Partie 1 L'actéoside supprime l'ostéoclastogenèse médiée par RANKL en inhibant l'induction de C-Fos et la voie NF-kB et en atténuant la production de ROS

Partie 1 Comment les Actéosides favorisent-ils la croissance osseuse ?

Pour plus d'informations :ali.ma@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Institut de recherche en médecine clinique de l'Université nationale de Chonbuk, Institut de recherche biomédicale de l'Université nationale de Chonbuk Hôpital, Jeonju, Chonbuk, Corée du Sud, 2 Département d'orthodontie, Institut des biosciences orales et École de médecine dentaire, Université nationale de Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Corée du Sud, 3 Département des sciences des matériaux bioactifs, Centre de recherche sur les matériaux bioactifs, Université nationale de Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Corée du Sud

Résumé

De nombreuses études ont rapporté que les cytokines inflammatoires sont des médiateurs importants pour l'ostéoclastogenèse, provoquant ainsi une résorption osseuse excessive et l'ostéoporose.Actéoside, le principal composé actif de Rehmannia glutinosa, largement utilisé dans la médecine traditionnelle orientale, possède des potentiels anti-inflammatoires et antioxydants. Dans cette étude, nous avons constaté que le côté CTE inhibait nettement la différenciation et la formation des ostéoclastes à partir des macrophages de la moelle osseuse (BMM) et des macrophages RAW264.7 stimulés par l'activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire kappaB (NF-kB) (RANKL). Le prétraitement par actéoside a également empêché la résorption osseuse par les ostéoclastes matures de manière dose-dépendante. L'actéoside (10 mM) a atténué l'activation stimulée par RANKL de la kinase p38, des kinases régulées par le signal extracellulaire et de la kinase N-terminale c-Jun, et a également supprimé l'activation de NF-kB en inhibant la phosphorylation de la sous-unité p65 et de l'inhibiteur kBa. De plus, l'augmentation médiée par RANKL de l'expression de c-Fos et du facteur nucléaire des lymphocytes T activés, cytoplasmique 1 (NFATc1), et de la production du facteur de nécrose tumorale-a, l'interleukine (IL)-1b , et IL-6 étaient apparemment inhibés par un prétraitement à l'actéoside. De plus, l'actéoside oral a réduit la perte osseuse induite par l'ovariectomie et la production de cytokines inflammatoires à des niveaux de contrôle. Nos données suggèrent queactéosideinhibe la différenciation et la maturation des ostéoclastes à partir des précurseurs ostéoclastiques en supprimant l'activation induite par RANKL des protéines kinases activées par les mitogènes et des facteurs de transcription tels que NF-kB, c-Fos et NFATc1. Collectivement, ces résultats suggèrent queactéosidepeut agir comme un agent anti-résorptif pour réduire la perte osseuse en bloquant l'activation des ostéoclastes.

Pour plus d'informations, veuillez contacter :ali.ma@wecistanche.com

Cliquez sur les produits d'effets Cistanche

Introduction

L'os est constamment remodelé par une activité équilibrée des ostéoclastes et des ostéoblastes [1]. Les ostéoclastes proviennent de cellules précurseurs hématopoïétiques de la lignée monocyte/macrophage, tandis que les ostéoblastes sont de la lignée mésenchymateuse [2]. L'activation anormale des ostéoclastes ou la réduction de l'ostéoblastogenèse peuvent perturber l'homéostasie osseuse, provoquant éventuellement des maladies telles que l'ostéoporose, l'arthrite et le cancer des os [3,4]. L'ostéoporose est une maladie osseuse courante qui entraîne un risque accru de fracture. La forme la plus courante d'ostéoporose est causée par une carence en œstrogènes chez les femmes ménopausées. Les médicaments tels que les corticoïdes et les antiépileptiques peuvent également provoquer un déséquilibre entre la résorption et la formation osseuse, ce qui peut entraîner une ostéoporose [5]. De nombreux inhibiteurs anti-résorption, notamment les bisphosphonates, la calcitonine, les œstrogènes et les modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes, ont été utilisés pour traiter l'ostéoporose. Ces inhibiteurs maintiennent la masse osseuse en inhibant la fonction des ostéoclastes [6]. La thérapie de remplacement des œstrogènes est le traitement le plus populaire pour prévenir et traiter l'ostéoporose post-ménopausique. Cependant, la thérapie de remplacement des œstrogènes à long terme peut augmenter le risque de cancer de l'endomètre et du sein. Par conséquent, de nombreux chercheurs ont concentré leurs efforts sur le développement d'un nouvel agent anti-résorptif qui n'a pas d'effets secondaires [7-10]. Étant donné que les ostéoclastes fonctionnent dans la résorption osseuse, l'inhibition spécifique des ostéoclastes a été considérée comme la cible principale dans de nombreuses études. Les ostéoclastes sont des cellules géantes multinucléées formées par des progéniteurs mononucléaires de la famille des monocytes/macrophages via la prolifération séquentielle, la différenciation et la fusion de cellules précurseurs hématopoïétiques [11]. Le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et l'activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire (NF)-kB (RANK) (RANKL) sont des facteurs essentiels pour la différenciation des ostéoclastes [12]. De plus, plusieurs cytokines inflammatoires, telles que le facteur de nécrose tumorale (TNF) et l'interleukine (IL)-1b, contribuent à l'ostéoclastogenèse en modulant l'induction du RANKL, de l'ostéoprotégérine et du M-CSF [7,13]. La liaison de RANKL au récepteur RANK de surface cellulaire donne lieu à des complexes de facteurs associés RANKL/RANK/TNFR (TRAF) qui activent séquentiellement NF-kB et les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK), y compris la kinase N-terminale c-Jun (JNK), p38 kinase et la kinase liée au signal extracellulaire (ERK) [14]. Cette activation joue un rôle clé dans la médiation de la différenciation, de l'activation et de la survie des ostéoclastes. RANKL active également l'expression de facteurs de transcription tels que le facteur nucléaire des lymphocytes T activés, cytoplasmique 1 (NFATc1) et Fos, qui sont essentiels au développement des ostéoclastes [ 7,9]. Par conséquent, la signalisation RANKL est considérée comme la cible principale des agents anti-résorption qui suppriment l'activation des ostéoclastes et la perte osseuse.

Actéosideest le principal composé actif de Rehmannia glutinosa, qui est largement utilisé dans la médecine traditionnelle orientale [15,16]. L'actéoside est un puissant antioxydant et possède des activités anti-hépatotoxiques, anti-inflammatoires et anti-nociceptives [17-20]. Nous avons trouvé précédemment queactéosidediminue l'activité de la tyrosinase et la biosynthèse de la mélanine en régulant la signalisation ERK [21], protège contre les dommages gingivaux médiés par les espèces réactives de l'oxygène (ROS) [22] et supprime les dommages cellulaires médiés par les mycotoxines [23]. Ces effets sont étroitement liés àl'actéosidecapacité à supprimer les ROS et à réguler la signalisation médiée par MAPK. En particulier, les ROS sont suggérés pour médier les voies de signalisation induites par RANKL et les événements cellulaires chez les ostéoclastes. Un prétraitement avec des antioxydants a inhibé l'activation induite par RANKL de NF-kB, ERK et IkBa, supprimant ainsi l'ostéoclastogenèse [24]. Ces résultats suggèrent fortement qu'en plus de l'activité anti-inflammatoire, l'activité antioxydante est cruciale pour un agent anti-résorptif, doncactéosidepeut supprimer l'ostéoclastogenèse induite par RANKL.

Dans la présente étude, nous avons cherché à savoir siactéosidea un effet thérapeutique sur la perte osseuse. Nous avons examiné les effets deactéosidesur la différenciation des ostéoclastes et la résorption osseuse et les mécanismes cellulaires associés à l'aide de systèmes expérimentaux in vitro et in vivo.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

Les pratiques de soin et d'utilisation des animaux ont été approuvées par le Comité de l'Université nationale de Chonbuk sur l'éthique dans le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (permis n° CBU 2010-0007). Toutes les expériences de cette étude ont été réalisées conformément aux directives du Animal Care and Use Committee de l'Université.

Souris, produits chimiques et articles de laboratoire

Des souris ICR femelles âgées de quatre semaines ont été achetées chez OrientBio Inc. (Séoul, Corée) et hébergées à 2261 uC et 5565% d'humidité sur un cycle lumière / obscurité de 12 h avec un accès libre à la nourriture et à l'eau. L'actéoside (3,4-dihydroxy-b-phénéthyl-Oa-rhamnopyranose-Syl-(1R3)-4-O-caféoyl-bD-glucopyranoside ; C29H36O15) (Fig. S1) a été isolé des feuilles de Rehmannia glutinosa. Actéoside a été dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant utilisation. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 et M-CSF ont été achetés auprès de systèmes de R & D (Minneapolis, MN, États-Unis). Les anticorps spécifiques à c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa et b-actine ont été obtenus auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Les anticorps pour p-p38 et p38 ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Les kits CalciumAssay et Osteocalcin (OC) EIA ont été achetés auprès de BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) et Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), respectivement, pour déterminer les paramètres biochimiques sériques. Le kit de dosage de la phosphatase acide résistante au tartrate de souris (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) a également été utilisé pour mesurer le taux sérique de TRAP5b. Sauf indication contraire, des produits chimiques supplémentaires ont été obtenus auprès de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, États-Unis) et les articles de laboratoire provenaient de SPL Life Sciences (Pochun, Corée du Sud).

Cultures cellulaires

Des cellules de moelle osseuse ont été obtenues à partir des tibias et des fémurs de souris ICR femelles âgées de 6 semaines selon les méthodes décrites précédemment [25]. La suspension de moelle osseuse a été incubée dans une boîte de culture a100-mm en présence de 50 ng/ml de M-CSF. Après 3 jours, les cellules adhérentes ont été utilisées comme macrophages de la moelle osseuse (BMM) pour induire la différenciation ostéoclastique. Certaines cellules de la moelle osseuse ont également été incubées pendant 48 h sans M-CSF, et les cellules adhérentes ont été cultivées dans un milieu de différenciation des ostéoblastes, comme décrit ailleurs [25]. Les cellules macrophages RAW264.7 ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), de L-glutamine 2 mM et d'antibiotiques. Ces cellules ont été utilisées comme lignée cellulaire homologue pour les BMM afin d'explorer l'effet de l'actéoside sur l'ostéoclastogenèse.

Différenciation ostéoclastique et coloration TRAP

Les BMM ont été prétraités avec diverses concentrations (0–50 mM) d'actéoside pendant 2 h avant d'être stimulés avec 100 ng/ml de RANKL. Les milieux de culture ont été remplacés par des milieux frais aux jours 2 et 5. Après 7 jours d'incubation, les cultures ont été fixées dans du paraformaldéhyde tamponné au PBS à 4 % et colorées avec du TRAP à l'aide d'un kit sigma Aldrich conformément aux instructions du fabricant. Les cellules TRAP-positives ont été comptées en utilisant la microscopie optique, et les cellules contenant 3 noyaux ou plus ont été considérées comme des ostéoclastes. Les cellules RAW 264.7 ont également été exposées à 100 ng/ml de RANKL après un prétraitement avec de l'actéoside pendant 2 h, et après 7 jours d'incubation, les cellules ont été traitées pour la coloration TRAP.

Mesure de la viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été déterminée à l'aide d'un réactif de sel de tétrazolium soluble dans l'eau (WST)-8. En bref, les cellules BMM ou RAW264.7 cultivées dans un milieu de croissance contenant 10 % de FBS et des antibiotiques ont été traitées avec 10 mM d'actéoside ou un composé phénolique tel que la quercétine, la lutéoline, l'apigénine ou l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG). Le réactif WST-8 a été ajouté aux cultures après 48 h d'incubation. Après incubation pendant 4 h supplémentaires, l'absorbance spécifique du WST-8-a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Packard Instrument Co., Downers Grove, Illinois, États-Unis).

Test de résorption osseuse

Les BMM (16 105 cellules/ml) ont été mis en suspension dans un MEM contenant 50 ng/ml de M-CSF et 100 ng/ml de RANKL, puis répartis sur une plaque a24-puits recouverte de nanocristaux de phosphate de calcium (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Corée du Sud) à une densité de 26104 cellules/cm2 avec et sans actéoside. Après incubation pendant 7 jours, les cellules ont été retirées des plaques avec de l'hypochlorite de sodium à 5 % et les informations ont été observées au microscope optique. La surface résorbée a également été mesurée par un analyseur d'images et exprimée en pourcentage de la valeur témoin.

Analyse Western Blot

Des lysats de protéines entières ont été préparés dans un tampon de lyse comme décrit ailleurs [26]. Les protéines cytosoliques et nucléaires ont été préparées comme décrit précédemment [25]. Des quantités égales d'extrait protéique ont été séparées par 12 à 15 % de SDS-PAGE et transférées sur des membranes de difluorure de polyvinyle. Les transferts ont été sondés avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 uC avant incubation avec un anticorps secondaire dans un tampon de blocage pendant 1 h. Les transferts ont été développés avec une chimiluminescence améliorée (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Royaume-Uni) et exposés à un film radiographique (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, États-Unis).

Test d'activité MAPK

Les cellules ont été prétraitées avec de l'actéoside pendant 2 h, puis stimulées avec du RANKL pendant une -30 min supplémentaire. Les activités MAPK ont été déterminées à l'aide de kits de dosage immunométrique, tels que le kit de dosage p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA), le kit de dosage enzymatique p-ERK (Assay Designs) et le kit ELISA sandwich p-SAPK/JNK ( Technologie de signalisation cellulaire, MA, États-Unis). Toutes les procédures ont suivi les instructions du fabricant et l'absorbance a été mesurée par un lecteur de microplaques.

Essai de changement de mobilité électrophorétique (EMSA)

Les réactions de liaison ADN-protéine ont été réalisées pendant 30 min à température ambiante, avec 10 à 15 mg de protéine dans 20 ml de tampon contenant 1 mg/ml de BSA, 0,5 mg/ml de poly (dI-dC), 5 % de glycérol , DTT 1 mM, PMSF 1 mM, Tris-Cl 10 mM (pH 7,5), NaCl 50 mm, 30,000 CPM d'oligonucléotides marqués [a-32P] dCTP et le fragment de Klenow de l'ADN polymérase. Les échantillons ont été séparés sur des gels de polyacrylamide à 6 %, qui ont été séchés et exposés à un film radiographique (Eastman Kodak Co.) pendant 12 à 24 h à 270 uC. Les séquences d'amorces oligonucléotidiques spécifiques de NF-étaient 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 et 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

Dosage de la luciférase NF-kB

Les macrophages RAW264.7 dans des plaques 24-puits ont été transfectés avec 0.8 mg de vecteur rapporteur kB-luciférase en utilisant 2 ml de Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) conformément aux instructions du fabricant. 24h après la transfection, les cellules ont été stimulées avec du RANKL en présence et en absence d'actéoside pendant 24h. Les cellules ont été remises en suspension dans 100 ml de tampon de lyse rapporteur (Promega, Madison, WI, USA). Des quantités égales d'échantillons de protéines ont été placées dans des microplaques à puits 96- et mélangées avec un substrat de luciférase. La luminescence a été mesurée à l'aide d'un luminomètre à microplaque (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Allemagne). Dans cette expérience, un peptide inhibiteur de NF-B perméable (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) a été utilisé comme inhibiteur de kB positif.

Mesure des cytokines

Des cellules BMM ou RAW264.7 ont été stimulées avec RANKL en présence deactéosidedans des 24-plaques de culture à puits. Après 48 h d'incubation, les surnageants de culture ont été collectés et évalués par ELISA à l'aide de kits OptEIATM spécifiques au TNF-a-, IL-1b- et IL-6- selon les instructions du fabricant.

Transcription inverse en temps réel - Réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR)

L'expression de l'ARNm des marqueurs ostéoclastiques, tels que c-Fos, NFATc1 et TNF-a, a été déterminée par RT-PCR en temps réel. En bref, l'ARN total a été extrait des macrophages avec le réactif Trizol conformément aux instructions du fabricant (Invitrogen). L'ADNc a été synthétisé avec 1 mg d'ARN total à l'aide de SuperScriptReverse Transcripatase II et d'amorces (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a été utilisé pour détecter l'accumulation de produit de PCR pendant le cycle avec le système de détection de séquence ABI 7500 (Applied effectué en utilisant quarante 3- cycles de dénaturation à 95 uC pendant 15 secondes, annelage à 60 uC pendant 1 seconde et extension à 72 uC pendant 30 secondes. Toutes les réactions de PCR ont été effectuées au moins en trois exemplaires et les niveaux d'expression ont été normalisés par rapport au gène domestique HPRT dans la même réaction. Cette étude a utilisé les mêmes séquences d'amorces décrites ailleurs [7].

Mesure des ROS intracellulaires

Une solution mère de 29,79-dichlorodihydrofluorescéine-diacétate (DCFH-DA) (50 mM ; Calbiochem, Darmstadt, Allemagne) a été préparée dans du DMSO et conservée à 220 uC dans l'obscurité. En bref, les BMM (106 cellules/ml dans des plaques 6-puits) ont été cultivées avec 50 ng/MLM-CSF pendant 24 h, puis traitées avec différentes concentrations (0 à 10 mM) d'actéoside 2 h avant la stimulation avec 100 m ng/mlRANKL. Après 1 h de co-incubation, ces cellules ont ensuite été incubées avec du DCFH-DA 25 mM pendant 30 min. La fluorescence verte de la 29,79-dichlorofluorescéine (DCF) a été enregistrée à 515 nm (FL 1) à l'aide d'un système FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) et 10,000 événements ont été comptés par échantillon

Induction de l'ostéoporose induite par l'ovariectomie

Des souris ICR femelles (âgées de 6 semaines) ont été utilisées pour cette étude. Les souris ont subi une opération factice (Sham, n=10) ou une ovariectomie chirurgicale (OVX, n=20) sous anesthésie. Une semaine après la chirurgie, les souris OVX ont été réparties au hasard en 2 groupes de 10 souris chacun : OVX bilatéral et OVX bilatéral additionné de 200 ml de PBS contenant 1 mM d'actéoside par voie orale (groupe AC). Oralactéosidea été administré une fois tous les 3 jours pendant 8 semaines après la chirurgie, et la même quantité de PBS a été administrée aux groupes Sham et OVX. Après 1 jour de la dernière administration, les souris ont été sacrifiées, puis les paramètres biochimiques dans le sérum et la structure osseuse dimensionnelle 3- ont été analysés.

Détermination des paramètres biochimiques sériques

Des échantillons de sang ont été prélevés par ponction cardiaque et le sérum a été recueilli par centrifugation. Les échantillons de sérum ont été stockés à 280 uC pour les analyses des paramètres biochimiques. Les taux sériques d'IL-1b et d'IL-6 ont été estimés à l'aide du kit ELISA tel que décrit ci-dessus, tandis que l'activité de la phosphatase alcaline (ALP) a été déterminée à l'aide d'un dosage colorimétrique biochimique qui mesure la quantité de p -nitrophénol produit à partir d'un substrat phosphate de p-nitrophénol, comme décrit par ailleurs [27]. Pour estimer les biomarqueurs de la formation et de la résorption osseuses, les taux sériques d'OC, de calcium et de TRAP5b ont également été déterminés conformément aux instructions du fabricant.

Analyses de la structure osseuse et des paramètres morphométriques

Les fémurs de souris (groupes Sham, OVX et AC) ont été disséqués et remplis de sérum physiologique pour les tests mécaniques. La résistance mécanique du fémur a été mesurée comme décrit ailleurs [28]. La charge de fracture a été enregistrée comme la force maximale en newtons au point où le milieu de la fracture du fémur droit. De plus, le fémur léger de chaque animal a été analysé par histomorphométrie à l'aide d'un système de tomographie par micro-ordinateur (micro-CT) (SkyScan 1076 microfocus X-ray system, Kontich, Belgique). En bref, les os stockés dans du formaldéhyde à 4% ont été séchés superficiellement sur du papier de soie avant d'être enveloppés dans un «film plastique» ou dans du parafilm, pour éviter le dessèchement lors de la numérisation. Chaque os enveloppé de plastique a été placé dans des tubes en mousse plastique / polystyrène qui ont été montés verticalement horizontalement dans la chambre d'échantillon du scanner 1076 pour l'imagerie micro-CT. Le balayage a été effectué en utilisant une tension de source de 100 kV et un courant de source de 140 mA avec une résolution de 35 mm. Des modèles tridimensionnels des os trabéculaires du fémur ont été reconstruits à l'aide de SkyScan CT Analyzer version 1.11. Les paramètres structurels tels que la densité minérale osseuse trabéculaire (DMO, g/cm3), le pourcentage de volume osseux (volume osseux (BV)/volume tissulaire (TV), pourcentage), l'épaisseur (Tb.Th, mm), la séparation (Tb.Sp , mm) et le nombre (Tb.N, 1/mm) ont ensuite été mesurés.

Test de différenciation ostéogénique et de minéralisation

Les cellules de moelle osseuse cultivées dans des plaques de culture à puits 6- ont été traitées avec du DAG (dexaméthasone 10 nM, acide ascorbique 50 mM et b-glycérophosphate 20 mM) en présence de 10 mMactéoside. Après 2 semaines de différenciation, les cellules ont été fixées avec de l'éthanol glacé à 7 0 % (vol/vol) pendant 1 h et colorées avec de l'eau distillée 0.2 % de rouge d'alizarine Sin pendant 30 min à la pièce Température. Une fois les cellules décolorées et séchées à l'air, les plaques de culture cellulaire ont été évaluées par microscopie optique à l'aide d'un microscope inversé (Nikon TS100, Japon). Pour quantifier la quantité de colorant rouge, la tache a été éluée avec du chlorure d'acétylpyridinium à 10 % en secouant pendant 20 min et l'absorbance a été mesurée à 560 nm. La quantité de calcium déposée dans les couches cellulaires a également été mesurée à l'aide d'un kit Calcium (Wako Chemical Inc. Osaka, Japon) selon les instructions du fabricant. De plus, l'expression de marqueurs d'ARNm spécifiques à l'os, tels que le facteur de transcription lié au runt-2(Runx2), l'osterix, la sialoprotéine osseuse (BSP) et l'OC a été déterminée par RT-PCR en temps réel. Les amorces oligonucléotidiques de ces marqueurs ont été conçues avec des tailles de produit inférieures à 200 pb à l'aide du logiciel PrimerExpress 3.0 (Applied Biosystems) comme décrit ailleurs [27].

Analyses statistiques

Sauf indication contraire, toutes les données sont exprimées sous la forme de la moyenne6 de l'écart type (ET) de 3 expériences indépendantes ou plus. Une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour les comparaisons multiples à l'aide du logiciel SPSS version 12.0. Une valeur p,0.05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

L'actéoside inhibe la formation d'ostéoclastes par les macrophages de manière dose-dépendante

Pour vérifier l'effet de l'actéoside sur la différenciation des BMM en ostéoclastes, les cellules ont été cultivées avec différentes concentrations (0–20 mM) d'actéoside pendant 7 jours en présence de 50 ng/ml de M-CSF et 100 ng/ml RANKL. L'actéoside a réduit le nombre d'ostéoclastes de manière dose-dépendante. Lorsque les cellules ont été prétraitées avec de l'actéoside 10 mM pendant 2 h, le nombre d'ostéoclastes a diminué de 43% par rapport aux cellules supplémentées avec M-CSF et RANKL (Fig. 1A). La figure 1B montre la différenciation des ostéoclastes médiée par RANKL et son inhibition par un traitement combiné avec l'actéoside. Conformément à ce résultat, le prétraitement par l'actéoside a diminué la différenciation stimulée par RANKL des cellules RAW264.7 et la formation d'ostéoclastes (Figs. 1C et D). Lorsque le potentiel anti-ostéoclastique de l'actéoside sur les BMM a été comparé aux potentiels anti-ostéoclastes de plusieurs composés phénoliques à la même concentration (10 mM), la lutéoline a montré l'activité la plus élevée (Fig. 2A). Cependant, la lutéoline, la quercétine ou l'apigénine elle-même ont diminué la viabilité des cellules (Fig. 2B). Tous les composés ont inhibé la différenciation ostéoclastique par les macrophages RAW264.7 avec les activités relatives suivantes : lutéoline. quercétine=apigénine .EGCG=actéoside (Fig. 2C). La lutéoline, la quercétine ou l'apigénine elle-même ont également montré la diminution de la viabilité des cellules (Fig. 2D). En revanche, le traitement à la quercétine n'a provoqué qu'une réduction significative de la viabilité des cellules BMM et RAW264.7, lorsque ces cellules ont été exposées à 10 mM de chaque composé pendant 2 jours avec 50 ng/ml de M-CSF, 100 ng/ml de RANKL, ou les deux (données non présentées). Lorsque la concentration de ces composés est nécessaire pour inhiber 50 pour cent de

la formation d'ostéoclastes dans les BMM (IC50) a été calculée à l'aide de courbes concentration-activité, l'IC50 deactéoside, la quercétine, la lutéoline, l'apigénine et l'EGCG étaient respectivement de 5, 1, 2, 3, 2, 6, 4, 8 et 6, 6 mM (Fig. 2E). Ce résultat était similaire au cas où les macrophages RAW264.7 ont été examinés. Ces données suggèrent que la lutéoline et la quercétine ont des activités anti-clastogènes supérieures à l'actéoside. En revanche, la quercétine à l'IC50 a également eu un léger effet toxique sur les cellules (données non présentées).

L'actéoside inhibe la résorption osseuse par les macrophages

L'actéoside a également empêché la résorption osseuse médiée par RANKL de manière dose-dépendante, telle que mesurée par un système de modèle in vitro (Fig. 3A). La résorption osseuse a été significativement inhibée lorsque les BMM ont été incubés avec 1 mM d'actéoside (Fig. 3B). A 10 mMactéosidele traitement a presque complètement atténué les informations induites par RANKL par les BMM. De même, l'actéoside a diminué la résorption osseuse dans les cellules RAW264.7 stimulées par RANKL (Figs. S2A et B). La capacité de l'actéoside à inhiber la résorption osseuse dépendait du moment du traitement par rapport à la stimulation RANKL. L'actéoside (10 mM) ajouté 4 jours après la stimulation par RANKL n'a pas réduit les informations dans les BMM, alors qu'il a supprimé le nombre d'ostéoclastes formés (Fig. 3C). Ce résultat différent était en partie dû à la zone de fosse déjà formée après 4 jours de formation de stimulation RANKL (Fig. 3D).

Acteoside Down-régule les voies de signalisation RANKL précoces

RANKL induit l'activation de 3 MAPK et NF-kB bien connus dans les précurseurs des ostéoclastes, et cette activation est nécessaire pour la différenciation précoce des ostéoclastes. Pour comprendre les mécanismes possibles par lesquels l'actéoside inhibe l'ostéoclastogenèse, nous avons étudié l'effet deactéosidesur les MAPK et l'activation de NF-B dans les macrophages. Les cellules BMM et RAW264.7 ont été prétraitées avec 10 mM d'actéoside pendant 2 h, puis stimulées avec 100 ng/ml de RANKL pendant 30 min. La phosphorylation de MAPK a été examinée par Western blot et analyse immunométrique. RANKL a induit la phosphorylation de p38, ERK et JNK dans les cellules BMM (Fig. 4A) et RAW264.7 (Fig. 4B). L'actéoside a empêché ces augmentations induites par RANKL de p-p38, p-ERK et p-JNK. Ce résultat a été étayé par une analyse immunométrique, selon laquelle ce prétraitement avec 10 mMactéosideinhibe de manière significative les niveaux de MAPK phosphorylées dans ces macrophages (Fig. 4C). Le traitement par RANKL a augmenté la liaison à l'ADN de NF-kB, tandis que l'actéoside a inhibé l'activation induite par RANKL de la liaison NF-kB-ADN (Fig. 5A). Cette inhibition était plus importante dans les BMM que dans les cellules RAW264.7. L'actéoside a également diminué la phosphorylation de p65 et IkBa stimulée par RANKL dans les cellules BMM et RAW264.7 (figures 5B et C). L'ajout de 10 mMacteoside a presque complètement inhibé à la fois la dégradation et l'activation d'IkBa dans les BMM (Fig. 5B). Pour confirmer davantage que l'activation de NF kB est impliquée dans l'action de l'actéoside, des constructions promoteur kB-luciférase ont été transfectées de manière transitoire dans des cellules RAW264.7. Les cellules incubées avec 100 ng / ml de RANKL avaient une activité de promoteur kB 3- fois plus élevée, qui était significativement atténuée par l'actéoside 10 mM (Fig. 5D).

L'actéoside supprime la production de cytokines inflammatoires et l'expression des macrophages stimulés par le TNF-a, le c-Fos et le NFATc1in RANKL

TNF-a, IL-1b et IL-6 sont importants dans la formation et la fonction des ostéoclastes, qui sont médiées par la signalisation NF-kB dans les macrophages stimulés par RANKL. RANKL a stimulé la production de ces cytokines, et cette production a été nettement réduite de 10 mMactéosideprétraitement dans les BMM (Fig. 6A). De même, l'actéoside a atténué la production de cytokines induite par RANKL, à l'exception de IL-6, dans les macrophages RAW264.7 (Fig. S3). Pour comprendre les mécanismes moléculaires de l'action de l'actéoside dans l'ostéoclastogenèse, nous avons examiné plus en détail l'effet de l'actéoside sur l'expression de TNF-a, c-Fos et NFATc1. RANKL a régulé à la hausse l'expression de l'ARNm de ces facteurs dans les BMM et les cellules RAW264.7 (Figs. 6B et C). Un prétraitement avec 10 mM d'actéoside a significativement inhibé l'expression induite par RANKL de ces facteurs dans les deux

BMM et cellules RAW264.7. Le prétraitement par actéoside a également fortement réduit les niveaux de protéines de c-Fos et de NFATc1 dans les BMM stimulés par RANKL (Fig. 6D). Ces résultats suggèrent que l'actéoside régule à la baisse les médiateurs induisant RANKL de la formation d'ostéoclastes au niveau des gènes et des protéines.

L'actéoside diminue la génération intracellulaire de ROS dans les BMM de manière dose-dépendantePuisqu'il est connu que la production intracellulaire de ROS est corrélée à l'ostéoclastogenèse stimulée par RANKL, nous avons étudié si l'actéoside inhibe la production de ROS pendant la différenciation des ostéoclastes médiée par RANKL à l'aide d'un colorant perméable aux cellules et sensible à l'oxydation , DCFH-DA. L'analyse par cytométrie en flux a montré que le signal de fluorescence moyen spécifique au DCF dans les BMM était apparemment décalé vers la droite après stimulation avec RANKL, par rapport aux cellules témoins non traitées (figure 7A). Ce changement était similaire au cas où des macrophages RAW264.7 ont été observés après stimulation par RANKL (données non présentées). Le traitement des BMM avec de l'actéoside a réduit l'intensité du signal du DCF de manière dose-dépendante. Un prétraitement avec 10 mM d'actéoside a presque complètement réduit les niveaux de ROS intracellulaires produits pendant la différenciation des ostéoclastes aux niveaux témoins non traités (Fig. 7B).

L'administration orale d'actéoside inhibe l'altération des marqueurs biochimiques ostéoporotiques et la perte osseuse chez les souris ovariectomisées

Pour explorer l'effet de l'actéoside sur la perte osseuse, nous avons préparé un modèle animal ostéoporotique par ovariectomie. Il y avait une différence significative de poids corporel entre OVX et Shammice pendant la période expérimentale (données non présentées). Le groupe présentait des taux sériques significativement plus élevés d'IL-1b et d'IL-6 que le groupe Sham (Fig. 8). Les augmentations induites par l'ovariectomie de ces cytokines inflammatoires ont été atténuées par l'administration orale d'actéoside (groupe AC). Les taux sériques de marqueurs du remodelage osseux tels que ALP, calcium, TRAP5b et OC ont été significativement augmentés dans le groupe OVX. Parmi ces marqueurs ostéoporotiques, les niveaux accrus de calcium, TRAP5b et OC chez les souris OVX ont apparemment été inhibés par le traitement à l'actéoside, alors que le taux sérique d'ALP n'a pas été modifié par le traitement. La charge de fracture maximale moyenne au milieu de la diaphyse fémorale droite était significativement plus faible dans le groupe OVX que dans le groupe Sham (Fig. 9A). Le traitement par actéoside a élevé la sauvegarde maximale de la fracture à celle du groupe Sham. Lorsque l'os cortical du fémur a été disséqué et observé par microscopie optique, les caractéristiques ostéoporotiques présentées dans le groupe OVX avaient presque complètement disparu chez les souris AC (Fig. 9B). Pour vérifier l'effet de l'actéoside sur le modèle d'ostéoporose induite par OVX, la DMO et les paramètres morphologiques osseux dans le trabéculaire du fémur proximal léger ont été analysés par micro-CT. Comme le montre la figure 9C, une altération de l'architecture trabéculaire fémorale a été trouvée chez les souris OVX, alors que cette modification a été atténuée par le traitement à l'actéoside. Les résultats de l'analyse micro-CT ont révélé que la DMO, une mesure de la résistance osseuse, était considérablement réduite chez les souris OVX (Fig. 9D). Par rapport au groupe Sham, les souris OVX ont également montré des changements significatifs dans BV/TV, Tb. Sp et Tb. N, mais pas dans Tb.Th. Le traitement oral par l'actéoside des souris OVX a empêché de manière significative l'altération de la DMO ainsi que de la BV/TV et de la Tb.N.

L'actéoside n'affecte pas l'ostéoblastogenèse dans les cellules de la moelle osseuse

Le rôle de l'actéoside sur la différenciation ostéoblastique a été étudié plus en détail à l'aide de cellules de moelle osseuse. Comme le montre la figure 10A, le traitement au DAG a augmenté le nombre de cellules colorées au rouge d'alizarine et cela n'a pas été modifié par un prétraitement à l'actéoside 10 mM. La quantité de colorant présent indiquait que le traitement combiné actéoside et DAG ne modifiait pas la minéralisation (Fig. 10B). De même, les augmentations induites par le DAG de la teneur en calcium intracellulaire (Fig. 10C) et des niveaux d'ARNm (Fig. 10D) des marqueurs spécifiques à l'os, tels que Runx2, osterix, BSP et OC, n'ont pas été affectées par le prétraitement avecactéoside.