L'actéoside comme option thérapeutique potentielle pour le carcinome hépatocellulaire primaire : une étude préclinique

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen et Zhiyong Wang

Résumé

Contexte : Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une tumeur maligne courante présentant des caractéristiques de mauvais pronostic, de morbidité et de mortalité élevées dans le monde. En particulier, seules quelques options de traitement systémique sont disponibles pour les patients atteints de CHC avancé et incluent le sorafenib et le schéma thérapeutique atezolizumab plus bevacizumab récemment décrit comme traitements de première intention possibles. Nous proposons ici l'actéoside, un glycoside phényléthanoïde largement distribué dans de nombreuses plantes médicinales comme candidat potentiel contre le CHC avancé.

Méthodes : La prolifération cellulaire, la formation de colonies et la migration ont été analysées dans les trois lignées cellulaires HCC humaines BEL7404, HLF et JHH-7. Le test d'angiogenèse a été réalisé à l'aide de HUVES. Le modèle de souris nues de xénogreffe BEL7404 ou JHH-7 a été établi pour analyser les effets antitumoraux possibles de l'actéoside. qRT-PCR et western blot ont été utilisés pour révéler les mécanismes antitumoraux potentiels de l'actéoside.

Résultats:Actéoside de cistancheinhibe la prolifération cellulaire, la formation de colonies et la migration dans les trois lignées cellulaires HCC humaines BEL7404, HLF et JHH-7. L'interdiction de l'angiogenèse par l'actéoside a été révélée par l'inhibition de la formation de tubes et de la migration cellulaire des HUVEC. La combinaison d'acteoside et de sorafenib a produit une inhibition plus forte de la formation de colonies cellulaires et de la migration des cellules HCC ainsi que de l'angiogenèse des HUVEC. L'efficacité antitumorale in vivo de l'actéoside a été davantage démontrée dans le modèle de souris nude xénogreffe BEL7404 ou JHH-7, avec une amélioration lorsqu'il est combiné avec le sorafénib pour inhiber la croissance de la xénogreffe JHH-7. Un traitement supplémentaire des cellules JHH-7 avec de l'actéoside a révélé une augmentation du niveau de la protéine suppresseur de tumeur p53 ainsi qu'une diminution du niveau du gène de la peptidase liée à la kallikréine (KLK1, 2, 4, 9 et 10) sans effet significatif. modifications du reste des gènes KLK1–15.

Conclusion :Actéoside de cistancheexerce un effet antitumoral éventuellement par sa régulation à la hausse des niveaux de p53 ainsi que par l'inhibition de l'expression de KLK et de l'angiogenèse. L'actéoside pourrait être utile comme traitement d'appoint dans le traitement du CHC avancé en clinique.

Mots clés : Actéoside, Carcinome hépatocellulaire, Sorafénib, Xénogreffe, p53, Kallikréine

Arrière plan

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une tumeur maligne courante avec des caractéristiques de mauvais pronostic et une morbi-mortalité élevée dans le monde [1, 2]. Divers facteurs ont été identifiés comme contribuant à la survenue et à la progression du CHC, notamment l'infection par le virus de l'hépatite B ou C, l'inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs tels que p53, l'activation anormale d'oncogènes tels que K-ras et certaines molécules de signalisation. tels que PI3K, ERK/MAPK et Wnt/-caténine ainsi que l'évasion du système immunitaire de l'hôte [3, 4]. Pour la prise en charge du CHC, la résection, la transplantation hépatique et l'ablation par radiofréquence sont des options pour les patients atteints de CHC à un stade précoce, mais avec des taux élevés de récidive et de métastases [3, 5, 6]. De plus, seules quelques options de traitement systémique sont disponibles pour les patients atteints de CHC avancé et incluent le sorafenib et le schéma thérapeutique atezolizumab plus bevacizumab récemment décrit comme traitements de première ligne possibles [7]. Dans ce contexte, il est important et intéressant soit de développer de nouveaux agents ciblant de multiples cibles moléculaires, soit de mettre en place une nouvelle stratégie telle que l'application de thérapies combinées dans le traitement du CHC avancé.

Actéoside de cistancheest un glycoside phényléthanoïde largement distribué dans de nombreuses plantes médicinales, dont Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] et Ligustrum purpurascens [10]. De plus en plus de preuves ont montré que l'actéoside peut exercer diverses activités biologiques, y compris son activité antitumorale. Par exemple, l'actéoside a montré de puissants effets antiprolifératifs sur les cellules cancéreuses de la prostate [11]. L'administration intrapéritonéale d'actéoside a supprimé la croissance tumorale dans un modèle murin de mélanome, peut-être en inhibant la protéine kinase C [12]. De plus, l'actéoside a potentialisé la sensibilisation des cellules cancéreuses colorectales au 5- Fluorouracil via le ciblage de la signalisation PI3K/Akt [13]. Nos données antérieures ont également montré une inhibition de la mélanogénèse par l'actéoside dans les cellules de mélanome B16 [14]. Malgré cela, peu d'informations sont disponibles concernant l'efficacité possible de l'actéoside dans le traitement du CHC et les mécanismes sous-jacents potentiels.

Dans la présente étude, nous avons montré queActéoside de cistancheinhibe la prolifération cellulaire, la formation de colonies et la migration dans les trois lignées cellulaires HCC humaines BEL7404, HLF et JHH7. L'angiogenèse est également inhibée suite au traitement par l'actéoside, comme le montre l'inhibition de la formation des tubes et de la migration cellulaire des HUVEC. L'efficacité antitumorale in vivo de l'actéoside est en outre démontrée dans le modèle de souris nues de xénogreffe BEL7404 ou JHH-7, avec une amélioration lorsqu'il est combiné avec le sorafénib pour inhiber la croissance de la xénogreffe JHH-7. Les effets antitumoraux de l'actéoside pourraient être attribués à sa régulation à la hausse de p53 ainsi qu'à la suppression des KLK et de l'angiogenèse.

Méthodes

Culture de cellules

Les lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire humain (HCC) BEL7404, HLF et JHH7 ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection et ont été cultivées en routine dans un milieu DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal additionné de 100 unités/ml de pénicilline G et 100 ug/ml de streptomycine. dans un incubateur humidifié à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone. Des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) ont été isolées des veines du cordon ombilical humain (fournies par ScienCell Research Laboratories, San Diego, États-Unis) et maintenues dans un milieu de cellules endothéliales comme décrit précédemment [15].

RéactifsActéoside de cistanche (A01) a été acheté auprès de Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, Chine ; lot n° 100581 ; pureté supérieure ou égale à 99 % par HPLC). Le sorafenib a été obtenu auprès de Selleck Chemicals (Houston, USA). Nous avons dissous l'actéoside dans une solution saline à 0,9 %. La solution mère de sorafénib a été préparée dans du diméthylsulfoxyde (DMSO; 10 mM), aliquotée et stockée à - 20 degrés.

Animaux

Des souris mâles BALB/c (Nu/Nu) (18-20 g, 6 à 8 semaines au moment de la réception) ont été utilisées dans l'étude (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Shanghai, Chine). Les animaux ont été logés dans des cages en polysulfone ventilées individuellement dans une pièce à température et lumière contrôlées (12 h de cycle de lumière- 12 h d'obscurité, lumières allumées à 7h00 du matin) avec libre accès à la nourriture et à l'eau . Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux et exécutés conformément aux directives de l'Association internationale pour l'étude de la douleur concernant l'utilisation d'animaux de laboratoire.

Test de prolifération cellulaire L'activité anti-proliférative a été réalisée en utilisant le test MTT. En bref, les cellules ont été étalées à une densité de 4 à 5 × 103 cellules par puits dans des plaques à puits 96-. Après avoir été attachées pendant une nuit, les cellules ont été traitées avec une série de concentrations d'actéoside. Après les traitements médicamenteux au moment indiqué, les cellules ont été incubées avec du 3-(4,5- diméthylthiazol-2-yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium (MTT ; Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, USA. Concentration finale : 5 ug/ml) pendant 3 à 4 h à 37 degrés. Le produit formazan a été dissous dans du DMSO pour une quantification à une longueur d'onde de 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 cellules ont été comptées au microscope optique (grossissement x 100 ; Olympus, Tokyo, Japon).

Test de cicatrisation Les cellules ont été ensemencées dans des plaques {{0}}puits (1 × 105 cellules par puits) et cultivées à 90 % de confluence. La couche cellulaire a été rayée avec une pointe de pipette stérile de 200 ul pour produire un espace de blessure. La migration cellulaire dans la zone blessée a été visualisée aux moments indiqués (0, 10 et 24 h) sous un microscope optique inversé à un grossissement de × 100. Chaque expérience a été réalisée en triple.

Test de formation de tubes Les HUVEC ont été cultivées comme décrit précédemment [15]. En bref, les plaques à puits 96- ont été recouvertes de Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant, puis renvoyées à l'incubateur pour polymériser pendant 30 à 40 min. Les HUVEC ont ensuite été ensemencées à une densité de 2 × 105 cellules/mL et traitées avec divers médicaments donnés pendant 8 h. La formation du tube a été photographiée avec un microscope inversé aux moments indiqués et analysée à l'aide du logiciel ImageJ.

Analyse Western blot

Les lysats cellulaires totaux ont été préparés avec un tampon de dosage par radioimmunoprécipitation (RIPA) (50 mM Tris HCl à pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % de NP40, 1 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS, 10 ug/ml de leupeptine, 10 ug/ml d'aprotinine et 2 mM de PMSF). Des échantillons de protéines avec des quantités égales (20 ug/piste) ont été séparés sur gel SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Les membranes ont été incubées pendant une nuit avec l'anticorps p53 (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Pour les contrôles de chargement, les membranes ont été rincées avec un tampon de décapage et sondées à nouveau avec l'anticorps -actine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Les protéines ont été détectées à l'aide d'un système de détection ECL (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA).

qRT-PCR

L'ARN total a été extrait des lignées cellulaires à l'aide du réactif Trizol (Invitrogen, USA) et a subi une réaction en chaîne de transcription inverse-polymérase (RT-PCR) pour synthétiser l'ADNc à l'aide d'un kit disponible dans le commerce. La qRT-PCR en temps réel utilisant 2xSYBR green qPCR Supermix a été réalisée sur la machine Stratagene Mx3000P PRC (Agilent Technologies, USA). Les séquences d'amorces ont été présentées ci-dessous : sens 5′-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3′ et anti-sens 5′-CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3′ pour KLK1 ; sens 5′-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ et anti-sens 5′-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ pour KLK2 ; sens 5′- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3′ et anti-sens 5′-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3′ pour KLK3 ; sens 5′-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3′ et anti-sens 5′-GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3′ pour KLK4 ; sens 5′-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ et anti-sens 5′-GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3′ pour KLK5 ; sens 5′- CTCTCCTCCTGGGGACACAGA-3′ et anti-sens 5′- TCCGCCATGCACCAACTTAT-3′ pour KLK6 ; sens 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ et anti-sens 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ pour KLK7 ; sens 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ et anti-sens 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ pour KLK8 ; sens 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ et anti-sens 5′- CGTGACGTCATAGAGACGG-3′ pour KLK9 ; sens 5′-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ et anti-sens 5′-CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3′ pour KLK10 ; sens 5′-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3′ et anti-sens 5′-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3′ pour KLK11 ; sens 5′-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ et anti-sens 5′-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3′ pour KLK12 ; sens 5′-CCTGAACCACGACCATGACA-3′ et anti-sens 5′-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3′ pour KLK13 ; sens 5′-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3′ et anti-sens 5′-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3′ pour KLK14 ; sens 5′-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ et anti-sens 5′-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ pour KLK15 ; sens 5′-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ et anti-sens 5′- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3′ pour GAPDH. Les valeurs de seuil de cycle (Ct) de chaque gène KLK ont été normalisées à celles de GAPDH et analysées avec le logiciel MxPro.

Activité antitumorale in vivo de A01 seul ou en association avec le sorafenib Les suspensions cellulaires BEL7404 ont été préparées (3 × 106 cellules) et injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit souris nues athymiques. Dix jours après l'inoculation, des souris porteuses de tumeurs (poids corporel (g) : 22–26 ; moyenne ± SEM : 23,8 ± 0.14) ont été examinées et sélectionnées pour être randomisées en 7 groupes de traitement en fonction du volume de la tumeur ({ {12}} mm3 ). Un total de 38 souris ont été assignées à différents groupes de traitement (n=5 par groupe sauf pour le groupe modèle (n=8)). Les animaux ont ensuite été traités par gavage oral avec de l'actéoside (A01 ; 12,5, 25 et 50 mg/kg), du sorafénib seul (50 mg/kg) ou en association avec A01 (50 mg/kg) une fois par jour pendant 14 jours. De plus, une dose de 20 mg/kg d'A01 a également été administrée par voie intraveineuse. Les doses ont été sélectionnées sur la base d'études antérieures et de nos données préliminaires [15]. La croissance tumorale a été surveillée tous les 3 ou 4 jours à l'aide d'un pied à coulisse électronique, le volume étant calculé comme 0,5 x longueur x largeur (mm3). De plus, une expérience parallèle utilisant l'inoculation JHH-7 a été incluse. Sept jours après l'inoculation, des souris porteuses de tumeurs (poids corporel (g) : 20-26 ; moyenne ± SEM : 24,0 ± 0,20) ont été examinées et sélectionnées pour être randomisées en groupes de traitement en fonction du volume de la tumeur (80-130 mm3 ). Un total de 23 souris ont été réparties en 4 groupes de traitement (n=5 par groupe sauf pour le groupe modèle (n=8)). Les animaux ont ensuite reçu A01 (20 mg/kg, iv), sorafenib seul (50 mg/kg, ig) ou combiné avec A01 (20 mg/kg, iv) une fois par jour pendant 14 jours consécutifs. Toutes les souris ont été anesthésiées avec de l'hydrate de chloral (350 mg/kg) et sacrifiées par luxation du cou à la fin de la période d'observation. Et la masse tumorale a été retirée et photographiée avec un appareil photo numérique.

analyses statistiques

Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart type (SD). Sauf indication contraire, les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'une analyse de variance (ANOVA) suivie d'un test de Tukey posthoc. Les valeurs de volume de la tumeur sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Une ANOVA à deux voies suivie de tests de Tukey a été utilisée pour analyser les données de volume tumoral. Le logiciel GraphPad Prism a été utilisé pour les analyses statistiques. Une valeur de p < 0.05="" a="" été="" considérée="" comme="" statistiquement="">

Résultats

Effets de A01 sur la prolifération et la formation de colonies de CHC in vitro

Les trois lignées cellulaires HCC (BEL7404, HLF et JHH7) ont été utilisées pour le test de prolifération cellulaire. Comme le montre la figure 1, le test MTT a révélé que A01 inhibait la prolifération des trois cellules HCC. Pour demander en outre si l'activité antiproliférative de A01 était due à sa capacité à inhiber la clonogénicité cellulaire, le test de formation de colonies a été effectué. A01 à 100 μM a montré une forte inhibition de la formation de colonies dans les cellules BEL7404 (Fig. 2a et b). Lorsqu'il est combiné avec le sorafenib (2 μM), le pouvoir d'inhibition était plus fort que celui de A01 ou du sorafenib seul. Des résultats similaires ont également été observés dans les deux autres cellules HCC, HLF et JHH -7 (Fig. 2c et d).

Effets de A01 seul ou en association avec le sorafénib sur la migration cellulaire des CHC in vitro

Nous avons ensuite évalué la migration cellulaire en utilisant le test de blessure par égratignure. Comme le montre la figure 3, la combinaison d'A01 (100 ou 500 μM) et de sorafenib (10 μM) a empêché de manière significative la cicatrisation des plaies dans les trois cellules HCC, par rapport au groupe témoin. Pour les cellules BEL7404, A01 (100 ou 500 μM) et le sorafenib (10 μM) n'ont produit qu'une tendance à la prévention de la cicatrisation des plaies sans signification statistique (Fig. 3a et d). Pour les cellules HLF, A01 à 500 μM et le sorafenib à 10 μM ont inhibé la cicatrisation. En particulier, A01 (500 μM) associé au sorafenib (10 μM) a produit une inhibition plus forte de la cicatrisation que le sorafenib seul (Fig. 3b et e). Pour les cellules JHH, la cicatrisation des plaies a été empêchée par A01 (500 μM) et le sorafénib (10 μM). La combinaison de A01 (100 μM) et de sorafenib (10 μM) a produit une inhibition plus forte de la cicatrisation que A01 (100 μM) ou sorafenib (10 μM) seuls. De plus, A01 à 500 μM associé au sorafenib (10 μM) a montré une plus forte inhibition de la cicatrisation que A01 (500 μM) ou le sorafenib (10 μM) seul (Fig. 3c et f).

Effets de A01 seul ou en association avec le sorafénib sur l'angiogenèse in vitro

L'angiogenèse est étroitement associée à la croissance, à la progression et aux métastases tumorales [16], et est donc considérée comme l'une des cibles intermédiaires du traitement du cancer. Nous avons d'abord effectué un test de formation de tubes pour analyser l'angiogenèse potentielle in vitro. Comme le montre la Fig. 4, un traitement de 3 h avec le sorafenib seul (10 μM) ou la combinaison de A01 (100 et 500 μM) et de sorafenib (10 μM) a commencé à montrer des effets inhibiteurs sur la formation de structures vasculaires, c'est-à-dire l'allongement et l'alignement des HUVEC (Fig. 4a et c). Après un traitement de 8 h, A01 (100 et 500 μM), le sorafenib (10 μM) ainsi que la combinaison de A01 et de sorafenib ont tous inhibé significativement la formation de structures vasculaires, avec une inhibition plus forte par la combinaison de A01 et de sorafenib que A01 ou sorafenib seul (Fig. 4a et c). De plus, la migration cellulaire des HUVEC est une étape clé dans la formation de nouveaux vaisseaux au cours de l'angiogenèse et est donc étudiée. Comme le montrent les figures 4b et d, A01 (500 μM), le sorafenib (10 μM) ainsi que la combinaison de A01 (100 et 500 μM) et de sorafenib (10 μM) ont tous inhibé de manière significative la migration cellulaire des HUVEC. A01 (500 μM) combiné au sorafenib (10 μM) a produit une inhibition plus forte que A01 (500 μM) ou le sorafenib (10 μM) seul.

Effets de A01 seul ou en association avec le sorafenib sur la croissance tumorale in vivo des xénogreffes BEL7404 et JHH-7 HCC

Pour mieux évaluer l'efficacité de l'A01 seul ou associé au sorafénib sur la croissance tumorale in vivo du CHC, nous avons établi un modèle de souris nude de xénogreffe sous-cutanée en utilisant BEL7404 ou JHH-7 cellules. Comme le montre la figure 5, le volume de la tumeur a été considérablement diminué après le traitement avec A01 (25 et 50 mg/kg, par gavage oral ; 20 mg/kg, via la veine caudale ; tous p < 0,01="" vs="" groupe="" modèle)="" ou="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" par="" gavage="" oral="" ;="" p="">< 0,01="" vs="" groupe="" modèle)="" seul="" (fig.="" 5a="" et="" b).="" la="" combinaison="" de="" a01="" (50="" mg/kg)="" et="" de="" sorafénib="" (50="" mg/kg)="" a="" montré="" une="" plus="" forte="" inhibition="" de="" la="" croissance="" tumorale="" par="" rapport="" au="" sorafénib="" seul="" (p="">< 0,01),="" mais="" a="" produit="" un="" effet="" similaire="" à="" a01="" seul="" (fig.="" 5a="" et="" c="" ).="" nous="" avons="" ensuite="" utilisé="" le="" modèle="" de="" souris="" nues="" de="" xénogreffe="" jhh-7="" pour="" tester="" davantage="" les="" possibles="" efficacités="" anti-tumorales="" de="" a01.="" comme="" le="" montre="" la="" fig.="" 6,="" le="" traitement="" avec="" a01="" (20 mg/kg,="" iv)="" ou="" sorafénib="" (50 mg/kg,="" ig)="" a="" produit="" une="" inhibition="" significative="" de="" la="" croissance="" tumorale="" de="" la="" xénogreffe="" jhh-7="" (p="">< 0,01 par="" rapport="" au="" groupe="" modèle="" ),="" avec="" une="" plus="" grande="" inhibition,="" lorsqu'ils="" sont="" combinés="" (fig.="" 6a="" et="" b ;="" p="">< 0,01="" vs="" a01="" ou="" groupe="" sorafenib="">

Modulation possible de la peptidase liée à la kallikréine et de p53 parActéoside de cistanche

La peptidase liée à la kallikréine (KLK) a été suggérée comme biomarqueur du cancer dans le diagnostic et le pronostic de divers cancers, y compris le carcinome hépatocellulaire en raison de son expression dérégulée [17-19]. Dans ce scénario, nous avons détecté l'expression génique de KLK1–15 dans la lignée cellulaire HCC JHH-7. Comme le montre la Fig. 7, le traitement à l'actéoside a produit une inhibition significative des niveaux d'ARNm de KLK1, 2, 4, 9 et 10 (Fig. 7a-e), sans changement significatif du reste de KLK1–15 (données non présentées ). De plus, nous avons également détecté le niveau de protéine suppresseur de tumeur p53 et révélé une augmentation par le traitement à l'actéoside (Fig. 7f).

Discussion

La prise en charge du CHC avancé a longtemps été insoluble en raison de l'impossibilité de diagnostic à des stades précoces et de la chimiorésistance de la tumeur [5, 6]. Le sorafénib, l'inhibiteur de multikinase qui inhibe la prolifération cellulaire et l'angiogenèse, associé à un autre inhibiteur de multikinase oral, le lenvatinib, est devenu le traitement standard du CHC avancé [3, 5, 20, 21]. Cependant, les taux de survie globale sont modestes compte tenu des faibles taux de réponse et de l'inadéquation des paramètres cliniques [3, 22]. Une étude récente a montré que l'atezolizumab plus le bevacizumab produisaient de meilleurs résultats cliniques que le sorafenib chez les patients atteints de CHC non résécable, faisant de cette combinaison une nouvelle option de traitement possible de première ligne pour le CHC avancé [7]. Dans ce contexte, nous avons identifié que le glycoside phényléthanoïde,Actéoside de cistancheinhibe la prolifération cellulaire, la formation de colonies et la migration dans les trois lignées cellulaires HCC humaines BEL7404, HLF et JHH-7 ainsi que l'angiogenèse interdite des HUVEC. La combinaison d'acteoside et de sorafenib a produit une inhibition plus forte de la formation de colonies cellulaires et de la migration des cellules HCC ainsi que de l'angiogenèse des HUVEC. Acteoside a présenté l'efficacité antitumorale dans le modèle de souris nude xénogreffe BEL7404 ou JHH-7, avec une amélioration lorsqu'il est combiné avec le sorafénib pour inhiber la croissance de la xénogreffe JHH-7. Des analyses plus poussées ont révélé une augmentation de p53 ainsi qu'une diminution de certains gènes KLK. En conséquence, l'utilisation possible de l'actéoside comme adjuvant dans le traitement du CHC avancé en clinique doit être envisagée.

De plus en plus de preuves ont montré les effets antitumoraux deActéoside de cistanchedans diverses cellules tumorales telles que les cellules de mélanome B16, les cellules de glioblastome, les cellules cancéreuses colorectales, les cellules de carcinome épidermoïde oral, les cellules cancéreuses de la prostate et les cellules d'adénocarcinome mammaire humain [11-13, 23-25] ou chez des animaux porteurs de tumeurs [12]. Malgré cela, peu d'études se sont focalisées sur les effets de l'actéoside sur le CHC in vitro ou in vivo sauf une étude utilisant la diéthylnitrosamine comme carcinogène pour induire l'hépatocarcinogenèse chez le rat et révélant la chimioprévention par l'actéoside [26]. Dans la présente étude, nous avons montré l'inhibition par l'actéoside de la prolifération cellulaire, de la formation de colonies et de la migration dans les lignées cellulaires HCC ainsi que la croissance tumorale chez les souris portant des xénogreffes de lignées cellulaires HCC, démontrant ainsi directement les effets antitumoraux de l'actéoside dans le HCC. De plus, la combinaison d'actéoside et de sorafenib a produit des effets antitumoraux encore plus forts. Combiné avec la preuve que l'actéoside protège contre les lésions hépatiques [27-29] sans effets toxiques chez les animaux et sans mutagénicité [30], il semble être possible pour l'application future de la thérapie combinée de l'actéoside et du sorafénib chez les patients atteints d'une maladie avancée. CHC à la clinique.

La famille des kallikréines humaines comprend 15 protéases à sérine de type trypsine ou chymotrypsine sécrétées homologues à chaîne unique (KLK1-15) et a été impliquée dans la régulation de la croissance tumorale, de la progression néoplasique, de l'angiogenèse et des métastases [18, 31]. En particulier, les KLK ont été suggérés comme biomarqueur du cancer dans le diagnostic et le pronostic de divers cancers, y compris le carcinome hépatocellulaire en raison de son expression dérégulée [17-19]. Par exemple, KLK1 est proposé comme biomarqueur du cancer gastrique en raison de l'élévation des niveaux de KLK1 dans le néoplasme gastrique et de la prévention de la croissance tumorale dans le cancer gastrique par inhibition de l'activité de KLK1 avec la protéine de liaison à la kallikréine (KBP) [32]. Dans ce scénario, nous avons observé une inhibition significative des niveaux d'ARNm de KLK par l'actéoside (KLK1, 2, 4, 9 et 10). L'application de KBP, qui se lie spécifiquement à la kallikréine tissulaire et inhibe l'activité de la kallikréine, a été rapportée pour supprimer la croissance du CHC chez la souris, éventuellement via son activité anti-angiogénique [33], suggérant l'implication possible des KLK dans la progression du CHC. De plus, la protéine p53 suppresseur de tumeur est capable d'induire la sénescence, l'apoptose ainsi que l'arrêt du cycle cellulaire. Une expression accrue de p53 confère une chimiosensibilité accrue dans les cellules cancéreuses [34]. À cet égard, nos résultats occidentaux ont montré une augmentation des niveaux de p53 après un traitement avec l'actéoside. Pris ensemble, il est raisonnable de déduire que l'actéoside exerce des effets antitumoraux sur le CHC, éventuellement par sa régulation à la hausse de p53 ainsi que par l'inhibition de KLK et de l'angiogenèse.

Il convient de noter que la cible moléculaire directe à laquelleActéoside de cistanchepourrait lier directement n'est pas encore clair. Nos données préliminaires utilisant l'amarrage moléculaire ont révélé une liaison directe de l'actéoside avec la kallikréine (données non présentées). D'autres expériences seraient nécessaires pour clarifier cette présomption. De plus, comme pour les doses d'actéoside utilisées pour le dosage cellulaire dans l'étude 10–50 fois supérieures à celle du sorafénib (10 μM), nous avons d'abord choisi ces doses d'actéoside conformément à la relation dose-réponse dans le test MTT. Deuxièmement, les doses que nous avons utilisées (100, 500 μM) étaient comparables aux études précédentes [35], dans lesquelles l'actéoside (100 μM) inhibait la prolifération cellulaire des cellules cancéreuses colorectales. Enfin, malgré la dose plus élevée dans le test cellulaire, l'actéoside a produit une inhibition prononcée de la croissance tumorale dans le modèle de souris nues xénogreffe HCC dans notre étude (25 et 50 mg/kg), les effets étant similaires au sorafénib (50 mg/kg). Pour le sorafenib, il a été utilisé dans notre étude à la dose de 10 μM au niveau cellulaire. Cette dose est comparable aux études précédentes dans lesquelles le sorafénib s'est avéré inhiber la viabilité cellulaire avec une CI50 de 4,0 à 6,5 μM dans les lignées cellulaires HCC des cellules PLC/PRF/5 et HepG2. En revanche, la dose de sorafenib utilisée pour supprimer la croissance des xénogreffes de CHC chez les souris femelles SCID était de 30 mg/kg (po par gavage) [36]. En clinique, la posologie recommandée de sorafenib pour le patient est de 400 mg par fois (2*0,2 g), deux fois par jour (800 mg par jour au total). Cette posologie du sorafénib utilisée en clinique contraste avec celle utilisée dans les tests cellulaires (valeur IC50 en μM), probablement en raison de sa faible capacité d'absorption dans des conditions in vivo. Pour l'actéoside, sur la base de son dosage chez la souris (50 mg/kg, ig), sa dose équivalente chez l'homme (60 kg PC) est d'environ 250 mg. Cette posologie est comparable à celle du sorafenib utilisé en clinique et devrait être acceptable pour les patients.

Conclusions En conclusion,Actéoside de cistancheest capable d'exercer un effet antitumoral dans les lignées cellulaires HCC et chez les souris nues portant des xénogreffes de lignées cellulaires HCC, effets éventuellement via l'augmentation des niveaux de p53 ainsi que l'interdiction de KLK et de l'angiogenèse. L'actéoside pourrait être utile comme traitement d'appoint dans le traitement du CHC avancé en clinique.

Références

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Statistiques mondiales sur le cancer 2018 : estimations GLOBOCAN de l'incidence et de la mortalité dans le monde pour 36 cancers dans 185 pays. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Carcinome hépatocellulaire. Nat Rev Dis Amorces. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Carcinome hépatocellulaire à l'ère de l'immunothérapie. Curr Probl Cancer. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Carcinome hépatocellulaire : mécanismes de progression et immunothérapie. Monde J Gastroenterol. 2019;25(25):3151– 67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Controverses dans la gestion du carcinome hépatocellulaire. JHEP Rep. 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Le diagnostic et le traitement du carcinome hépatocellulaire. Semin Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO, et al. Atezolizumab plus Bevacizumab dans le carcinome hépatocellulaire non résécable. N Engl J Méd. 2020;382(20):1894–905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. Glycosides monoterpénoïdes et phényléthanoïdes de Ligustrum pédonculaire. Phytochimie. 1994;36(3):709–16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. Détermination HPLC deactéosidedans Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Activités antioxydantes des glycosides phényléthanoïdes de Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113–9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. Une stratégie de synthèse générale et les propriétés anti-prolifération sur les lignées cellulaires du cancer de la prostate pour les glycosides phényléthanoïdes naturels. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I, et al. Cytotoxicité sélective de la substance végétale actéoside contre les cellules tumorales et ses connaissances mécanistes. Rédox Biol. 2018;16:169–78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbascoside : identification, quantification et sensibilisation potentielle des cellules cancéreuses colorectales au 5-FU en ciblant la voie PI3K/AKT. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. L'extrait aqueux de fleur d'Osmanthus fragrans et son actéoside enrichi inhibent la mélanogénèse et la pigmentation induite par les ultraviolets. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Le nouvel inhibiteur de PI3K S1 est en synergie avec le sorafenib dans les cellules cancéreuses pulmonaires non à petites cellules impliquant la signalisation Akt-S6. Enquêter sur de nouveaux médicaments. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Les caractéristiques du cancer : la prochaine génération. Cellule. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Utilité des peptidases liées à la kallikréine (KLK) comme biomarqueurs du cancer. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Potentiel de biomarqueur diagnostique et pronostique des gènes de la famille des kallikréines dans différents types de cancer. Oncocible. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Peptidases liées à la kallicréine (KLK) dans le cancer gastro-intestinal : aspects mécanistes et cliniques. Thromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, et al. Efficacité et innocuité du sorafénib chez les patients de la région Asie-Pacifique atteints d'un carcinome hépatocellulaire avancé : essai de phase III randomisé, en double aveugle et contrôlé par placebo. Lancette Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, et al. Sorafenib dans le carcinome hépatocellulaire avancé. N Engl J Méd. 2008;359(4):378–90.

22. Chanson MJ. Chimiothérapie par perfusion de l'artère hépatique pour le carcinome hépatocellulaire avancé. Monde J Gastroenterol. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. L'extrait aqueux d'Anisomeles India et son composé purifié exercent une activité anti-métastatique en inhibant l'activation de NF kappaB/AP-1-MMP-9 dépendante dans les cellules MCF-7 du cancer du sein humain. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B, et al. Effet du verbascoside sur l'apoptose et les métastases dans le carcinome épidermoïde oral humain. Int J Cancer. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Effet anticancéreux synergique de la chimiothérapie du glioblastome à base d'actéoside et de témozolomide. Int J Mol Med. 2019 ; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Actéoside médie la chimioprévention de la carcinogenèse hépatique expérimentale par le biais du stress oxydatif et de l'apoptose régulés par STAT-3. Environ Toxicol. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Métabolites de l'Actéoside alimentaire : profils, isolement, identification et capacités hépatoprotectrices. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. L'actéoside inhibe l'apoptose dans les lésions hépatiques induites par la D-galactosamine et les lipopolysaccharides. Vie Sci. 1999;65(4):421–30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Effet protecteur de l'actéoside sur les lésions hépatiques immunologiques induites par Bacillus Calmette Guerin plus lipopolysaccharide. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. L'extrait riche en glycosides de phényléthanoïdes de fleurs parfumées d'Osmanthus: études de toxicité aiguë et subchronique. J Ethnopharmacol. 2016;187:205–12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Kallikréines tissulaires humaines : une famille de nouveaux biomarqueurs du cancer. Clin Chem. 2002;48(8):1198–205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Comparaison de l'expression des récepteurs tissulaires de la kallikréine et de la kinine dans les ulcères gastriques et les néoplasmes. Int Immunopharmacol. 2001;1(12):2063–80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbinding protein supprime la croissance du carcinome hépatocellulaire par une activité antiangiogénique. Cancer Lett. 2007;257(1):97–106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. L'augmentation de la protéine p53 sensibilise le cancer du poumon non à petites cellules au paclitaxel et au cisplatine in vitro. Anticancer Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Le verbascoside favorise l'apoptose en régulant la signalisation HIPK2-p53 chez l'homme cancer colorectal. BMC Cancer. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib bloque la voie RAF/MEK/ERK, inhibe l'angiogenèse tumorale et induit l'apoptose des cellules tumorales dans les cellules hépatocellulaires. modèle de carcinome PLC/PRF/5. Cancer Rés. 2006;66:11851–8.