoptotique et réduisent le niveau d’apoptose par autophagie, conservant ainsi l’avantage. L'autophagie ne déclenche pas la mort cellulaire dans les premiers stades de l'apoptose, mais favorise également la survie cellulaire.61 L'autophagie au stade avancé de l'apoptose peut favoriser l'apoptose, puis l'apoptose accrue inhibe l'apparition de l'autophagie par la migration des voies p53 et BH3.62 Le processus biologique est étroitement régulé, notamment l’interaction de l’autophagie et de l’apoptose. De nombreux gènes régulateurs sont impliqués dans le mécanisme de réponse interactif de l'apoptose et de l'autophagie, Beclin-1 étant l'un d'entre eux.63 En plus de la régulation de l'initiation de l'autophagie, Beclin-1 est également impliqué dans la régulation de l'apoptose.45 ,64 Des études ont montré que Beclin-1 perd sa capacité à résister à l'apoptose après avoir été clivé par des caspases activées.65 Cela suggère que Beclin-1 joue un rôle important en tant que « commutateur moléculaire » dans la régulation de l'autophagie et de l'apoptose.

cistanche tubulosa-améliorer le système immunitaire

V. harveyi est une bactérie marine à Gram négatif qui constitue une menace sérieuse pour la santé des pêcheries aquacoles marines. L’infection à V. harveyi provoque une méningite et une encéphalite chez les poissons,66 et l’infection à V. harveyi provoque une congestion cérébrale chez le mérou.67 En réponse à une infection bactérienne, les réponses immunitaires et inflammatoires innées constituent les principaux systèmes de défense des poissons. Cependant, les bactéries ont également développé la capacité d’échapper à l’immunité en symbiose avec leurs hôtes. En résumé, nos résultats révèlent un mécanisme d’évasion immunitaire de V. harveyi chez les poissons. ACKR4a induit l'autophagie pour inhiber la signalisation NF-kB et bloquer l'apoptose, ce qui facilite l'infection par V. harveyi chez les poissons téléostéens. C’est également la première fois que des bactéries Gram-négatives échappent à l’immunité en régulant simultanément l’immunité innée et l’apoptose via l’autophagie. Cette étude permet de mieux comprendre les effets de l'autophagie sur l'interaction hôte-bactérie chez les poissons téléostéens et donne une perspective sur la résistance des mammifères à l'infection bactérienne.

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