Transition active de la phase de mémoire de la peur de la reconsolidation à l'extinction grâce à la prévention de la reconsolidation médiée par ERK

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La récupération decraindreMémoireinduit deux processus de mémoire opposés, à savoir la reconsolidation et l'extinction. Une brève récupération induit une reconsolidation pour maintenir ou renforcer la peurMémoire, tandis qu'une récupération prolongée éteint cette mémoire. Bien que les mécanismes de reconsolidation et d'extinction aient été étudiés, on ne sait toujours pas comment les phases de la mémoire de la peur passent de la reconsolidation à l'extinction lors de la récupération de la mémoire. Ici, nous montrons qu'un processus de transition de mémoire dépendant de la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) après récupération régule le passage des phases de mémoire de la reconsolidation à l'extinction en empêchant l'induction de la reconsolidation dans une tâche d'évitement inhibiteur (IA) chez les souris mâles. Premièrement, la phase de mémoire de transition, qui annule l'induction de la reconsolidation, mais est insuffisante pour l'acquisition de l'extinction, a été identifiée après la reconsolidation, mais avant les phases d'extinction. Deuxièmement, les phases de reconsolidation, de transition et d'extinction aprèsrécupération de mémoireont montré des signatures moléculaires et cellulaires distinctes par le biais de la protéine de liaison à l'élément sensible à l'AMPc (CREB) et de la phosphorylation de ERK dans l'amygdale, l'hippocampe et le cortex préfrontal médian (mPFC). La phase de reconsolidation a montré une augmentation de la phosphorylation de CREB, tandis que la phase d'extinction a montré plusieurs populations neuronales avec diverses combinaisons de phosphorylation de CREB et/ou ERK, dans ces régions du cerveau. Fait intéressant, les trois phases de mémoire, y compris la phase de transition, ont montré une activation ERK transitoire immédiatement après la récupération. Plus important encore, le blocage de l'ERK dans l'amygdale, l'hippocampe ou le mPFC lors de la phase de transition de la mémoire a désinhibé l'amélioration de la mémoire IA induite par la reconsolidation. Ces observations suggèrent que la voie de signalisation ERK régule activement la transition de la phase de mémoire de la reconsolidation à l'extinction et ce processus fonctionne comme un interrupteur qui annule la reconsolidation de la peur.Mémoire.

Mots clés : ERK ; extinction; peur de la mémoire; reconsolidation; transition

1Department of Bioscience, Faculty of Life Sciences, Tokyo University of Agriculture, Tokyo 156-8502, Japon, et

2École supérieure d'agriculture et des sciences de la vie, Université de Tokyo, Tokyo 113-8657, Japon

Déclaration d'importance

Récupération de la mémoire de la peurinduit deux processus de mémoire opposés ; reconsolidation et disparition. La reconsolidation maintient/ améliorepeur de la mémoire, tandis que l'extinction affaiblit la mémoire de la peur. On ne sait toujours pas comment les phases de mémoire sont commutées de la reconsolidation à l'extinction lors de la récupération. Ici, nous avons identifié un processus de transition de mémoire active fonctionnant comme un interrupteur qui inhibe la reconsolidation. Cette phase de transition de mémoire a montré une augmentation transitoire de la phosphorylation de la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) dans l'amygdale, l'hippocampe et le cortex préfrontal médial (mPFC). Fait intéressant, l'inhibition de ERK dans ces régions à la phase de transition a désinhibé l'amélioration médiée par la reconsolidation de la mémoire d'évitement inhibiteur (IA). Ces résultats suggèrent que le processus de mémoire de transition régule activement le changement des phases de mémoire de peur de la mémoire de peur en empêchant l'induction de la reconsolidation par l'activation de la voie de signalisation ERK.

Introduction

Mémoirela récupération n'est pas un processus passif mais plutôt un processus dynamique qui permet le maintien, le renforcement, l'affaiblissement ou la modification/mise à jour d'une mémoire originale (Misanin et al., 1968 ; Schneider et Sherman, 1968 ; Lewis, 1979 ; Mactutus et al. ., 1979 ; Gordon, 1981 ; Nader et al., 2000 ; Nader et Hardt, 2009 ; Dudai, 2012 ; Fukushima et al., 2014). Il est important de noter qu'une mémoire de peur conditionnée récupérée par une brève réexposition au stimulus conditionné (SC) devient labile et nécessite une reconsolidation dépendante de l'expression génique pour son maintien ou son amélioration (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002 ; Suzuki et al., 2004 ; Tronel et al., 2005 ; Fukushima et al., 2014). À l'inverse, une réexposition continue ou répétée au CS induit une extinction de la mémoire, ce qui affaiblit la mémoire de peur (Pavlov, 1927 ; Rescorla, 2001 ; Myers et Davis, 2002). Ainsi, la récupération de la mémoire de la peur induit deux processus mémoriels opposés, à savoir la reconsolidation et l'extinction, bien que les deux processus soient induits par la réexposition à un SC identique, mais diffèrent selon la durée de réexposition au SC.

La caractéristique biochimique commune et critique de la reconsolidation et de l'extinction est l'exigence d'une expression génique médiée par la protéine de liaison à l'élément sensible à l'AMPc (CREB) (Mamiya et al., 2009). Fait intéressant, nous avons montré des signatures moléculaires, anatomiques et comportementales contrastées entre les phases de reconsolidation et d'extinction de la mémoire de peur contextuelle (Suzuki et al., 2004 ; Mamiya et al., 2009). Le blocage de la synthèse des protéines pendant la phase de reconsolidation perturbe la peur originelleMémoire, alors que le blocage de la synthèse des protéines pendant la phase d'extinction échoue à le faire, bien que la mémoire contextuelle de la peur ait été réactivée. L'exigence de régions cérébrales affichant l'activation de l'expression génique médiée par CREB diffère entre la reconsolidation et l'extinction; la reconsolidation dépend de l'amygdale et de l'hippocampe, tandis que l'extinction repose sur l'amygdale et le cortex préfrontal médial (mPFC). Cependant, l'évolution temporelle de l'activation de l'amygdaloïde CREB diffère entre les phases de mémoire de reconsolidation et d'extinction. Ces observations suggèrent que les phases de reconsolidation et d'extinction ne sont pas indépendantes, mais plutôt interagissent les unes avec les autres. Fait intéressant, des études récentes ont identifié une fenêtre temporelle (phase de transition) qui ne montre aucune activation de la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) dans l'amygdale après la reconsolidation, mais avant les phases d'extinction suivant la récupération de la mémoire auditive de la peur (Merlo et al., 2018 ). Pris ensemble, ces résultats suggèrent les mécanismes possibles par lesquels les phases de mémoire passent de la reconsolidation à l'extinction lors de la récupération de la mémoire de la peur. En d'autres termes, il est possible que le processus de transition mémoire régule activement ce commutateur.

Dans une tâche d'évitement inhibiteur (IA), les souris reçoivent un choc électrique après avoir pénétré dans un compartiment sombre à partir d'un compartiment clair et se sont forméesMémoirepour éviter le compartiment sombre. Auparavant, en utilisant cette tâche, nous avons montré que les phases de reconsolidation et d'extinction peuvent être discriminées au moment où une souris entre dans un compartiment sombre à partir d'un compartiment clair lors d'une session de réexposition (Fukushima et al., 2014). Par conséquent, cette tâche nous permet de caractériser les signatures moléculaires en perspective des phases de reconsolidation et d'extinction, contrairement au paradigme classique de conditionnement contextuel de la peur dans lequel la réactivation de la mémoire de peur conditionnée par réexposition au CS initie à la fois la reconsolidation et l'extinction ; une réexposition courte (3 min) au contexte conditionné induit une reconsolidation, alors qu'une réexposition longue (30 min) ou répétée à ce contexte induit une extinction (Eisenberg et al., 2003 ; Pedreira et Maldonado, 2003 ; Suzuki et al., 2004 ; Lee et al., 2008 ; Mamiya et al., 2009). De plus, nous avons constaté que la mémoire IA récupérée est améliorée grâce à la reconsolidation de la mémoire dans cette tâche (Fukushima et al., 2014).

Comprendre le mécanisme du passage de la reconsolidation à l'extinction lors de la récupération de la peurMémoire, nous avons cherché à identifier et caractériser les signatures moléculaires, cellulaires et comportementales des phases de reconsolidation, de transition et d'extinction de la mémoire IA. Nous avons analysé l'activation de CREB et ERK dans l'amygdale, l'hippocampe et le mPFC dans les phases de reconsolidation, de transition et d'extinction et avons examiné les rôles de l'activation de ERK dans ces processus de mémoire.

Matériaux et méthodes

Souris Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Japan Neuroscience Society et Tokyo University of Agriculture). Toutes les expérimentations animales réalisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université d'agriculture de Tokyo (autorisation #280037). Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie au Nembutal et tous les efforts ont été faits pour minimiser les souffrances. Des souris mâles C57BL/6N ont été obtenues auprès de Charles River. Les souris ont été logées dans des cages de cinq ou six, maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12/12 h et autorisées à accéder à la nourriture et à l'eau ad libitum. Les souris étaient âgées d'au moins huit semaines lorsqu'elles ont été testées. Les tests ont été effectués pendant la phase lumineuse du cycle. Toutes les expériences ont été menées en aveugle à l'état de traitement des souris.

Test IA L'appareil IA pas à pas (OHARA Pharmaceutical) consistait en une boîte avec des compartiments clairs et sombres séparés (tous deux de 15,5 12,5 11,5 cm). Le compartiment lumineux était éclairé par une lumière fluorescente (2500 lux ; Fukushima et al., 2008, 2014 ; Zhang et al., 2011 ; Ishikawa et al., 2016). Avant le début de la formation IA, les souris ont été manipulées individuellement pendant 2 min chaque jour pendant une semaine. Au cours des séances d'entraînement, chaque souris a été autorisée à s'habituer au compartiment lumineux pendant 30 s, et la porte à guillotine a été soulevée pour permettre l'accès au compartiment sombre. La latence pour entrer dans le compartiment sombre a été considérée comme une mesure d'acquisition. Dès que la souris était entrée dans le compartiment sombre, la porte à guillotine était fermée. Après 5 s, un choc au pied (0,2 mA) a été délivré pendant une durée totale de 2 s (entraînement). 24 h après la séance d'entraînement, la souris a été replacée dans le compartiment clair jusqu'à ce qu'elle entre dans le compartiment sombre (moyenne 459 6 15.49 s). Immédiatement après que la souris soit entrée dans le compartiment sombre, la porte à guillotine a été fermée et la souris est restée dans le compartiment sombre pendant une durée variable (0, 1 ou 10 min) sans choc au pied (réactivation). La mémoire a été évaluée 48 h plus tard [test de mémoire à long terme post-réactivation (PR-LTM)] en tant que latence de croisement pour que la souris entre dans le compartiment sombre lorsqu'elle est remplacée dans le compartiment clair, comme lors de la réactivation.

Pour la première expérience, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la synthèse des protéines après réactivation (réexposition au compartiment sombre pendant 0, 1 ou 10 min ; Fig. 1). L'anisomycine, un inhibiteur de la synthèse des protéines (ANI ; Wako), a été dissoute dans une solution saline (pH ajusté à 7,0–7,4 avec NaOH). Les souris ont été entraînées comme décrit ci-dessus, et 24 h plus tard, elles ont reçu du véhicule (VEH) ou de l'ANI (150 mg/kg, ip) immédiatement après réexposition au compartiment sombre pendant 0, 1 ou 10 min sans choc au pied. (réactivation). À cette dose, l'ANI inhibe 0,90 % de la synthèse des protéines dans le cerveau pendant les 2 premières heures (Flood et al., 1973). 48 h après la session de réactivation, les souris individuelles ont été à nouveau placées dans le compartiment lumineux et la latence de croisement a été évaluée.

Pour la seconde expérience [immunohistochimie CREB phosphorylée (pCREB) et ERK phosphorylée (pERK) ; Figues. 2–5], nous avons examiné les régions du cerveau qui étaient activées après réexposition à la lumière (jusqu'à ce que les souris entrent dans le compartiment sombre, réexposition au compartiment sombre pendant 0 min) ou compartiment sombre (réexposition exposition au compartiment obscur pendant 1 ou 10 min). Les souris ont été divisées en quatre Fukushima et al. · Transition des phases de mémoire de peur après récupération J. Neurosci., 10 février 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289groupes. 24 h après l'entraînement, les souris individuelles ont été réexposées au compartiment clair puis sont restées dans le compartiment sombre après leur entrée depuis le compartiment sombre [réactivation : 0 min dans le compartiment sombre, groupe reconsolidation (Recon) ; 1 min, groupe de transition (Tran); 10 min, groupe extinction (Ext)]. Un autre groupe de souris n'a pas été remis dans le compartiment clair/obscur [groupe non réactivé (NR)]. Les souris ont ensuite été anesthésiées avec du Nembutal (750 mg/kg, ip) à 5, 15 ou 30 min après la réactivation.

Pour la troisième expérience (microinfusion de U0126 ; Figs. 6,7), nous avons examiné les effets de l'inhibition de l'ERK dans l'amygdale, l'hippocampe ou le mPFC surMémoirereconsolidation/amélioration, transition et extinction. L'inhibiteur de MEK U0126 (Sigma-Aldrich) a été dissous dans du liquide céphalo-rachidien artificiel contenant trois gouttes de Tween 80 (Sigma) dans 2,5 ml de diméthylsulfoxyde à 7,5 % (Wako) et ajusté au pH 7,4 avec NaOH. Les souris ont été entraînées comme décrit ci-dessus, et 24 h plus tard, elles ont été replacées dans le compartiment lumineux (réactivation). Les souris ont été microinfusées avec U0126 (1 mg) ou VEH dans les différentes régions du cerveau immédiatement après (Figs. 6A, C, E–H, 7A–C) ou à 30 min après (Fig. 6B, D) réactivation. 48 h après la réactivation, les souris individuelles ont été à nouveau placées dans le compartiment lumineux et la latence de croisement a été évaluée (PR LTM). Des micro-infusions dans l'hippocampe et du mPFC (0,5 ml) ont été faites à un débit de 0,25 ml/min. Des micro-infusions dans l'amygdale (0,2 ml) ont été faites à un débit de 0,1 ml/min. La canule d'injection a été laissée en place pendant 2 min après la micro-infusion et les souris ont ensuite été remises dans leurs cages d'origine. L'inhibiteur de MEK SL327 (Santa Cruz Biotechnology) a été dissous dans du diméthylsulfoxyde et dilué avec une solution saline. Les souris ont été entraînées comme décrit ci-dessus, et 24 h plus tard, les souris individuelles ont été replacées dans le compartiment lumineux (réactivation). Les souris ont reçu une injection systémique de SL327 (10 ou 20 mg / kg) ou de VEH immédiatement après la réactivation (Fig. 7D – F). 48 h après la réactivation, les souris individuelles ont été à nouveau placées dans le compartiment lumineux et la latence de croisement a été évaluée (PR-LTM).

L'immunohistochimie a été réalisée comme décrit précédemment (Mamiya et al., 2009; Suzuki et al., 2011; Zhang et al., 2011; Fukushima et al., 2014; Ishikawa et al., 2016; Hasegawa et al., 2019). Après anesthésie, toutes les souris ont été perfusées avec du paraformaldéhyde à 4 %. Les cerveaux ont été prélevés, fixés pendant la nuit, transférés dans du saccharose à 30 % et stockés à 4 degrés. Des sections coronales (30 mm) ont été coupées dans un cryostat.

Pour la coloration pCREB et pERK, les coupes flottantes ont été traitées avec 1 % de H2O2 et incubées pendant la nuit avec un anticorps polyclonal de lapin anti-phospho-CREB (sérine 133 ; S133) (1:1000 ; #{{10 }}, Millipore) et/ou anticorps monoclonal de lapin anti-phospho-ERK1/2 (T202/Y204) (1:300 ; #4370 ; Cell Signaling Technology) dans une solution de blocage (solution saline tamponnée au phosphate plus 1 % d'albumine de sérum de chèvre, 1 mg/ml d'albumine sérique bovine et 0,05 % de Triton X-100). Les sections ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate et incubées avec des IgG anti-lapin d'âne conjuguées à la peroxydase de raifort (1: 500; Jackson ImmunoResearch) pour pCREB ou des IgG anti-lapin de chèvre conjuguées à la peroxydase de raifort pour pERK pendant 1 h à température ambiante. Les signaux pCREB ont été amplifiés par le tyramide de biotine et visualisés à l'aide de streptavidine conjuguée à Alexa Fluor (Invitrogen). Les signaux pERK ont été amplifiés avec TSA-FCM (Invitrogen). Les coupes ont été montées sur des lames et recouvertes d'une lamelle à l'aide d'un milieu de montage (Millipore).

La quantification a été effectuée comme décrit précédemment (Frankland et al., 2006 ; Fukushima et al., 2014 ; Mamiya et al., 2009 ; Zhang et al., 2011 ; Suzuki et al., 2008). Les structures ont été définies anatomiquement selon l'atlas de Franklin et Paxinos (1997). Tous les neurones immunoréactifs ont été comptés par un expérimentateur aveugle à la condition de traitement

Résultats

Caractérisation des phases mémoire après récupération dans la tâche IA

La tâche IA nous permet de discriminer les phases de reconsolidation et d'extinction au moment où une souris entre dans un compartiment sombre à partir d'un compartiment clair (Fukushima et al., 2014). Pour comprendre le mécanisme sous-jacent au passage des phases de la mémoire de la reconsolidation à l'extinction, nous avons caractérisé les phases de la mémoire IA après la récupération de la mémoire en examinant les effets de l'inhibition de la synthèse protéique nécessaire à la reconsolidation et à l'extinction de la mémoire IA (Fukushima et al., 2014). Les souris ont d'abord été placées dans le compartiment lumineux. 5 s après leur entrée dans le compartiment obscur, un bref choc électrique au pied a été délivré (entraînement). Les souris ont été réexposées au compartiment lumineux 24 h après l'entraînement (séance de réactivation ; Fig. 1A) et leur latence de croisement pour entrer dans le compartiment sombre a été évaluée (Fig. 1B). Les souris ont été remises dans leurs cages d'origine immédiatement après être entrées dans le compartiment sombre depuis le compartiment clair (0- réexposition min au compartiment sombre ; phase de reconsolidation) ou sont restées dans le compartiment sombre pendant 1, 3 ou 10 min sans recevoir de choc au pied (phase d'extinction ; Fig. 1C-E). Immédiatement après la session de réactivation, les souris ont reçu une injection systémique de VEH ou de l'inhibiteur de synthèse protéique ANI. À 48 h plus tard, la latence de croisement a été évaluée PR-LTM.

Conformément à notre étude précédente (Fukushima et al., 2014), la réexposition au compartiment lumineux (groupe 0 min) a induit la reconsolidation et l'amélioration de la mémoire IA. Une ANOVA à deux facteurs a révélé des effets significatifs du temps (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), du médicament (F(1 ,24)=23.197, p, 0,0001) et le temps d'interaction médicamenteuse (F(1,24)=25.022, p, 0,0001 ; Fig. 1B). Le test de Bonferroni post hoc et le test t apparié ont révélé que les groupes VEH et ANI affichaient respectivement une latence de croisement significativement augmentée ou diminuée au PR-LTM par rapport à la session de réactivation (ps , 0,05 ; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003 ; figure 1B). Ces observations indiquent que la récupération de la mémoire IA dans le compartiment lumineux a amélioré la mémoire, tandis que l'inhibition de la synthèse des protéines a perturbé la mémoire récupérée, confirmant l'observation précédente selon laquelle la récupération de la mémoire IA améliore la mémoire par la reconsolidation d'une manière dépendante de la synthèse des protéines.

En revanche, la réexposition au compartiment sombre a induit une extinction à long terme [ANOVA à deux facteurs, temps (Fig. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04 : Fig. 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), médicament (Fig. 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039 ; Fig. 1D, F(1,36)=12.285, p {{29 }}.0012), temps d'interaction médicamenteuse (Fig. 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009 ; Fig. 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], comme observé précédemment (Fukushima et al., 2014). Les groupes VEH qui sont restés dans le compartiment sombre pendant 3 ou 10 min ont montré une latence de croisement significativement réduite à PR-LTM par rapport à la session de réactivation, tandis que les groupes ANI ont affiché une latence de croisement comparable à PR-LTM par rapport à la session de réactivation et à la Groupes VEH (test de Bonferroni post hoc, ps , 0,05 ; test t apparié, Fig. 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, p 0,05 ; Fig. 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0,0001, ANI, t(9)=1.02, p 0,05 ). Ces observations indiquent que la réexposition au compartiment obscur pendant 3 ou 10 min a éteint la mémoire IA et que l'inhibition de la synthèse des protéines a bloqué l'extinction à long terme. Ainsi, la récupération de la mémoire IA dans le compartiment sombre éteint la mémoire IA d'une manière dépendante de l'expression du gène.

Fait important, le groupe VEH a montré une latence croisée comparable à PR-LTM par rapport à la session de réactivation et au groupe ANI lorsqu'ils sont restés dans le compartiment sombre pendant 1 min [ANOVA à deux facteurs, temps (F(1,36) {{ 5}}.03, p . 0.05), drogue (F(1,36)=0.019, p . 0.05), temps d'interaction médicamenteuse (F(1,36)=0.011, p. 0.05) ; test de Bonferroni post hoc, ps . 0,05 ; test t apparié, VEH, t(9)=0.091, p . 0,05, ANI, t(9)=0.328, p . 0,05 ; figure 1E]. Ces observations indiquent que le groupe VEH n'a montré ni amélioration ni extinction de la mémoire IA et que le groupe ANI n'a montré aucune perturbation de la mémoire IA. Par conséquent, la réexposition au compartiment sombre pendant 1 min a bloqué à la fois l'amélioration et la perturbation induite par l'ANI de la mémoire IA réactivée, mais pas la mémoire IA éteinte, ce qui suggère que cette réexposition de 1- min annule l'induction de la reconsolidation , mais est insuffisant pour éteindre la mémoire IA.

En résumé, ces résultats indiquent qu'une réexposition au compartiment clair induit la phase de reconsolidation, alors qu'une réexposition plus longue au compartiment sombre (3 ou 10 min) induit la phase d'extinction. Plus important encore, rester 1 min dans le compartiment sombre induit la phase de transition de la reconsolidation à l'extinction, ce qui inhibe la reconsolidation de la mémoire de peur sans induire d'extinction.

Signatures moléculaires des phases de reconsolidation, de transition et d'extinction dans l'amygdale, l'hippocampe et le mPFC après récupération de la mémoire IA

La reconsolidation et l'extinction de la mémoire contextuelle de la peur montrent des augmentations de la phosphorylation de CREB à S133, un marqueur de l'activation de l'expression génique nécessaire à la reconsolidation et à l'extinction à long terme, mais montrent une dynamique distincte de la phosphorylation de CREB (Mamiya et al., 2009 ). Fait intéressant, des études récentes ont montré qu'il n'y a pas d'augmentation de la phosphorylation de ERK, un régulateur en amont de CREB (Impey et al., 1998 ; Wu et al., 2001), dans la région basolatérale de l'amygdale à la transition de la reconsolidation à l'extinction d'une mémoire de peur indicée, bien que cette phosphorylation soit augmentée dans la région basolatérale lorsqu'une mémoire de peur indicée est reconsolidée et éteinte (Merlo et al., 2014, 2018). Une autre étude a indiqué que l'ERK hippocampique n'est activé que lorsque la mémoire de peur contextuelle est éteinte, mais pas reconsolidée (Tronson et al., 2009). Ces résultats suggèrent que les phases de reconsolidation, de transition et d'extinction présentent des signatures moléculaires et cellulaires distinctes. Par conséquent, nous avons mesuré et comparé les niveaux de pCREB et pERK dans les phases de reconsolidation, de transition et d'extinction en utilisant l'immunohistochimie. Nous avons effectué des programmes expérimentaux similaires à ceux de la figure 1B, D, E en utilisant quatre groupes expérimentaux. Les souris ont été réexposées au compartiment clair 24h après l'entraînement puis sont restées dans le compartiment obscur [réactivation : 0 min dans le compartiment obscur, groupe reconsolidation (Recon) ; 1 min, groupe de transition (Tran); 10 min, groupe extinction (Ext)]. Un autre groupe de souris n'a pas été remis dans le compartiment clair/obscur (non réactivé, groupe NR). Nous avons compté les neurones pCREB-positifs (pCREB1), les neurones pERK-positifs (pERK1) et les neurones doublement positifs (pCREB1/pERK1) dans l'amygdale, l'hippocampe et le mPFC 30 min après la séance de réactivation.

Amygdale (région latérale) CREB a été activé dans les phases d'extinction et de reconsolidation, tandis que ERK n'a été activé que dans la phase d'extinction (Fig. 2A – C). Une ANOVA unidirectionnelle a révélé un effet significatif du groupe (Fig. 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Semblable aux résultats précédents (Mamiya et al., 2009), le test post hoc de Newman-Keuls a révélé que les groupes Recon et Ext présentaient significativement plus de neurones pCREB1 que les autres groupes (p, 0,05). Ces observations ont indiqué que, à l'instar des observations aux niveaux comportementaux (Fig. 1), l'exposition au compartiment sombre pendant 1 min (phase de transition) annule le "déclenchement" de la phosphorylation CREB qui serait augmentée dans la phase de reconsolidation. En revanche, beaucoup plus de neurones pERK1 ont été observés dans le groupe Ext que dans les autres groupes, bien qu'il y ait beaucoup moins de neurones pERK1 que de neurones pCREB1 dans le groupe Ext (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207 ; figure 2C).

Constamment, beaucoup plus de neurones doublement positifs (pCREB1/pERK1) ont été observés dans le groupe Ext (F(3,29)=6.698, p=0.00 14 ; Fig. 2D), alors que significativement plus de neurones pCREB1/pERK– (pCREB simple positif) ont été observés dans les groupes Recon et Ext (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001 ; figure 2E). Ainsi, la phase de reconsolidation n'a montré qu'une seule population de neurones pCREB1/pERK–. En revanche, la phase d'extinction a montré deux populations de neurones pCREB1/pERK– et pCREB1/pERK1, indiquant que ERK n'est activé que dans un sous-ensemble de neurones pCREB1. Fait important, des résultats similaires ont été observés dans la région basolatérale de l'amygdale (Fig. 2G, F(3,29)=13.042, p , 0,0001 ; Fig. 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201 ; Figure 2I, F(3,29)=12.633, p , 0,0001 ; Figure 2J, F(3,29)=12 0,505, p, 0,0001).

Activation biphasique de ERK dans la phase d'extinction ERK est un activateur en amont de CREB et, par conséquent, l'activation de ERK est nécessaire pour la consolidation et la reconsolidation de la mémoire de la peur (Schafe et al., 200{{31 }} ; Duvarci et al., 2005). Cependant, de manière incohérente, aucune activation de ERK n'a été observée dans l'amygdale, l'hippocampe ou le mPFC dans la phase de reconsolidation lorsque pERK a été mesuré à 30 min après la séance de réactivation (Figs. 2-4). Par conséquent, nous avons examiné les évolutions temporelles de la phosphorylation de ERK et CREB. Nous avons effectué une expérience similaire à celle des figures 2-4, sauf que les niveaux de pCREB et pERK ont été mesurés à 5, 15 et 30 min après la session de réactivation (réexposition au compartiment sombre pendant {{ 66}}, 1 ou 10 min ; Fig. 5A). Conformément aux données présentées dans les figures 2-4, des augmentations significatives des neurones pCREB1 ont été observées à 30 min, mais pas à 5 min, après la session de réactivation dans le Recon (amygdale, mPFC et hippocampe) et Ext (amygdale et mPFC ) groupes, mais pas le groupe Tran (Fig. 5E, ANOVA unidirectionnelle, amygdale, 5 min, F(3,23)=0.346, p . 0,05, 30 min, F(3,23)=150,272, p=0,0001 ; mPFC, 5 min, F(3,23)=10,169, p=0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, p , 0,0001 ; hippocampe, 5 min, F(3,23)=0.154, p. 0,05, 30 min, F(3,23)=16.197, p , 0,0001 ; test t non apparié, amygdale, reconsolidation, 5 contre 30 min, t(12)=7.807, p , 0,0001, extinction, 5 contre 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002 ; mPFC, reconsolidation, 5 contre 30 min, t(12)=5.727, p , 0,0001, extinction, 5 contre 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013 ; région hippocampique CA1, reconsolidation, 5 contre 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374).

Fait intéressant, des augmentations significatives des neurones pERK1 ont été observées dans l'amygdale, le mPFC et l'hippocampe des groupes Recon, Tran et Ext 5 min après la séance de réactivation par rapport au groupe NR (Fig. 5F, amygdale, F(3,23)=10.961, p=0.0001 ; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011 ; hippocampe, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Ces observations ont indiqué que ERK est activé immédiatement après la session de réactivation dans toutes les phases de mémoire. Cependant, ces augmentations du nombre de neurones pERK1 sont revenues aux niveaux basaux (comparables au groupe NR) 15 min après la séance de réactivation (Fig. 5F, amygdale, F(3,20)=2.676, p 0,05 ; mPFC, F(3,23)=0 0,683, p 0,05 ; hippocampe, F(3,20)=0 0,74, p 0,05). De plus, conformément aux résultats présentés dans les figures 2-4, beaucoup plus de neurones pERK1 ont été observés dans l'amygdale, le mPFC et l'hippocampe 30 min après la session de réactivation uniquement dans le groupe Ext (Fig. 5F, amygdale, F( 3,23)=6.616, p=0.022 ; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008 ; hippocampe, F( 3,23)=6.206, p=0.003). Ainsi, les phases de reconsolidation et de transition montrent une activation transitoire de ERK uniquement au début (5 min), tandis que la phase d'extinction montre une activation biphasique de ERK au début (5 min) et à la fin (30 min) après la réactivation. session. Ces observations ont indiqué que les mécanismes de régulation de l'activation de ERK diffèrent dans les phases de reconsolidation/transition et d'extinction. Collectivement, nos observations ont démontré que les phases de reconsolidation, de transition et d'extinction montrent des signatures moléculaires distinctes.

Rôles de l'activation de ERK dans les phases de reconsolidation et d'extinction de la mémoire IA

Les phases de reconsolidation/transition et d'extinction ont montré une activation ERK monophasique et biphasique, respectivement. Nous avons ensuite étudié et comparé les rôles de l'activation précoce (5 min) et tardive (30 min) de l'ERK dans le mPFC dans les phases de reconsolidation et d'extinction en examinant les effets de l'inhibition de l'ERK (Fig. 6).

Discussion

Dans cette étude, nous avons étudié les mécanismes de transition de la mémoire entre les phases de reconsolidation et d'extinction après la récupération de la mémoire IA. Nous avons d'abord caractérisé les signatures comportementales des phases de mémoire IA après récupération. Conformément à notre étude précédente (Fukushima et al., 2014), la reconsolidation et l'extinction induites par la récupération de mémoire IA par réexposition à la lumière (0 min dans le compartiment sombre) et à l'obscurité ( 3 ou 10 min) compartiments, respectivement. Fait intéressant, la mémoire IA n'a été ni améliorée ni éteinte et a montré une résistance à l'inhibition de la synthèse des protéines lorsque les souris ont été réexposées au compartiment sombre pendant seulement 1 min. Par conséquent, ces observations suggèrent qu'une réexposition de 1-min au compartiment sombre annule l'induction de la reconsolidation, mais est insuffisante pour éteindre la mémoire IA. De plus, nous avons constaté que ERK était activé dans l'amygdale, l'hippocampe et le mPFC à un moment précoce (5 min) après une réexposition au compartiment sombre pendant 0, 1 ou 10 min. Constamment, l'inhibition de ERK dans ces régions du cerveau a bloqué la reconsolidation/l'amélioration et l'extinction de la mémoire IA. Plus important encore, l'inhibition de l'ERK dans l'amygdale, l'hippocampe et le mPFC après une réexposition de 1- min au compartiment sombre a désinhibé l'amélioration médiée par la reconsolidation de la mémoire IA, suggérant que l'activation de l'ERK après de brèves réexpositions (1 min) au compartiment sombre est nécessaire pour l'inhibition de la reconsolidation de la mémoire IA. A l'inverse, une réexposition de 1-min au compartiment sombre était insuffisante pour éteindre la mémoire IA, bien qu'une réexposition prolongée au compartiment sombre (3 ou 10 min) ait éteint cette mémoire. Par conséquent, nos résultats suggèrent qu'une réexposition de 1- min au compartiment sombre induit un processus de transition de mémoire qui annule la reconsolidation/amélioration mais n'initie pas l'apprentissage par extinction. Collectivement, nous suggérons que le processus de transition de la mémoire contribue au passage des phases de la mémoire de la reconsolidation à l'extinction grâce à la prévention de la reconsolidation médiée par ERK.

Semblable à nos observations actuelles, une étude récente utilisant le conditionnement auditif de la peur a montré que les présentations CS uniques (1) ou prolongées (10) induisent respectivement une reconsolidation et une extinction de la mémoire par une augmentation des niveaux de pERK dans la région basolatérale de l'amygdale. En revanche, les présentations CS intermédiaires (4–7) ne modifient pas les niveaux de pERK dans la région basolatérale de l'amygdale. Il est important de noter que l'inhibition de l'ERK lors des présentations CS intermédiaires n'a pas affecté la mémoire de la peur. Cette étude a suggéré qu'il y a une transition de la phase de mémoire de la reconsolidation à l'extinction après la récupération de la mémoire de la peur (Merlo et al., 2018). Dans la présente étude, nous avons étendu cette découverte et suggéré que la phase de transition commute activement les phases de mémoire de la reconsolidation à l'extinction par l'activation de la voie de transduction du signal ERK. Contrairement aux découvertes précédentes (Merlo et al., 2018), nous avons constaté que la phase de transition implique la phosphorylation de ERK dans l'amygdale, l'hippocampe et le mPFC. Ces écarts peuvent être dus à la différence de points dans le temps examinant la phosphorylation de ERK ; l'étude précédente mesurait les niveaux de pERK 12 minutes après la présentation du CS (Merlo et al., 2018), tandis que notre étude montrait que l'augmentation des niveaux de pERK revenait au niveau basal à peu près à ce moment (15 minutes après la réexposition). De plus, il est important de noter que la tâche IA permet l'observation de l'amélioration de la mémoire IA par la reconsolidation, ce qui conduit à notre constatation que l'inhibition de ERK à la phase de transition désinhibe l'amélioration de la mémoire IA.

Des études antérieures ont montré que la phosphorylation de ERK est augmentée dans la région basolatérale de l'amygdale 20 à 60 minutes après l'apprentissage par extinction de la mémoire de peur indicée (Herry et al., 2006; Merlo et al., 2014, 2018), alors que l'hippocampe montre cette activation à 1 h suite à l'extinction de l'apprentissage de la mémoire de peur contextuelle (Fischer et al., 2007 ; Tronson et al., 2009). Dans la présente étude, nous avons obtenu des observations similaires que pERK est augmenté à 30 min après la session de réactivation dans la phase d'extinction. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de ERK est une signature moléculaire commune de la phase d'extinction tardive (20 à 60 min).

De plus, nous avons observé que l'activation de ERK se produit de manière biphasique à des moments précoces et tardifs (5 et 30 min) après la session de réactivation dans la phase d'extinction, alors que cette activation se produit de manière monophasique au début de la phase de reconsolidation (Fig. 5) . De manière cohérente, l'inhibition de l'ERK dans les régions du cerveau à ces moments des phases de reconsolidation et d'extinction a bloqué la reconsolidation / amélioration et l'extinction à long terme, respectivement (Fig. 6A, C – H). Ces observations suggèrent que l'activation ERK monophasique et biphasique est nécessaire pour l'amélioration et l'extinction médiées par la reconsolidation de la mémoire IA, respectivement. Il est important de noter que ERK fonctionne comme un régulateur en amont de la phosphorylation CREB. Par conséquent, l'activation transitoire de ERK dans la phase de mémoire précoce peut, au moins en partie, contribuer à cette phosphorylation de CREB, qui active l'expression des gènes nécessaires à la reconsolidation et à l'extinction à long terme.

Semblable à nos découvertes précédentes utilisant le conditionnement contextuel de la peur (Mamiya et al., 2009), CREB a été activé dans les phases de mémoire de reconsolidation (amygdale/hippocampe/mPFC) et d'extinction (amygdale/mPFC), tandis que ERK n'a été activé que dans la phase d'extinction. à 30 min après la séance de réactivation. De manière cohérente, une seule population de neurones pCREB1/pERK- a été observée dans la phase de reconsolidation, tandis que des populations de neurones distinctes ont été observées dans la phase d'extinction : neurones pCREB1/pERK- et pCREB1/pERK1 dans l'amygdale (Fig. 2) ; Neurones pCREB–/pERK1 dans l'hippocampe (Fig. 3) ; et les neurones pCREB1/pERK-, pCREB-/pERK1 et pCREB1/pERK1 dans le mPFC (Fig. 4). Ces observations, en particulier l'observation contrastée des neurones pCREB–/pERK1 et pCREB1/pERK–, suggèrent que l'activation de CREB et ERK est régulée différemment dans chaque zone du cerveau lorsque la mémoire est éteinte et que l'activation en phase tardive de ERK joue un rôle spécifique et distinct. rôles pour l'extinction de la mémoire de la peur par rapport à d'autres processus de mémoire tels que la consolidation et la reconsolidation, comme indiqué ci-dessous. Fait intéressant, nous avons observé que les neurones pERK1 étaient plus abondants dans le mPFC par rapport à l'hippocampe et à l'amygdale, puisque le mPFC présentait un rapport plus élevé de neurones pERK1 (phase d'extinction) et de neurones pCREB1 (phase de reconsolidation) par rapport à l'hippocampe et à l'amygdale, suggérant que l'activation de ERK dans le mPFC joue un rôle plus spécifique dans l'extinction de la mémoire.

On ne sait toujours pas si des populations de neurones identiques ou différentes sont activées dans les phases de reconsolidation, de transition et de mémoire d'extinction. Une étude précédente a identifié l'activation des «neurones de peur» et des «neurones d'extinction» dans l'amygdale lorsque la mémoire de peur indicée est réactivée ou éteinte, respectivement (Herry et al., 2008). Par conséquent, il est possible que ERK et CREB soient activés dans les différentes populations de neurones avec des profils temporels différents (c'est-à-dire des « neurones de reconsolidation » et des neurones d'extinction). Comme discuté ci-dessus, les neurones pCREB1, y compris les neurones pCREB1/pERK1, peuvent réguler la reconsolidation et l'extinction à long terme de la mémoire IA par l'activation de l'expression génique en tant que neurones de reconsolidation et d'extinction, respectivement. À l'inverse, l'activation de ERK dans les neurones pCREB–/pERK1 peut contribuer à l'annulation de l'activation transcriptionnelle médiée par CREB qui serait nécessaire à la reconsolidation puisque cette activation de ERK est spécifiquement observée dans la phase d'extinction tardive ; ERK s'est activé dans les neurones de reconsolidation pour annuler l'activation de l'expression des gènes en phase d'extinction. Fait intéressant, une étude précédente a montré que l'activation ERK de l'hippocampe bloque l'induction de c-fos lorsque la mémoire de peur contextuelle est éteinte (Guedea et al., 2011), ce qui soulève la possibilité que cette activation ERK antagonise la voie de signalisation CREB. Il est important d'identifier les populations neuronales qui régulent la reconsolidation, la transition et l'extinction et d'étudier les signatures moléculaires et la signification fonctionnelle de ces neurones. De plus, les interactions entre les populations neuronales identifiées dans cette étude restent inconnues. Il est possible que les "neurones d'extinction (transition)" modulent la fonction des neurones de reconsolidation pour annuler la reconsolidation par des interactions entre eux (Eisenberg et al., 2003 ; Merlo et al., 2014). Par conséquent, il est également important d'examiner ces interactions dans et entre l'amygdale, le mPFC et l'hippocampe.

Auparavant, nous avons montré que l'hippocampe ne présente aucun changement de la phosphorylation de CREB et de l'expression de l'Arc après l'apprentissage de l'extinction de la peur contextuelle, et systématiquement, l'inhibition de la synthèse des protéines dans l'hippocampe en phase d'extinction ne parvient pas à bloquer l'extinction à long terme (Mamiya et al. , 2009). Ces observations ont soulevé la possibilité que l'hippocampe ne soit pas nécessaire à l'extinction à long terme. Cependant, nous avons montré que ERK est activé dans l'hippocampe après l'apprentissage de l'extinction de la mémoire IA, et systématiquement, le blocage de l'activation de ERK dans l'hippocampe altère l'extinction à long terme. Par conséquent, nos observations actuelles indiquent des rôles essentiels pour l'hippocampe dans l'extinction de la mémoire. Pris ensemble avec nos découvertes précédentes, nous suggérons que l'hippocampe est nécessaire pour l'extinction de la mémoire mais pas pour un processus de type consolidation pour stabiliser une « mémoire d'extinction » par l'activation de l'expression génique.