Première partie Polarisation de la microglie M1 réprimée par les actéosides via la voie de signalisation NF-κB inhibée et la récupération de la fonction mitochondriale médiée par l'AMPK

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PARTIE 1 Comment les Actéosides de Cistanche améliorent-ils la vitalité des cellules cérébrales et soulagent-ils la maladie d'Alzheimer ?

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Mots clés de recherche : actéoside, cellules BV-2, métabolisme, ARN-seq, mitochondries, neuroin§ammation

Résumé

Contexte : La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme de démence la plus fréquente. Alors queactéoside(ACT), un composéisolédeCistanche tubulosa, possèdepropriétés neuroprotectrices. Cependant, le mécanisme sous-jacent dans la régulation de la polarisation de la microglie reste mal défini. Méthodes : Ici, le modèle de MA induit par AlCl3- chez les larves de zèbres a été appliqué pour découvrir l'efficacité thérapeutique de l'ACT. Des cellules BV-2 ont été utilisées pour démontrer le rôle de l'ACT sur la polarisation de la microglie. Séquence d'ARN, HPLC-Q-TOF-MS, western blot et docking moléculaire ont été combinés pour con¦rmer son mécanisme.

Résultats : L'ACT a significativement amélioré la dyskinésie expérimentale et les troubles du système nerveux chez le zèbre. Par la suite, il a supprimé la polarisation M1 et favorisé le phénotype M2 dans les cellules BV -2 induites par le LPS. Nous avons d'abord démontré que l'ACT exerçait un impact transcriptomique profond, qui impliquait la régulation des voies de signalisation clés dans l'inflammation, la biosynthèse de l'arginine, ainsi que la biosynthèse du pantothénate et du CoA, en corrélation avec la fonction des mitochondries. Le traitement ACT a réduit la polarisation de la microglie M1 en inhibant la voie de signalisation NF-κB. Et les voies métaboliques ont été confirmées par HPLC-Q-TOF-MS. De plus, l'ACT a corrigé les ROS excessifs pour restaurer la fonction des mitochondries grâce à la régulation à la hausse de la PGC-1 et de l'UCP-2 médiée par l'AMPK, conformément aux changements métaboliques. Curieusement, l'ACT peut se lier directement à la fois au NF-κB et à l'AMPK, comme en témoigne l'amarrage moléculaire. Conclusions : La recherche a fourni un mécanisme infusif de l'ACT et a illustré une nouvelle perspective basée sur le dysfonctionnement mitochondrial pour révéler le lien entre le métabolisme et la polarisation de la microglie.

Arrière plan

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative courante accompagnée de troubles cognitifs et de dyskinésie[1]. Elle se caractérise par une perte neuronale sévère, des plaques séniles et des enchevêtrements neurobrillaires[2]. La pathogenèse de la MA est multidimensionnelle et liée à la neuro-inflammation. La neuro-inflammation est entraînée par l'activation des cellules gliales, étroitement liée au développement de la MA [3, 4]. Au cours de la progression et de l'exacerbation de la neuro-inflammation, la microglie est considérée comme le facteur clé. Les microglies sont les principales cellules immunitaires du système nerveux central. Il est étroitement associé à une cascade de processus, contenant le développement du cerveau, maintenant un environnement neutre, ainsi que répondant aux blessures et à la réparation[1]. De plus, la microglie peut être stimulée vers un phénotype M1 et l'expression de cytokines pro-inflammatoires est augmentée lorsque des maladies liées à la neuro-inflammation telles que la MA surviennent [5]. Des études démontrent également que la polarisation vers le phénotype M1 s'accompagne souvent de troubles métaboliques[6], provoquant un déséquilibre du métabolisme énergétique et un dysfonctionnement mitochondrial[7]. Ces changements indésirables sont dérivés de la neurodégénérescence, voire de la MA.

Actéoside(ACT), un glycoside phényléthanoïde, est principalement dérivé deCistanchetubuleux. De plus en plus de preuves suggèrent queLOIpossédait de nombreuses propriétés pharmacologiquesactivités, y compris des effets neuroprotecteurs[8], anti-inflammatoires[9] et antioxydants[10]. En particulier, il a été rapporté que l'ACT améliore l'apprentissage et les troubles de la mémoire ainsi que la régulation positive du métabolisme énergétique chez les rats induits par la streptozotocine [11]. Il a également été suggéré d'inhiber la mort cellulaire apoptotique neuronale et les dommages mitochondriaux chez les souris expérimentales d'encéphalomyélite auto-immune [12]. Cependant, moins d'études se sont concentrées sur l'effet de l'ACT sur la polarisation de la microglie M1/M2. En particulier, divers mécanismes, tels que la réparation de la fonction des mitochondries et la régulation du métabolisme cellulaire, n'ont pas été réalisés. De plus, le mécanisme deLOIcontribué à la polarisation M1/M2 de la microglie est restée inexplorée. Le présent rapport visait à étudier l'efficacité thérapeutique de l'ACT ainsi que le mécanisme moléculaire sous-jacent deLOIdansUN D. Ici,LOIont montré un effet neuroprotecteur significatif chez les larves de poisson zèbre MA induites par AlCl3-. De plus, ACT inhibe efficacement la polarisation M1 et favorise le phénotype M2 dans les cellules BV -2 induites par le LPS. Séquençage d'ARN (ARN-Seq) intégré à la méthode métabolomique pour mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de l'ACT dans la régulation de la polarisation de la microglie. L'interaction entre le métabolisme et la polarisation de la microglie en termes de fonction mitochondriale a été étudiée. Cette étude apportera un nouveau respect pour la poursuite des recherches sur l'ACT en tant qu'agent thérapeutique potentiel pour le traitement de la MA.

Méthodes

Regroupement d'animaux et de modèles

Des zèbres de type sauvage (souche AB, 4 mois) ont été choisis dans cette étude (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Ils ont été maintenus sous un cycle lumière/obscurité de 14/10 h à 28 degrés, selon la méthode précédente[13]. L'engrais naturel et les embryons normalement développés ont été générés et cultivés jusqu'à 3 jours après la fécondation (pdf) dans un incubateur d'éclairage. Toutes les expériences sur le poisson zèbre ont été réalisées sous la supervision du Comité d'éthique animale de l'Université pharmaceutique de Chine. Les larves de poisson zèbre ont été divisées en six groupes et traitées de 3 pdf à 7 pdf : groupe témoin, groupe modèle, groupe modèle plus chlorhydrate de donépézil (DPZ), modèle plus groupes ACT. Le groupe témoin a été maintenu dans le milieu avec 0,2 % de DMSO et le groupe modèle a été traité avec 150 μM d'AlCl3 (pH 5,8). Le groupe modèle plus DPZ a été co-traité avec AlCl3 et 8 μM de DPZ. Le modèle plus les groupes ACT ont été co-traités avec AlCl3 et différentes concentrations d'ACT (200, 100, 50 μM). L'ACT (pureté HPLC supérieure ou égale à 98 %) a été obtenu auprès de Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Chine). AlCl3·6H2O et DPZ ont été achetés auprès de Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shangai, Chine).

Analyse comportementale Page 3/34Les mouvements des larves de poisson zèbre ont été enregistrés avec un analyseur comportemental ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) à 28 degrés. Brièvement, les paramètres comportementaux et le traitement des résultats étaient cohérents avec la méthode que nous avons établie précédemment [13]. Ici, la vitesse moyenne (AS), le changement de vitesse (ΔS), le taux de récupération de la dyskinésie (DRR) et l'efficacité de la réponse (RE, pourcentage) ont été sélectionnés pour évaluer la récupération de la dyskinésie chez le poisson zèbre.

Détermination de l'activité de l'acétylcholinestérase (AChE) et de la choline acétyltransférase (ChAT)

Après traitement de 3 pdf à 7 pdf, des larves de poisson zèbre ont été collectées pour mesurer l'activité AChE et ChAT.

Sur la base du protocole du fabricant, l'activité a été détectée par les kits ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Chine). Et les concentrations en protéines de différents échantillons ont été déterminées par la méthode BCA

Cultures cellulaires et traitements

La lignée cellulaire BV-2 (lignée cellulaire microgliale murine immortalisée) a été achetée auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Ils ont été cultivés dans du DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Chine). Le milieu a été complété avec 10 % de FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/mL de pénicilline, ainsi que 100 mg/mL de streptomycine, avec 95 % d'air/5 % de CO2 à 37 degrés. Les cellules BV-2 ont été incubées avec ACT (50, 25, 12,5 μM) ou stimulées avec du lipopolysaccharide (LPS, 1 ug/mL; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) pendant 24 h. Enfin, toutes les cellules ou le surnageant ont été collectés pour les différentes analyses.

Essai de viabilité cellulaire

Le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine) a été utilisé pour évaluer la viabilité des cellules BV-2. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à puits 96- (1 × 104 cellules/puits, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.). En bref, le milieu a été retiré à la fin du traitement et 100 μL de milieu sans sérum contenant une solution de CCK -8 ont été ajoutés à chaque puits pendant 2 h à 37 degrés. L'absorbance a été mesurée à 450 nm avec un lecteur de microplaques (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA). La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage du groupe témoin. L'expérience a été répétée trois fois.

Essai de production d'oxyde nitrique (NO)

Le NO a été déterminé en mesurant les niveaux de nitrite dans le surnageant de culture BV-2 à l'aide du réactif de Griess. Brièvement, à la fin du traitement, le milieu (100 μL) a été transféré dans une nouvelle plaque 96-puits. Le même volume de réactif de Griess a été ajouté dans chaque puits et mis à réagir pendant 15 min dans l'obscurité. L'absorption à 540 nm a été déterminée par un Microplate Reader.

Niveaux de cytokines inflammatoires dans le surnageant

Les concentrations de TNF-, IL-1 et IL-10 dans le surnageant de cellules BV-2 ont été déterminées par des kits ELISA conformément aux instructions du fabricant (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Chine ).

Observation de la morphologie cellulaire

Pour déterminer l'effet de l'ACT sur la polarisation M1/M2 des cellules BV-2, les cellules ont été étalées dans une boîte à puits 6- et observées au microscope inversé (Nikon ECLIPSE Ti2, Japon).

Détermination du métabolisme cellulaire par analyse HPLC-Q-TOF-MS

Les cellules BV{{0}} ont été ensemencées séparément dans un plat 6-puits (n=6/groupe). Après traitement, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid. Puis immédiatement exposé à l'azote liquide pour supprimer le métabolisme des cellules. Les cellules ont été récoltées avec du méthanol froid à 80 % (1 mL/puits) et la suspension a été transférée dans un tube Eppendorf de 2 mL. Pour faciliter la précipitation des protéines, vigoureusement vortexé pendant 1 min et centrifugé à 13,000 tr/min pendant 15 min à 4 degrés. La suspension cellulaire a été transférée dans un nouveau tube Eppendorf de 2 ml et séchée sous un courant d'azote et stockée à -80 degré jusqu'à l'analyse. Le résidu séché a été reconstitué dans 15{{40}} μL d'acétonitrile à 25 % pré-refroidi. Afin d'assurer la stabilité et la précision de l'analyse de séquence, des volumes égaux (1 0 μL) de chaque échantillon de cellule ont été combinés en tant qu'échantillons de contrôle de qualité (CQ). Lors de la détection des métabolites, ces échantillons ont été injectés tous les six échantillons cellulaires pour con¦rmer leur stabilité. Une aliquote de 1 μL a été injectée pour HPLC-Q-TOF-MS. L'analyse HPLC-Q-TOF-MS a été réalisée sur le système HPLC Agilent 1290 connecté au spectromètre de masse à temps de vol quadripolaire Agilent 6530 (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, Californie, États-Unis). La séparation a été réalisée sur une colonne ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1×100 mm, 1.7 μm). La phase mobile était composée de 0,1 % d'acide formique-eau (v/v ; A) et d'acétonitrile (B). Le débit a été fixé à 0,4 mL/min avec la condition d'élution optimale en gradient suivante : 0 à 2 min, 5 % de B ; 2 à 20 min, 5 % à 95 % B (mode ions positifs) ; 0 à 2 min, 5 % B ; 2 à 20 min, 5 % à 95 % B (mode ions négatifs). Les paramètres de fonctionnement du spectromètre de masse ont été définis comme suit : température du gaz, 320 degrés ; gaz de séchage, 10 L/min ; nébuliseur, 35 psi ; VCap, 4000 V; fragment, 120 V. Les données brutes ont été exploitées sous MassHunter Workstation Software version B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Les données brutes ont été prétraitées par la plateforme XCMS. L'analyse en composantes principales (ACP) et l'analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA) des données normalisées ont été réalisées avec MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). Combiné avec la littérature, les métabolites différentiels (VIP > 1, T-test P < 0,05)="" ont="" été="" identifiés="" sur="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" enfin,="" l'analyse="" des="" voies="" a="" été="" réalisée="" avec="">

Mesure du potentiel de membrane mitochondriale (MMP)

La MMP a été détectée à l'aide de la §sonde fluorescente JC-1 (Beyotime, Chine) conformément aux instructions du fabricant. En bref, les cellules de différents groupes ont été rincées avec du PBS et incubées avec une solution de coloration JC-1 pendant 20 min à 37 degrés. Après coloration, les cellules ont été lavées deux fois en utilisant un tampon de coloration. Ensuite, des signaux fluorescents ont été détectés par cytométrie en flux (BD Accuri C6).

Mesure de l'adénosine 5'-triphosphate mitochondriale (ATP)

La concentration d'ATP dans les mitochondries a été détectée par un kit de dosage ATP (Beyotime, Chine) conformément aux instructions du fabricant. En bref, le milieu de culture des cellules BV-2 de différents groupes a été jeté et les cellules ont été homogénéisées avec un tampon de lyse sur de la glace. Le surnageant obtenu après centrifugation (12,000 g, 5 min) a été utilisé pour déterminer la concentration en ATP. La luminescence (réaction de §uorescéine catalysée par la luciférase) a été détectée par le lecteur de microplaques multimode EnVision (PerkinElmer).

Mesure du niveau d'espèces réactives de l'oxygène intracellulaire (ROS)

Le kit de dosage ROS (Beyotime, Chine) a été utilisé pour mesurer le niveau de ROS. Les cellules des différents groupes ont été incubées avec DCFH-DA (10 μM) pendant 20 min à 37 degrés. Après le chargement de la sonde, les cellules ont été lavées trois fois avec du DMEM. Ensuite, des signaux fluorescents ont été détectés par cytométrie en flux (BD Accuri C6)

Microscopie électronique à transmission (MET)

Les cellules BV-2 ont été ensemencées dans une boîte à puits 6-. Le milieu a été retiré et 1 ml de glutaraldéhyde à 2,5 % a été rapidement ajouté à chaque puits. Ensuite, les cellules ont été transférées dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et centrifugées à 1000 tr/min pendant 3 min. Les cellules ont été fixées pendant une nuit avec du nouveau glutaraldéhyde à 2,5 % à 4 degrés. Après ¦xation, déshydratation et enrobage, les cellules ont été observées avec un microscope électronique à transmission HT7800 (Hitachi, Tokyo, Japon).

RNA-seq et analyse de données bioinformatiques

ARN total des cellules BV-2 (n=3/groupe) ont été extraits à l'aide du réactif Trizol (Vazyme Biotech, Chine) conformément aux instructions du fabricant du réactif. Tous les échantillons analytiques ont été envoyés à Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) pour effectuer le test de séquence d'ARN. Les données ont été analysées sur la plateforme en ligne gratuite de Majorbio Cloud Platform. Les paramètres pour l'analyse de l'expression différentielle étaientP-ajuster < 0.05 et |log2FC|Plus grand ou égal à1. Les données de séquence originales ont été soumises à la base de données du NCBI Sequence Read Archive (SRA).

Réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR)

L'ARN total des cellules BV-2 de chaque groupe a été récolté à l'aide d'un réactif d'isolement RNA-easyTM de 500 μL (Vazyme Biotech, Chine) et une réaction de transcription inverse a été réalisée avec FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Chine). . Les réactions ont été réalisées selon le protocole du fabricant. L'ADNc a été soumis à des tests qRT-PCR avec des amorces spécifiques et TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Chine). Les amorces sont répertoriées dans le tableau S1 (voir fichier supplémentaire 1) et l'actine a été utilisée comme contrôle interne. La méthode 2-ΔΔCT a été utilisée pour l'analyse quantitative.

Analyse Western blot

Les cellules BV-2 ont été lysées par un tampon de lyse RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Chine) contenant 1 % de cocktail d'inhibiteurs de protéase (Thermo Fisher) pour obtenir la protéine totale. Une SDS-PAGE à 10 % a été réalisée pour séparer les protéines, qui ont été transférées sur des membranes NC. Après blocage avec 5 % de lait écrémé/BSA pendant 2 h, les membranes ont été incubées avec AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), Anticorps p-NF-κB (ABclonal) ou GAPDH (ABclonal) dans 5 % de TBST à 4 degrés pendant la nuit. Les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (ABclonal) pendant 1 h à température ambiante. Le substrat de transfert Western ECL à haute signature (Tanon, Chine), le système d'imagerie Gel (Tanon, Chine) et le logiciel ImageJ ont été utilisés pour la visualisation et la quantification.

Amarrage moléculaire

Les analyses d'amarrage moléculaire ont été effectuées à l'aide du logiciel Autodock (version 4.2). L'affinité entre l'ACT et les protéines a été observée par le logiciel AutodockTools. Les structures protéiques tridimensionnelles (3D) de l'AMPK (PDB ID : 5g5j) et du NF-κB (PDB ID : 4q3j) ont été extraites de la banque de données sur les protéines.

analyses statistiques

Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart type (SD). Les différences entre les différents groupes ont été analysées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA), suivie du multiple de Tukey.

Résultats

L'ACT a atténué la dyskinésie et amélioré la fonction du système cholinergique chez les larves de poisson zèbre

Le modèle de MA induit par AlCl3- chez les larves de poisson zèbre a été utilisé pour démontrer l'effet de l'ACT sur la MA. Tout d'abord, le mouvement des larves de poisson zèbre dans les cycles lumière / obscurité a été observé et leurs parcours de nage ont été enregistrés (Fig. 1a, 1b). AS et ΔS du mouvement du poisson zèbre induit par AlCl3 dans le temps correspondant après l'administration ont été calculés. Les résultats ont montré que différentes doses d'ACT augmentaient efficacement l'AS et l'AS du poisson zèbre (Fig. 1c). DRR et RE ont découvert une comparaison plus intuitive d'ACT et de DPZ (Fig. 1d). En conséquence, l'ACT a atténué la dyskinésie, présentant des effets similaires à ceux de la DPZ. Il est généralement admis que le système cholinergique joue un rôle important dans les processus d'apprentissage et de mémoire. Ainsi, les activités de l'AChE et de la ChAT ont été utilisées pour révéler l'effet de l'ACT. Exposition à l'AlCl3 chez le poisson zèbre avec altération cholinergique cérébrale (Fig. 1e). Il était remarquable que le traitement ACT supprime l'activité de l'AChE. De plus, l'activité de la ChAT présentait une diminution après le traitement à l'ACT. En bref, l'ACT a montré un impact profond sur la fonction du système cholinergique chez les larves de poisson zèbre AD induites par AlCl3-.

L'ACT a supprimé la polarisation M1 et favorisé la polarisation M2 dans les cellules BV -2 induites par le LPS

Les effets de l'ACT sur la polarisation de la microglie ont été étudiésin vitroen utilisant des cellules microgliales BV-2. Le LPS a significativement diminué la viabilité des cellules BV-2 après avoir été traité 24 h. Heureusement, l'ACT a augmenté la viabilité cellulaire des cellules BV -2 induites par le LPS (Fig. 2a). De plus, la morphologie des cellules BV-2 a été observée. Après 24 h de stimulation LPS, il a montré que les cellules BV-2 subissaient un état de polarisation M1. Et les changements morphologiques ont été prévenus par le co-traitement ACT (Fig. 2b). De plus, les résultats ont indiqué que contrairement aux cellules BV-2 stimulées par le LPS, les cellules BV-2 co-traitées avec ACT affichaient une suppression significative du TNF- (Fig. 2c), IL-1 ( Fig. 2d) et NO (Fig. 2f) expressions dans le surnageant cellulaire. Ce sont des cytokines pro-inflammatoires classiques comme indicateurs de la polarisation de la microglie M1. Semblables aux résultats d'ELISA, les résultats de la qPCR ont découvert que les expressions d'ARNm de TNF-, d'oxyde nitrique (iNOS), d'IL-1 et de CD86 étaient significativespeu inhibé par le traitement ACT par rapport au groupe LPS (Fig. 3a). De plus, nous avons mesuré les niveaux de polarisation de la microglie M2 par ELISA (Fig. 2e) et qPCR (Fig. 3b), dont les résultats ont indiqué que l'ACT augmentait significativement les niveaux d'expression des marqueurs liés à la microglie M2 (IL-10, CD206 , TGF- et Arg-1). Pris ensemble, ces résultats ont montré que l'ACT supprimait la polarisation de la microglie M1 et favorisait le phénotype M2.

ACT a régulé la polarisation M1/M2 via l'inhibition de la voie de signalisation NF-κB dans les cellules BV -2 induites par le LPS

L'analyse transcriptomique a été réalisée par RNA-seq pour comprendre le mécanisme de l'ACT dans les cellules BV-2 à un niveau global. L'ACP a montré que les groupes contrôle, LPS et ACT pouvaient être bien distingués (Fig. 4a). Il a révélé 899 gènes exprimés de manière différentielle (DEG) entre le groupe témoin et le groupe LPS, tandis que 49 DEG se trouvaient entre le groupe LPS et le groupe ACT (Fig. 4b). De manière cohérente, l'analyse d'enrichissement de Gene Ontology (GO) (Fig. 4c) et l'analyse d'enrichissement de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) (Fig. 4d) ont révélé que l'effet de l'ACT était impliqué dans la voie de signalisation NF-κB. L'ensemble des gènes associés à la voie de signalisation NF-κB a été davantage confirmé et leur homéostasie a certainement été affectée par le LPS. Comme prévu, ACT a significativement affecté leurs expressions (Fig. 4e). Une voie de signalisation NF-κB est une voie classique pour réguler la progression de l'inflammation, aboutissant finalement à la libération de facteurs pro-inflammatoires. Pour obtenir un support mécaniste, une protéine clé de la voie de signalisation NF-κB a été évaluée par analyse Western blot. La stimulation par le LPS a conduit à l'activation de NF-κB, associée à la promotion de la polarisation M1. Conformément à l'analyse ARN-seq, l'ACT a inhibé la phosphorylation de NF-κB stimulée par le LPS (Fig. 4f). Par conséquent, l'ACT a soulagé la polarisation M1 induite par le LPS via la voie de signalisation NF-κB dans les cellules BV-2.

L'ACT a altéré la biosynthèse de l'arginine ainsi que la biosynthèse du pantothénate et du CoA dans les cellules BV -2 induites par le LPS

L'ARN-seq a démontré que les voies affectées par l'ACT incluaient également la biosynthèse de l'arginine (Arg) ainsi que la biosynthèse du pantothénate et du CoA (Fig. 4d). Et il a été suggéré que la stimulation du LPS provoque des troubles du métabolisme des cellules BV-2 associés à la polarisation M1[14]. Ainsi, un métabolome cellulaire non ciblé par HPLC-Q-TOF-MS a été utilisé pour identifier l'effet de l'ACT sur le métabolisme cellulaire. PCA (Fig. 5a) et PLS-DA (Fig. 5b) ont montré que les groupes contrôle, LPS et ACT pouvaient être bien distingués en fonction des métabolites intracellulaires. Les niveaux de divers métabolites dans les cellules BV -2 induites par le LPS ont été modifiés après le traitement par ACT (Fig. 5c). Par rapport au groupe témoin, il y avait 11 métabolites modifiés de manière significative dans le groupe LPS (Tableau S2, voir Supplémentaire ¦le 2). Alors que 14 métabolites ont été nettement modifiés après le traitement de l'ACT (Tableau S3, voir Supplémentaire le 3), impliquant 11 voies métaboliques (Fig. 5d). L'effet de l'ACT consistait principalement à réguler le métabolisme des acides aminés (biosynthèse de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane, métabolisme de la D-glutamine et du D-glutamate, biosynthèse de l'Arg, métabolisme de la phénylalanine), le métabolisme des nucléotides (métabolisme des purines, métabolisme de la pyrimidine), le métabolisme énergétique (métabolisme de l'azote métabolisme), ainsi que le métabolisme des cofacteurs et des vitamines (biosynthèse du pantothénate et du CoA). Fait intéressant, les voies métaboliques obtenues par le métabolome étaient compatibles avec l'ARN-seq, y compris la biosynthèse de l'Arg ainsi que la biosynthèse du pantothénate et du CoA. Ce qui précède a montré que l'ACT pouvait réguler la biosynthèse de l'Arg ainsi que la biosynthèse du pantothénate et du CoA dans les cellules BV -2 stimulées par le LPS.

Act Mitigated Lps-induced Bv-2 Dysfonctionnement mitochondrial

Les mitochondries sont au cœur des voies métaboliques. La preuve évolue que les mitochondries sont des acteurs clés dans la polarisation microgliale M1/M2. Des recherches antérieures ont démontré que le LPS pouvait provoquer un dysfonctionnement mitochondrial. Un aperçu de l'état des mitochondries dans la morphologie et la distribution cellulaire a été jugé par TEM. Après stimulation par le LPS, les cellules BV-2 ont montré une condensation de la chromatine du noyau, une diminution du cytoplasme, ainsi que moins de mitochondries (Fig. 6a). De plus, les crêtes mitochondriales du groupe LPS étaient désorganisées ou même disparues, présentant une cristolyse partielle, une taille réduite et une morphologie de forme ronde. Fait intéressant, le traitement ACT pourrait atténuer les changements morphologiques induits par le LPS dans les mitochondries. Tour à tour, nous avons examiné la fonction des mitochondries des cellules BV-2 traitées au LPS, y compris les MMP, et la production d'ATP mitochondriale. La production de MMP (Fig. 6b, 6c) et d'ATP dans les mitochondries (Fig. 6d) a été significativement améliorée dans les cellules traitées avec ACT par rapport à celles du groupe LPS. Le dysfonctionnement mitochondrial peut être lié au niveau accru de ROS dans la cellule. L'analyse par cytométrie en flux a révélé que le contenu des ROS était en surcharge dans le groupe LPS (Fig. 6e, 6f). Heureusement, ACT a éliminé les ROS excessifs. Cela suggère que l'ACT pourrait restaurer la fonction des mitochondries en éliminant les ROS.

ACT a restauré la fonction des mitochondries grâce à la régulation à la hausse de PGC-1 et UCP-2

Le récepteur activé prolifératif des peroxysomes-co-activateur-1 (PGC-1) joue un rôle important dans la biogenèse mitochondriale[15]. La stimulation du LPS a diminué l'expression de PGC-1, présentant un dysfonctionnement des mitochondries. Remarquablement, l'expression de l'ARNm et des protéines du gène PGC-1 a été significativement inversée par le traitement à l'ACT dans les cellules BV-2 traitées au LPS (Fig. 7a). La protéine de découplage mitochondriale-2 (UCP-2) était également connue pour réguler les fonctions mitochondriales. En tant que protéine en aval de PGC-1, elle peut contrôler la dépolarisation MMP induite par le LPS et la production de ROS. Des rapports récents indiquent qu'il est au cœur du processus d'activation microgliale, avec une régulation opposée de la polarisation M1 et M2[16]. Les résultats du Western blot ont montré que le niveau de protéine UCP-2 était diminué après la stimulation par le LPS. Le co-traitement du LPS et de l'ACT pourrait réguler positivement l'expression de l'UCP -2 par rapport au traitement LPS. Le niveau d'expression de l'ARNm de l'UCP -2 a également montré des changements similaires (Fig. 7b). Pris ensemble, ACT a restauré la fonction des mitochondries grâce à la régulation à la hausse de PGC-1 et UCP-2.

ACT a réprimé la polarisation M1 de la microglie grâce à la récupération de la fonction mitochondriale via l'activation de l'AMPK

La protéine kinase activée par l'AMP (AMPK), en tant que capteur d'énergie cellulaire clé, joue un rôle important dans le maintien de l'équilibre du métabolisme cellulaire. Dans le même temps, PGC-1 est une protéine en aval de l'AMPK. Les résultats ont révélé que le LPS inhibait l'activation de l'AMPK, entraînant des troubles du métabolisme cellulaire et un dysfonctionnement mitochondrial. Il convient de noter que l'ACT pourrait augmenter de manière dose-dépendante l'expression protéique de p-AMPK (Fig. 8a). Il est suggéré que l'ACT pourrait augmenter l'expression de PGC-1 et restaurer la fonction mitochondriale en activant la voie de signalisation AMPK. Dans cette étude, pour déterminer si l'activation de l'AMPK a contribué à l'effet de régulation de l'ACT sur la polarisation M1/M2, le composé C (CC) a été utilisé pour inhiber l'effet de l'AMPK. Contrairement au niveau de NO régulé à la baisse dans le groupe de traitement ACT, le CC a partiellement bloqué l'effet de l'ACT sur le niveau de NO (Fig. 8d). Sur la base de ces résultats, ACT pourrait réguler la polarisation M1/M2 des cellules BV-2 par l'activation de l'AMPK.

L'ACT se lie à et inhibe NF-κB ainsi que l'AMPK activé

L'amarrage moléculaire a été appliqué pour confirmer si l'ACT se lie aux protéines NF-κB et AMPK. Les résultats ont démontré que l'énergie de liaison de l'ACT et du NF-κB était de - 8,4 kcal/mol, celle de l'ACT et de l'AMPK était de - 10,8 kcal/mol. Des affinités significatives ont vérifié que l'ACT est directement lié au NF-κB et à l'AMPK (Fig. 9). Par la suite, les modes de liaison et les interactions possibles au sein de la poche d'acides aminés ont été explorés plus en détail, notamment Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149 et Tyr A227 de NF. -κB (Fig. 9c) ainsi que Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119 et Thr A224 de l'AMPK (Fig. .9f). Ces résultats indiquent que l'ACT pourrait affecter directement NF-κB et AMPK pour atténuer la polarisation M1 de la microglie BV-2 et favoriser le phénotype M2.