L'exposition aiguë de la peau à la lumière ultraviolette déclenche une inflammation rénale médiée par les neutrophiles

Nous et d'autres avons montré que la lumière UV induit une infiltration rapide des neutrophiles dans la peau (6, 7). Bien que les neutrophiles soient des contributeurs majeurs à l'inflammation au niveau des sites de lésions locales, il a été récemment reconnu que les neutrophiles peuvent également abriter des organes éloignés du site principal de l'inflammation (8-10), où ils contribuent aux lésions des tissus pulmonaires via la production d'oxygène réactif. espèces (ROS) (11) ou activer le système immunitaire adaptatif dans les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse (9, 12). Dans le LES, on pense que les neutrophiles jouent un rôle important dans les maladies locales et systémiques. Les neutrophiles sont présents dans les lésions cutanées des patients atteints de LED (13, 14) et dans leun reintissu de patients atteints de LN (15, 16). Une expression élevée d'une signature génique des neutrophiles est un puissant prédicteur de la maladie active, y compris la LN et les poussées cutanées (17, 18). Les granulocytes pro-inflammatoires de faible densité (LDG) sont augmentés, en particulier chez les patients atteints d'une maladie de la peau (19). Bien que ces résultats impliquent les neutrophiles dans les lésions tissulaires locales du LES, les neutrophiles fournissent-ils le lien pathogène entre l'inflammation cutanée etlésion rénalen'est pas compris.

Pour élucider l'impact de l'exposition de la peau aux rayons UV sur laun reinet le rôle que jouent les neutrophiles dans ces processus, nous avons évalué les changements dansrénall'expression des gènes de concert avec la migration des neutrophiles. Nous avons constaté qu'une exposition aiguë de la peau à la lumière UV stimule les processus inflammatoires dans leun rein,y compris l'expression de molécules d'adhésion endothéliales, de médiateurs inflammatoires, de marqueurs de lésions et d'une protéinurie transitoire. Notamment, nous avons constaté que les neutrophiles migraient vers leun reinaprès exposition à la lumière UV d'une manière dépendante de l'IL-17A, se localisant dans les zones tubulo-interstitielles (TI) où ils présentaient des phénotypes pro-inflammatoires. Suppression du blocage du trafic de neutrophiles par un traitement par immunoglobuline (IgG) anti-G-CSFrénall'inflammation et empêché la régulation à la hausse des marqueurs de lésions tubulaires. Ensemble, ces résultats démontrent que l'exposition de la peau à la lumière UV déclenche des effets subcliniquesrénalprocessus inflammatoires et lésionnels médiés par les neutrophiles.

Résultats

L'exposition de la peau à la lumière UV provoque des lésions rénales subcliniques.L'exposition au soleil a été associée à une aggravation des symptômes systémiques et à l'apparition de poussées de la maladie chez les patients atteints de LED, y compris la néphrite (2–4). Par conséquent, nous avons d'abord demandé si l'inflammation stérile aiguë de la peau déclenchée par une seule exposition à la lumière ultraviolette B (UVB) (500 mJ/cm2) chez les souris noires 6 (B6) entraînait des modifications de laun rein, y compris l'inflammation, les blessures et la protéinurie (Fig. 1A). Le poumon a été choisi comme organe de contrôle, car aucune association entre la photosensibilité et la maladie pulmonaire clinique n'a été rapportée dans le LED. Un total de 500 mJ/cm2 de lumière UVB chez des souris B6 a été défini comme deux doses érythémateuses minimales (20), la dose de référence utilisée pour la protestation humaine (21). Analyses d'expression génique de perfusésun rein tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-plierrénalinduction en s100A9, un médiateur neutrophile associé àlésions rénales(22), ainsi qu'une expression accrue de s100A6, une protéine liant le calcium associée à une lésion tubulaire (23) (Fig. 1 D et E). Alors que l'induction de s100A9 a été détectée dans les poumons, l'expression du gène s100A6 est restée inchangée dans les poumons (Annexe SI, Fig. S1). La réponse inflammatoire dans leun reinétait également associée à une augmentation précoce de l'expression de il-1 (jours 1 et 2 après UV), alors qu'il y avait peu ou pas de changement dans tnf ou il-6 (Fig. 1F). L'expression de Il-1 n'a été détectée dans les poumons que 6 jours après l'exposition de la peau à la lumière UVB (Annexe SI, Fig. S1). Induction rapide de l'expression de cxcl12, une chimiokine sécrétée par les glomérules et les tubules et impliquée danslésion rénale(24), a également été trouvé dans leun reinmais pas le poumon (Fig. 1G et annexe SI, Fig. S1). Par conséquent, les lésions cutanées déclenchées par la lumière UVB provoquent unerénalprocessus pro-inflammatoires, tandis que moins de changements sont observés dans les poumons.

En plus de la réponse pro-inflammatoire observée dans leun rein,la protéinurie et le rapport albumine/créatinine urinaire ont augmenté dans les premiers jours suivant l'exposition cutanée aux UVB (Fig. 1 H et I). Cet effet rapide surfonction rénales'est accompagnée d'une régulation à la hausse de l'expression de la lipocaline-2 etlésion rénalemolécule 1 (kim-1) (Fig. 1 J et K), marqueurs delésions rénalesqui sont également observés dans LN (25, 26). Malgré le caractère transitoire de la protéinurie, l'expression de ceslésion rénaleles marqueurs ont persisté jusqu'au jour 6 (Fig. 1 J et K), reflétant peut-être la réparation tissulaire.

L'inflammation induite par la lumière UV dans la peau entraîne la migration des neutrophiles vers le rein.Pour déterminer si les neutrophiles participent à la réponse inflammatoire systémique à la lumière UVB, nous avons examiné la cinétique de l'accumulation de neutrophiles dans la peau irradiée par la lumière UV ainsi que dans la rate,un rein,et poumon de souris C57BL/6 J (B6), une souche qui imite le mieux les changements cutanés à la lumière UVB dans la peau humaine (Fig. 2A) (27). Après une exposition aiguë de la peau aux rayons UVB, le nombre de neutrophiles dans la peau a été multiplié par sept en 24 h et est resté élevé pendant 6 jours par rapport aux niveaux pré-UV de base (D-1) ​​(Fig. 2B). Cela s'est accompagné d'une réduction du nombre de neutrophiles dans la moelle osseuse et d'une multiplication par cinq des neutrophiles sanguins circulants les jours 1 à 6 (Fig. 2 C et D). Curieusement, dans le même laps de temps, les neutrophiles ont augmenté dans la rate, les poumons etun rein(Fig. 2 Annexe E–G et SI, Fig. S2A). La cinétique précise variait d'un organe à l'autre, atteignant un pic le jour 1 dans le poumon et les jours 2 à 6 dans leun reinet la rate (Fig. 2 E–G). Dans lereins, les neutrophiles principalement localisés dans la zone tubulo-interstitielle, y compris le système vasculaire, comme indiqué par la coloration de l'élastase des neutrophiles (NE) à proximité ou colocalisée avec la molécule d'adhésion plaquettaire/cellule endothéliale-1 (PECAM-1/CD31 ) (Fig. 2H). Des images représentatives de la Fig. 2H montrent des neutrophiles dans ou autour du système vasculaire interstitiel (flèches blanches complètes) et dans l'interstitium (flèches blanches pointillées), avec des neutrophiles occasionnels, également trouvés dans les glomérules (flèches jaunes). Une localisation similaire a été détectée avec une coloration par immunofluorescence (IF) anti-Ly6G (Annexe SI, Fig. S2B).

Pour déterminer si d'autres cellules immunitaires innées ont montré des réponses locales et systémiques similaires aux neutrophiles, nous avons examiné la distribution des monocytes (CD11b plus Ly6C plus Ly6G−) aux mêmes moments après l'exposition à la lumière UVB. Alors que les monocytes ont également été recrutés dans la peau, seuls de petits nombres de monocytes infiltrants ont été détectés dans la peau.un reinau jour 6 après l'exposition aux UVB (∼2- fois contre ∼ 10.5- fois plus deun reinneutrophiles) (Fig. 2F et SI Annexe Fig, S3). Aucune augmentation du nombre de monocytes n'a été détectée dans les poumons ou la rate (Annexe SI, Fig. S3), ce qui suggère que la réponse systémique aux lésions UV était relativement sélective pour les neutrophiles.

L'infiltration de neutrophiles dans la peau s'est accompagnée de modifications histologiques, notamment une inflammation précoce du derme et la mort des cellules épidermiques (jours 1 et 2), suivies du développement d'une acanthose et d'une hyperkératose avec formation de croûte sérocellulaire dans certains cas (jour 6) (SI annexe, figure S4). Notamment, aucune lésion cutanée ouverte n'est apparue après exposition à la lumière UVB, ce qui suggère que l'infiltration observée des cellules immunitaires s'est produite dans des conditions stériles, bien qu'une contribution d'un microbiome cutané altéré ne puisse être exclue (20).

Ensemble, ces résultats démontrent que l'exposition de la peau à une seule dose de lumière UVB mobilise les neutrophiles à la fois sur le site local de l'inflammation ainsi que sur les organes internes, y compris leun rein,accompagnée d'une neutrophilie sanguine. Alors que les schémas migratoires globaux étaient similaires chez les souris mâles et femelles, l'infiltration de neutrophiles dans la peau était plus rapide chez les femelles que chez les mâles (Fig. 2B). En revanche, les lésions épidermiques par stripping n'ont pas entraîné de migration des neutrophiles vers leun reinmalgré des niveaux similaires d'infiltration de neutrophiles, de réponse inflammatoire et de lésions tissulaires, comme observé avec l'exposition aux rayons UV (Annexe SI, Fig. S5), ce qui indique que la dissémination systémique des neutrophiles n'est pas commune à toutes les formes de lésions cutanées stériles.

CISTANCHE AMÉLIORERA LES MALADIES RÉNALES/RÉNALES

IL-17A favorise le recrutement des neutrophiles après une exposition cutanée aux rayons UV.Une enquête sur les médiateurs chimiotactiques et inflammatoires dans la peau a révélé une régulation significative à la hausse de l'expression génique des chimiokines neutrophiles et des cytokines inflammatoires cxcl1, cxcl5/6, g-csf et il-1 1 à 2 jours après l'exposition aux UV (Fig. . 3 A–D). L'augmentation rapide et persistante de l'expression de s100A9 correspondait à la cinétique d'infiltration des neutrophiles dans la peau (Fig. 2B et annexe SI, Fig. S6), alors que les cytokines il-6, tnf et il-33 ont augmenté de manière transitoire et sont revenus à l'expression initiale au jour 6 (Annexe SI, Fig. S6). En revanche, il-36a n'a été élevé qu'au jour 6 (Annexe SI, Fig. S6), reflétant peut-être une fonction réparatrice. La présence transitoire (1 à 2 jours) de monocytes dans la peau (Annexe SI, Fig. S3) était parallèle à la régulation à la hausse des chimiokines spécifiques aux monocytes ccl4 et ccl2 (Annexe SI, Fig. S6). Semblable à l'accumulation de neutrophiles dans la peau des souris femelles (Fig. 2B), l'accumulation de monocytes dans la peau s'est également produite plus tôt chez les femelles que chez les mâles (Annexe SI, Fig. S3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >Induction cutanée de 1,000- fois dans l'expression de g-csf pendant les jours 1 et 2 après UV (Fig. 3C). Pour déterminer si l'induction de ces cytokines était pertinente pour la mobilisation des neutrophiles, nous avons d'abord quantifié les concentrations de protéines de cytokines dans le sang, ce qui a révélé une augmentation robuste et soutenue (10- à 100- fois) de la concentration de plasma IL-17A 6 à 24 h après l'exposition à la lumière UV (Fig. 3F), accompagnée d'une augmentation transitoire (pic à 6 h) de l'IL-6 et de l'IL-12, des cytokines qui peut être en aval de IL-17A (28) (Fig. 3 G et H). Aucune augmentation des concentrations plasmatiques d'IFN, de GM-CSF, de TNF, d'IL-10, d'IL-27, d'IL-23 ou d'IL1 n'a été observée. Pour déterminer si l'IL-17A est nécessaire au recrutement des neutrophiles induit par les UVB, nous avons bloqué l'effet de l'IL-17A avec un anticorps neutralisant avant l'exposition aux UV (Fig. 3I). Les IgG anti-IL-17A ont significativement atténué la neutrophilie sanguine (Fig. 3J) et atténué l'afflux de neutrophiles dans les tissus cutanés exposés (Fig. 3K et annexe SI, Fig. S7A) et leun rein(Fig. 3L et annexe SI, Fig. S7B). Ces résultats démontrent que le recrutement des neutrophiles en réponse à la lumière UV est médié, au moins en partie, par IL-17A.

Les neutrophiles interviennent dans l'inflammation des reins après une exposition cutanée aux UVLumière.Pour déterminer si les neutrophiles étaient responsables des changements inflammatoires dans leun rein following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000- fois après l'exposition aux UV, suggérant un rôle chimiotactique du G-CSF dans le recrutement des neutrophiles en réponse à la lumière UV, nous avons inhibé la mobilisation des neutrophiles de la moelle osseuse en bloquant le G-CSF, comme indiqué sur la figure 4A. La neutralisation du G-CSF a empêché la neutrophilie sanguine ainsi que le recrutement des neutrophiles dans leun reinaprès exposition cutanée aux UVB (Fig. 4 B et C). Notamment, comme indiqué précédemment dans différents modèles (29, 30), le blocage du G-CSF n'a pas modifié le nombre de monocytes dans leun rein(Fig. 4D). Diminution de la migration des neutrophiles vers leun reins'est accompagnée d'une réduction significative durénalexpression des molécules d'adhésion vcam-1 et e-sélectine (Fig. 4 E et F) ainsi que des médiateurs inflammatoires s100A9 et il-1 1 d après exposition aux UVB (Fig. 4 G et H). De plus, les marqueurs de lésions tissulaires lipocaline-2 et kim-1 dans leun reinont été significativement diminués chez les souris exposées à la lumière UV traitées avec un anticorps bloquant le G-CSF par rapport aux animaux exposés aux UV traités à l'isotype (Fig. 4 I et J). Comme nous l'avons signalé précédemment (6), l'exposition aiguë de la peau aux rayons UVB a déclenché une réponse à l'interféron de type I dans leun rein(Fig. 4K). Le blocage du G-CSF a réduit de manière significative, mais n'a pas complètement abrogé, le score IFN (Fig. 4K). Alors que la présence de neutrophiles dansun reinétait nécessaire pour les réponses inflammatoires et lésionnelles aiguës observées 1 jour après l'exposition cutanée aux rayons UV (Fig. 4), aucune différence de protéinurie n'a été observée à ce moment, car le pic de protéinurie s'est produit vers le jour 4 après l'exposition aux UV (Fig. 1 H et JE). Ensemble, ces données indiquent que les neutrophiles sont responsables de la réponse inflammatoire et, directement ou indirectement, contribuent à l'induction de l'interféron de type I dans leun reinsuite à une exposition de la peau aux UV. Semblable aux résultats obtenus avec les IgG anti–G-CSF, l'administration d'anticorps neutralisants anti–IL-17 a partiellement supprimé la migration des neutrophiles vers leun reinet a entraîné une diminution de l'expression des gènes deun reinmarqueurs inflammatoires (vcam-1 et s100A9) et de blessure (lipocaline-2 et kim-1), bien que seule la réduction de l'expression de kim-1 ait été statistiquement significative (Annexe SI, Fig. . S7 C–F)

Une sous-population de neutrophiles rénaux subit une migration inverse, un phénotype également détecté dans le sang des patients atteints de LED.Bien que l'on ait longtemps supposé que les neutrophiles entrant dans les sites d'infection ou d'inflammation stérile subissent ensuite une apoptose et sont rapidement éliminés par les macrophages, un certain nombre d'études ont révélé que certains neutrophiles circulent de manière bidirectionnelle, c'est-à-dire qu'après avoir pénétré dans un tissu, ils transmigrent retour dans la circulation sanguine et infiltrer un autre endroit, un processus appelé transmigration inverse (rTEM) (8, 10, 11, 31-34). Pour déterminer si les neutrophiles qui hébergent leun reinaprès exposition cutanée à la lumière UVB transitant par la peau exposée, nous avons étudié la migration des neutrophiles dans un modèle de souris B6 photoactivable (ubiquitine humaine C [UBC]-photoactivée [PA]-protéine fluorescente verte [GFP]).

Le schéma expérimental est illustré sur la figure 5A ; 1 jour après l'exposition de la peau à une dose unique de lumière UVB, la peau a été exposée à la lumière violette (405 nm) de sorte que les cellules immunitaires infiltrantes ont été photoconverties en cellules GFP-positives. Les neutrophiles photoconvertis (GFP plus Ly6G plus) ont ensuite été quantifiés en perfuséreinsle jour suivant. L'analyse par cytométrie en flux a révélé qu'environ 20 % des neutrophiles infiltrant les reins étaient positifs pour la GFP après soustraction du signal de fond (environ 10 %) (Fig. 5B). Contrairement aux modèles d'inflammation stérile dans le foie ou le muscle crémaster (8, 10), nous n'avons pas détecté de neutrophiles photoconvertis dans les poumons, peut-être parce que peu de neutrophiles ont été trouvés dans les poumons au jour 2 (Fig. 2F). Pour tester si la GFP plus les neutrophiles dans leun reinextravasés du tissu cutané exposé aux UV ou étaient PA par voie intravasculaire, nous avons comparé les changements dans le nombre de GFP plus les neutrophiles obtenus à partir dureinsde souris chez lesquelles la même peau qui a été exposée à la lumière UV était PA avec lumière violette un jour plus tard (groupe I) par rapport aux souris chez lesquelles la peau adjacente à cette exposition à la lumière UV était PA avec lumière violette un jour plus tard (groupe II, schéma dans l'annexe SI, Fig. S8A). Bien qu'il n'y ait pas eu de différences dans les pourcentages de neutrophiles circulants entre les groupes (Annexe SI, Fig. S8B), une augmentation plus importante de la GFP plus les neutrophiles a été observée dans lereinsde souris où la peau exposée aux UV était également PA (groupe I) par rapport à l'absence d'augmentation de la GFP plus les neutrophiles chez les souris où la peau non exposée aux UV était PA (groupe II) (Annexe SI, Fig. S7B). Dans le groupe II, le nombre de neutrophiles était similaire à l'arrière-plan de la positivité GFP observé sur la figure 5B (annexe SI, figure S8B).

Alors que de faibles niveaux de GFP plusun reinles neutrophiles du groupe II ont suggéré que la lumière violette n'a pas fait circuler les cellules dans la peau non exposée aux UV, il restait possible que l'exposition à la lumière UV altère les interactions des neutrophiles avec les vaisseaux sanguins de la peau, permettant une plus grande photoconversion et des conséquences ultérieures.un reinaccéder. Pour déterminer les proportions relatives de neutrophiles TEM, nous avons quantifié l'expression des marqueurs de surface utilisés pour caractériser les neutrophiles qui ont subi rTEM : CXCR4hi (8) et ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). En effet, GFP plusun reinles neutrophiles exprimaient des niveaux plus élevés de CXCR4 par rapport aux neutrophiles GFP plus dans la peau ou aux neutrophiles GFP− dans leun rein(Fig. 5C). De

intérêt,rénall'expression du ligand CXCR4, cxcl12, 1 à 2 jours après l'exposition de la peau à la lumière UVB était concomitante avec la présence de neutrophiles CXCR4hi dans leun rein(Fig. 1G), fournissant éventuellement le stimulus chimiotactique pour le recrutement de ces neutrophiles dans le rein. Fait intéressant, nous avons détecté des neutrophiles CXCR4hi et ICAM 1- hiCXCR1lo dans la moelle osseuse tard après l'exposition aux UV (jour 6, annexe SI, Fig. S9 B et C), ce qui suggère que certains de ces neutrophiles retournent également vers la moelle osseuse. moelle osseuse similaire à ce qui a été rapporté pour la rTEM suite à une lésion hépatique ou une infection virale de la peau (12, 36). Conformément à ces observations, nous avons détecté une expression plus élevée de CXCR4 sur les neutrophiles sanguins le jour 2 après l'exposition aux UV, capturant peut-être des cellules en route vers leun reinet la moelle osseuse (Annexe SI, Fig. S9D). De même, un pourcentage significativement plus élevé de cellules ICAM1hiCXCR1lo a été détecté parmi la GFP plus les neutrophiles dans leun reinpar rapport aux neutrophiles GFP plus dans la peau et aux neutrophiles GFP− dansun rein(Fig. 5D). Le phénotype ICAM1hiCXCR1lo a été détecté sur environ 20 à 35 % de la GFP plus les neutrophiles dans leun rein(Fig. 5D), suggérant qu'un sous-ensemble de neutrophiles qui migrent vers leun reinvia la peau exposée aux UV le font par transmigration inverse, alors que le reste deun reinles neutrophiles sont probablement activés lorsqu'ils circulent à travers une peau enflammée exposée aux UV. La sous-population de neutrophiles ICAM1- hiCXCR1lo a également été détectée dansreinsde souris B6 normales exposées à la lumière UV qui n'ont pas reçu de PA (Annexe SI, Fig. S9A).

Alors que les phénotypes de neutrophiles CXCR4hi et ICAM1hiCXCR1lo ont été associés à des fonctions inflammatoires et à des lésions tissulaires dans différents modèles murins (11, 31, 37), peu d'études ont été réalisées sur ces populations de cellules dans la maladie humaine. Compte tenu du rôle émergent des neutrophiles dans le LES (13, 17, 18) et de leur hétérogénéité apparente (19), nous avons recherché si les cellules polymorphonucléaires de densité normale (PMN) ou les LDG des patients atteints de LES

ont démontré les phénotypes à migration inverse : CXCR4hi (37, 38) et ICAM1hiCXCR1lo. Le profilage par cytométrie en flux des PMN et des LDG a révélé une expression plus élevée de CXCR4 à la surface de ces cellules chez les patients atteints de LES par rapport aux témoins sains (Fig. 6 A et C). De plus, nous avons trouvé un pourcentage faible mais significativement plus élevé de PMN ICAM1hiCXCR1lo dans le sang du LED (moyenne, 3,5 %) par rapport aux témoins sains (moyenne, 1,4 %) (Fig. 6B). Fait intéressant, la population de neutrophiles LDG (CD15 plus CD14loCD10 plus dans les cellules mononucléaires du sang périphérique [PBMC]) contenait un pourcentage plus élevé de cellules ICAM1hiCXCR1lo que les PMN dans le sang sain (moyenne, 7,1 %) et dans le sang SLE (moyenne, 29,4 %) (Fig. 6 B et D). La population de type rTEM était significativement plus représentée dans les LDG des patients atteints de LES par rapport aux témoins sains (Fig. 6D). Ces données identifient la présence de phénotypes de neutrophiles de type rTEM dans les PMN et en particulier les LDG chez les patients atteints de LES.

Discussion

Les effets systémiques de l'exposition de la peau aux rayons UV sont mal compris. L'identification de ces voies dans des conditions de base normales peut informer les mécanismes de l'implication systémique des tissus après une exposition au soleil qui se produit dans des maladies telles que le LED (2–4). Ici, nous rapportons plusieurs découvertes sur la façon dont l'exposition au soleil affecte le rein. Tout d'abord, nous avons démontré qu'une exposition aiguë de la peau aux rayons UVB déclenche des réactions inflammatoires et traumatiques chez lesun rein,y compris la protéinurie subclinique. Curieusement, cesrénalles changements s'accompagnaient d'une infiltration de neutrophiles dans le rein suite à une inflammation cutanée induite par la lumière UVB. La réponse des neutrophiles dépendait de l'IL-17A et du G-CSF. Les neutrophiles dans le rein avaient des phénotypes pro-inflammatoires, comme en témoigne la localisation extracellulaire de NE, une proportion plus élevée de rTEM (CXCR4hi) également appelées cellules « âgées » et ICAM1hiCXCR1lo. Les neutrophiles étaient directement impliqués dans deslésion rénale,car l'épuisement des neutrophiles a entraîné des réductions significatives de l'expression des molécules d'adhésion, des cytokines inflammatoires, de la signature IFN-I et des marqueurs de lésions rénales après une exposition cutanée aux UV.

D'autres types de lésions cutanées, telles que le décapage du ruban adhésif et l'application topique d'un agoniste du TLR7, ont été signalés comme améliorantlésion rénaledans certains modèles de lupus, bien que l'on pensait que l'amélioration de la maladie était médiée par les macrophages et les cellules dendritiques plutôt que par les neutrophiles (39, 40). Ayant démontré que le tape stripping n'entraînait pas le recrutement de neutrophiles dans leun rein, nous proposons que l'exposition à la lumière UV est différente des autres types d'inflammation cutanée stérile. Cela peut s'expliquer par la génération de photoproduits ou de médiateurs inflammatoires uniques après une lésion UV qui amorcent l'inflammation du rein, par des différences dans l'élimination des neutrophiles après UV par rapport au stripping, ou par d'autres facteurs. Nous avons observé que la lumière UV déclenchait une induction rapide et forte de l'ARN messager de l'il-17a (ARNm) dans la peau, ainsi que des niveaux élevés de protéine IL-17A circulante (∼100- fois plus) , nécessaire au recrutement des neutrophiles après exposition à la lumière UV. L'induction simultanée de 100- à 1,000- dans l'expression du g-csf cutané suggère que l'axe IL-17A/G-CSF est le mécanisme probable responsable de la neutrophilie et du retour des tissus neutrophiles en réponse à la lumière UV. Le rôle de l'IL-17A dans la régulation de la granulopoïèse et du recrutement des neutrophiles via l'induction du G-CSF est bien reconnu dans des conditions homéostatiques et quelques études ont identifié l'IL-17A comme important pour le recrutement des neutrophiles sur les sites de inflammation stérile (41, 42). Dans le lupus, une expression élevée d'IL-17A se trouve dans les lésions cutanées (43) et une augmentation des taux d'IL-17A circulants a été associée à des manifestations plus graves de la maladie (44), bien que la relation spécifique avec les neutrophiles, une population pathogène dans cette maladie (13, 17, 18), reste inexplorée. Outre ses effets directs sur la mobilisation médiée par le G-CSF des neutrophiles de la moelle osseuse, l'IL- 17A peut également contribuer à la localisation des neutrophiles dans la moelle osseuse.un reinen stimulant l'expression de molécules d'adhésion (par exemple, VCAM-1 et E-Selectin) sur lerénalendothélium (45, 46).

En utilisant le même modèle d'exposition aiguë aux UV, nous avons récemment rapporté qu'une dose unique de lumière UV déclenchait une réponse IFN-I locale et systémique, nécessaire pour un recrutement efficace des neutrophiles sur la peau (6). Puisqu'il a été démontré que l'IFN-I induisait la production d'IL-17A (47), il est plausible que ces voies, indépendamment ou de concert, conduisent au recrutement et à la migration des neutrophiles médiés par la lumière UV que nous rapportons ici. Bien que nos résultats suggèrent un rôle inflammatoire pour l'IL- 17A, des effets suppresseurs de la lumière UVB sur la signalisation de l'IL-17A ont déjà été rapportés dans le psoriasis, où l'exposition de la peau psoriasique à la lumière UVB a éliminé les cellules T pathogènes et cellules dendriques inflammatoires myéloïdes (48, 49). Étant donné que la peau psoriasique, contrairement à la peau saine, est riche en lymphocytes T produisant et répondant à l'IL-17, la différence de composition cellulaire est susceptible de déterminer la réponse à la lumière UVB, y compris l'étendue de la suppression de l'IL par la lumière UVB -17Une expression de récepteur (50). La dose d'UV peut également déterminer si l'effet inflammatoire ou thérapeutique se produit : de faibles doses sont associées à des conséquences anti-inflammatoires et immunosuppressives (51), éventuellement en inhibant les réponses des lymphocytes T CD8 (52).

Les neutrophiles jouent de multiples rôles lors de l'inflammation des tissus. Lorsqu'ils sont activés par des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes et des modèles moléculaires associés aux dommages (DAMPS) ou par l'engagement des récepteurs, les neutrophiles contribuent directement aux lésions tissulaires en libérant des protéases, des ROS et l'extrusion de pièges extracellulaires de neutrophiles (NET) (53, 54). Les neutrophiles peuvent également favoriser la réparation tissulaire par phagocytose des débris cellulaires et en permettant la revascularisation tissulaire (8). Dans le LES, une signature génétique des neutrophiles est un puissant prédicteur de la maladie active, y compris le LN et le lupus cutané (17, 18). Les neutrophiles se trouvent dans les lésions cutanées (13, 14) ainsi queun reindes spécimens de biopsie (15, 16) de patients atteints de LES et leurs propriétés inflammatoires ont été attribuées, en partie, à la formation de NET (16). Ce processus comprend une production accrue de ROS (55), la libération d'ADN mitochondrial (55) et la libération et l'induction de protéines inflammatoires, telles que s100A9 (56), IL-1b (57) et les interférons de type I (55 , 58). Nos découvertes selon lesquelles l'inhibition de la migration des neutrophiles vers le rein a abrogé s100A9 et réduit de manière significative l'expression de l'IL-1b et laun reinLe score IFN suggère que des fonctions inflammatoires similaires pourraient être en jeu. Concernant les maladies rénales du LED, les neutrophiles sont principalement localisés dans l'endothélium TI, le site d'expression accrue delésion rénalemarqueurs kim-1 et lipocaline-2 dans les tissus rénaux LN (59,60). La protéinurie peut survenir en raison d'une perméabilité excessive de la barrière glomérulaire aux protéines en raison d'une réabsorption altérée des protéines par les tubules ou d'une combinaison de ces mécanismes (61). La lésion TI chez les patients atteints de LED est une découverte pathologique fréquente dans les reins LN, y compris ceux présentant une lésion glomérulaire légère (61, 62). Il a été démontré qu'une lésion TI prédit la gravité de la LN (63, 64), mais les mécanismes qui la déclenchent sont inconnus. Étant donné que le kim -1 et la lipocaline -2 élevés sont des marqueurs reconnus de lésion TI dans le LED (26, 65) et bloquent la migration des neutrophiles vers leun reininhibé leur expression, nous proposons que la protéinurie transitoire observée après exposition aux UV est une conséquence de l'inflammation subclinique TI médiée par les neutrophiles (65). L'augmentation de l'expression rénale de vcam-1, un autre marqueur de lésion TI dans le LES (66), soutient davantage ce modèle.

En plus de propager l'inflammation sur les sites locaux de lésions stériles ou infectieuses, il a été démontré que les neutrophiles se logent dans des organes distants (8-10), où, selon le contexte, ils contribuent aux lésions tissulaires via la production de ROS (11) ou activent le système immunitaire adaptatif dans les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse (9, 12). La nature inflammatoire de ces neutrophiles a été attribuée à leur capacité à quitter le site primaire de la lésion et à migrer vers des sites secondaires, c'est-à-dire à subir une rTEM (9-11, 31-34). Nos découvertes selon lesquelles l'AP des cellules contenant de la GFP dans la peau après une exposition aux UV a conduit à la détection de GFP plus des neutrophiles dans leun reinavec le phénotype de rTEM suggèrent qu'une sous-population derénalles neutrophiles ont migré à partir de la peau exposée aux UV (la GFP plus les neutrophiles représentent environ 20 % deun reinles neutrophiles et parmi ceux-ci, 20 à 35 % sont des rTEM ; par conséquent, les rTEM représentent 4 à 7 % du totalun reinneutrophiles). Cette proportion de rTEM est comparable à la proportion rapportée après une lésion hépatique stérile (∼9 %) (36) et une lésion d'ischémie-reperfusion (∼8 %) (11). Dans d'autres circonstances, les rTEM se sont révélés pro-inflammatoires (10, 11) et ont une apoptose altérée (35), ce qui laisse penser qu'ils jouent un rôle dans les réactions induites par les UV.lésion rénale.L'expression élevée de CXCR4 sur ces neutrophiles est particulièrement pertinente, en tant que coïncidencerénall'expression de cxcl12, un ligand CXCR4 exprimé par les podocytes et les tubules (24), a été observée, fournissant probablement un signal chimiotactique pour cette population de neutrophiles. Augmentation de l'expression de CXCR4 sur les cellules immunitaires couplée à des niveaux élevés derénalCXCL12 a été identifié chez des patients atteints de LED avec LN (67), et cette voie a été impliquée dans le lupus ainsi que dans l'ischémie-reperfusionlésion rénalechez la souris (24, 68). En plus d'être un marqueur de rTEM, l'augmentation de l'expression de CXCR4 est également un indicateur de neutrophiles « âgés », qui peuvent induire des réponses inflammatoires endommageant les tissus (38). Le rôle précis de CXCR4 dans le recrutement des neutrophiles vers leun reinpeut être étudiée par l'antagonisme CXCR4 comme précédemment fait dans d'autres modèles de blessure stérile (38).

La migration tissulaire spécifique des neutrophiles et les mécanismes responsables de l'expression différentielle des molécules d'adhésion dans différents organes ne sont pas bien compris (69). Des niveaux plus élevés d'expression de la chimiokine cxcl12 dans leun reinmais pas le poumon pourrait expliquer la présence préférentielle des neutrophiles CXCR4hi dans le rein. De plus, l'induction de l'expression de vcam-1 et de la sélectine-e dans le rein, par rapport à l'absence de modification de l'expression dans le poumon, contribue probablement au recrutement et à la rétention préférentiels des neutrophiles dans le rein. L'augmentation de 5- à 6- fois de l'expression de s100A9 dans les poumons par rapport à une augmentation de 30- à 60- fois dans le rein ainsi qu'une augmentation de 6- fois dans l'expression d'il-1b dans les poumons par rapport à l'augmentation d'un facteur 16- dans les reins indique en outre des différences tissulaires dans la réponse inflammatoire. La réduction de l'infiltration des neutrophiles dans le rein après la neutralisation du G-CSF peut être attribuée à la fois à une réduction du nombre de neutrophiles en circulation et à l'activation des neutrophiles, ainsi qu'à une réduction de l'expression locale de vcam-1 et de la e-sélectine. Cependant, nous ne pouvons pas être certains si la régulation initiale de ces molécules d'adhésion suite à l'exposition cutanée aux UV est attribuée aux cytokines/DAMPS dérivés de la peau ou si les neutrophiles, par la libération de sérine protéases, contribuent directement à leur expression, comme cela a été montré dans d'autres études. contextes (70). Indépendamment des mécanismes, et notant que nous n'avons pas effectué une analyse complète de tous les tissus, nos études fournissent des preuves d'une certaine sélectivité des organes dans les effets systémiques médiés par la lumière UV. Des études futures porteront sur les conséquences fonctionnelles spécifiques aux tissus de la dissémination systémique des neutrophiles, par exemple, la fuite d'albumine vasculaire et la formation d'œdème dans les poumons (11, 36).

Chez les patients atteints de LES, il est difficile de relier sans équivoque l'exposition cutanée aux rayons UV aux exacerbations de la maladie systémique, car il existe une variation significative (1 à 3 semaines) des réponses de photosensibilité visible chez différents individus (21). De plus, subcliniquelésion rénalepeuvent facilement être manqués jusqu'à ce que des expositions consécutives à la lumière UV aggravent les effets. Bien que nous ayons découvert que les neutrophiles médiaientinflammation des reinsen réponse à la lumière UV ne provoque pas de maladie clinique chez les souris saines, un tel mécanisme peut contribuer de multiples façons aux poussées de LN chez les patients atteints de lupus photosensible. L'engagement des récepteurs Fc par les complexes immuns pourrait améliorer le recrutement des neutrophiles, entraînant la libération de ROS et de protéases (71); la capacité accrue des neutrophiles lupiques et des LDG à produire des TNE, qui, chez les patients atteints de LES, ne sont pas éliminées efficacement (72), pourrait entraîner la libération de protéases endommageant les tissus (73), la propagation de la réponse IFN-I (58) , ou des dommages directs auun reinl'endothélium en créant des lésions vasculaires et des fuites (16). De plus, les différences sous-jacentes dans la peau lupique, telles que la signalisation IFN-I améliorée (5, 74) et les défauts de la population de cellules de Langerhans protectrices (75), pourraient éclairer l'étendue et la nature des réponses systémiques médiées par les neutrophiles. Le suivi de la migration des neutrophiles couplé à l'interrogation des auto-anticorps, l'accumulation de cellules apoptotiques et les faibles niveaux de complément peuvent être abordés à l'aide de nouveaux modèles de lupus, tels que les triples mutants génétiquement définis (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− et Sle1.Mfge8− /−C3−/−) (76) ou d'autres souches de lupus suite à une exposition à la lumière UV.

Les mécanismes exacts reliant les neutrophiles à l'inflammation dans le LES pourraient, en outre, être influencés par le phénotype neutrophile/LDG, car l'hétérogénéité au sein de ces populations est devenue plus apparente (77). Nos découvertes de populations circulantes CXCR4 et ICAM1hiCXCR1lo (rTEM) élevées, en particulier dans les LDG SLE, ajoutent encore à cette hétérogénéité et suggèrent que certains des granulocytes les plus pro-inflammatoires dans le sang pourraient avoir une "expérience tissulaire" antérieure, c'est-à-dire une résidence dans le tissus d'organes affectés, tels que la peau, avant la dissémination systémique. Les phénotypes rTEM ont déjà été signalés dans le liquide synovial et les neutrophiles circulants de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (35, 78) et dans les lésions pulmonaires associées à une pancréatite aiguë (79). Leur rôle dans le LES justifie une enquête plus approfondie.

CISTANCHE AMÉLIORE LA DOULEUR RÉNALE/RÉNALE

Matériaux et méthodes

Souris.Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Washington, Seattle. Les expériences initiales ont été menées en utilisant des souris C57BL/6J mâles et femelles (Jackson Laboratory, 3 à 4 mois, Figs. 1 et 2). Des souris femelles ont été utilisées pour toutes les expériences ultérieures. Des études d'AP ont été réalisées sur B6. Souris femelles Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J (Jackson Laboratory, 3 à 4 mois). Ces souris ont été générées par injection d'un vecteur transgénique portant PAGFP (variant T203H) sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de l'ubiquitine C humaine dans des embryons C57BL/6. Les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes et maintenus dans des cycles lumière-obscurité de 12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les expériences sur tous les animaux ont été réalisées au même moment de la journée afin d'éviter l'influence du rythme circadien sur la migration des neutrophiles (38).

Exposition à la lumière UVB et au décapage du ruban adhésif.L'aspect dorsal des souris mâles et femelles C57BL/6 a été rasé au moins 24 h avant l'irradiation aux UVB, et seules les souris à peau non pigmentée ont été utilisées dans les expériences. Les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane et exposées à une dose de lumière UVB (500 mJ/cm2) à l'aide d'ampoules FS40T12/UVB (National Biological Corporation), avec un pic d'émission entre 300 et 315 nm. L'énergie lumineuse UVB au niveau de la surface dorsale a été mesurée avec un radiomètre Photo light IL1400A équipé d'un détecteur SEL240/UVB (International Light Technologies). Les souris ont été euthanasiées 1, 2 ou 6 jours après exposition à la lumière UVB, et des souris non irradiées ont été utilisées comme témoins (D-1) (Fig. 2A). Le décapage de la bande épidermique a été effectué comme décrit précédemment (7), et la peau etun reinont été évalués 24 h après la blessure

Inhibition de l'IL-17A et du G-CSF.Les souris ont été traitées par voie intraveineuse avec 100 ug d'IgG anti-souris de rat purifié -17A IgG (BioLegend) ou un contrôle d'isotype 3 h avant l'exposition à la lumière UV (1 × 500 mJ/cm2) (Fig. 3I). Présence de neutrophiles dans le sang, la peau et la solution saline perfuséeun reinle tissu a été évalué par cytométrie en flux 24 h après l'exposition aux UV comme décrit ci-dessous. La migration des neutrophiles en réponse à la lumière UV a été inhibée en traitant les souris par voie intrapéritonéale avec 50 μg d'anticorps monoclonal anti-G-CSF de souris ou de contrôle d'isotype IgG de souris (R&D Systems) 24 h et 3 h avant l'exposition cutanée à la lumière UVB (1 × 500 mJ /cm2) (figure 4A). Après perfusion cardiaque, le nombre de neutrophiles et de monocytes dansun reinont été évalués par cytométrie en flux et expression génique par qPCR, comme décrit ci-dessous. Des souris non exposées à la lumière UVB ont été utilisées comme groupe témoin supplémentaire.

Isolement des cellules de différents organes.Après l'euthanasie avec inhalation de CO2, un morceau de peau dorsale a été prélevé et conservé dans une solution RPMI (Roswell Park Memorial Institute) sur de la glace jusqu'au traitement. Le sang a été prélevé par ponction cardiaque dans des seringues recouvertes d'acide éthylènediaminetétraacétique. La perfusion cardiaque a ensuite été réalisée à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (environ 60 ml) dans le ventricule gauche après avoir sectionné l'oreillette droite. La réussite de la perfusion a été déterminée en observantun reinet pâleur pulmonaire. Les poumons, les reins, la rate et les deux fémurs ont été soigneusement retirés et placés dans une solution de RPMI sur de la glace jusqu'au traitement de l'échantillon. Les cellules ont été isolées de zones équivalentes de tissu cutané (∼30 mm2) en hachant et en digérant le tissu avec 0.28 unités/mL Liberase TM (Roche) et 0,1 mg/mL de désoxyribonucléase I ( Worthington) dans du PBS avec Ca plus 2 et Mg plus 2 pendant 60 min à 37 degrés avec agitation. Les cellules ont été isolées d'unun reinpar animal ;un reinles tissus ont été hachés et digérés dans 2 mg/mL de collagénase de type I (Worthington) pendant 30 min à 37 degrés selon un protocole publié. Les cellules pulmonaires ont été récoltées en digérant les tissus dans du PBS (Ca plus 2 et Mg plus 2) avec 1 mg/mL de collagénase de type 1 et 60 U de désoxyribonucléase I. Des rates entières ont été écrasées sur un tamis cellulaire de 40 μm et lavées avec une solution de RPMI. Le sang total et les cellules de la rate, de la moelle osseuse, des reins et des poumons ont été traités avec un tampon de lyse des globules rouges (RBC) 1X (BD Biosciences). Après isolement/digestion, les cellules de tous les tissus ont été filtrées (40 μm), lavées avec du PBS et remises en suspension dans une solution RPMI avant le comptage.

Coloration et analyse par cytométrie en flux.Les cellules ont été traitées avec Fc Block TruStain FcX (Biolegend) et colorées avec le colorant Zombie Aqua Viability (Biolegend) selon les recommandations du fournisseur. Les cellules ont été lavées et une coloration de surface a été réalisée à l'aide d'anticorps fluorescents spécifiques à la souris achetés chez Biolegend. Différentes populations de cellules myéloïdes ont été analysées dans la porte des cellules immunitaires vivantes (Zombie Aqua-CD45 plus). Le pourcentage et le nombre de neutrophiles (Ly6CintLy6Ghi) et de monocytes (Ly6C plus Ly6G−) ont été quantifiés. Le déclenchement représentatif de la cytométrie en flux est présenté dans l'annexe SI, Fig. S10. Le pourcentage d'expression et les intensités moyennes de fluorescence des marqueurs de surface dans le modèle PA (CXCR4, ICAM1 et CXCR1) ont été déterminés à l'aide de contrôles de coloration par fluorescence moins un (FMO) dans la porte des neutrophiles (Ly6Ghi). Tous les échantillons ont été traités à l'aide du cytomètre en flux CytoFLEX (Beckman Coulter) et les données ont été analysées avec la version 10 du logiciel FlowJo (Tree Star).

Études de photoactivation (PA).Les souris UBC-PA-GFP ont été rasées et une partie du dos a été irradiée avec une dose de lumière UVB (500 mJ/cm2) comme ci-dessus. Seule la zone de peau qui sera photoconvertie a été exposée à la lumière UVB, tandis que la peau restante a été recouverte d'une feuille d'aluminium. Après 24 h de blessure stérile induite par les UVB, l'intégralité de la région cutanée irradiée par les UVB a été soumise à une lumière violette (405 nm) à l'aide d'une lampe à diode électroluminescente de 50 W avec une fibre à ouverture numérique (NA) de 0,37 (Mightex) à la puissance de 100 mW (15 min d'exposition par zone). Cette méthode a été optimisée sur la base d'un protocole publié de photoconversion spécifique à la peau (80).Reinset les poumons ont été prélevés et traités pour une analyse par cytométrie en flux 24 h après l'AP, comme décrit ci-dessus. L'approche et le calendrier sont décrits dans le diagramme de la Fig. 5A. Le pourcentage de GFP plus neutrophiles dans leun reina été comparée à celle trouvée chez la souris dans trois conditions de contrôle : 1) pas d'UV et pas de PA, 2) UV mais pas de PA, et 3) pas d'UV mais PA. Niveaux d'expression de CXCR4 et phénotype ICAM1hiCXCR1lo dans les neutrophiles GFP plus et GFP− dans la peau etun reinont été évalués par cytométrie en flux en utilisant des anticorps marqués par fluorescence spécifiques à la souris achetés chez Biolegend. Pour déterminer si la GFP plus les neutrophiles dans leun reinprovenait de la peau et non du sang, la peau d'un groupe de souris a été exposée à la lumière UV et à l'AP comme décrit ci-dessus (groupe I), tandis que dans un autre groupe, la peau a été exposée à la lumière UV mais l'AP a été réalisée sur la zone de peau adjacente non exposés à la lumière UV (Groupe II) (schéma en Annexe SI, Fig. S7A).Reinsont été collectés et traités pour une analyse par cytométrie en flux comme décrit ci-dessus.

Expression génique et analyses protéomiques.Peau,un rein,et les échantillons de poumon ont été stockés dans une solution RNAlater (QIAGEN). L'ARN a été extrait par le kit RNeasy de QIAGEN et l'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé à l'aide du kit de synthèse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems). Les transcriptions des chimiokines inflammatoires, des cytokines et des molécules d'adhésion ont été quantifiées par qPCR en temps réel à l'aide des amorces répertoriées dans l'annexe SI, tableau S1 et normalisées à la moyenne des niveaux de transcription 18S. La dose de lumière UVB utilisée n'a affecté l'expression du 18S dans aucun des organes. L'expression relative des cibles d'ARNm a été déterminée à l'aide de la formule standard 2 ^ (-Ct) × coefficient. Les scores IFN ont été dérivés de l'expression de 10 gènes représentatifs stimulés par l'interféron (ISG ; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 et ifi27l2a) comme décrit précédemment (6). La moyenne et l'écart-type de l'expression relative de chaque ISG ont été déterminés dans lereinsde souris non exposées à la lumière UV (moyennoUV et SDnoUV). Ceux-ci ont ensuite été utilisés pour standardiser les niveaux d'expression de chaque ISG dans les reins des souris traitées (isotype IgG plus UVB ou a-GCSF plus UVB). Les niveaux d'expression standardisés ont ensuite été additionnés pour chaque souris pour dériver un score d'expression IFN ; i=expression de chaque ISG ; Traitement génique=niveau relatif d'expression génique après traitement ; et Gène inoUV=niveau d'expression relative des gènes chez les souris non exposées à la lumière UVB. ∑ 10 i=1=Généitraitement−moyenneGeneinoUV SD(GeneinoUV ) . Les niveaux de protéines dans le plasma et les extraits de protéines de tissus cutanés ont été mesurés à l'aide de panels d'analytes définis LEGENDplex Mouse Inflammation Panel et Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend).

Coloration IF des tissus rénaux congelés.Perfusé avec une solution salinereinsont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 h à température ambiante et, après immersion dans du saccharose à 30 %, congelés dans un milieu de coupe optimal (Sakura Finetek). Les coupes de tissu 5- μm ont été réhydratées dans du PBS avant la coloration IF. Les tissus ont été perméabilisés avec 0.1 % de Triton X-100 dans du PBS, puis bloqués dans du PBS plus 0,1 % de Triton X-100/5 % de BSA (albumine de sérum bovin)/5 % de sérum de lapin . Les cellules NE et endothéliales ont été détectées par coloration avec l'anti-souris NE Cy5 (1:100, Bioss) et l'anti-souris PECAM-1/CD31 Al488 (1:100, Biolegend), respectivement, à 4 degrés pendant la nuit. Présence de neutrophiles dansun reina été confirmé par coloration avec un anti-souris Ly6G Al647 (1:100, Biolegend). Les tissus ont été montés à l'aide de ProLong Gold avec un milieu de montage 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Invitrogen) et imagés avec le microscope à fluorescence Nikon Eclipse 90i (Histology and Imaging Core, Université de Washington).

Évaluation histologique de la peau.Des coupes de tissu cutané fixées au formol et incluses en paraffine (4 à 5 μm) ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine à l'Université de Washington Histology and Imaging Core avant UV, jour 1, jour 2 et jour 6 après irradiation UVB (n {{ 7}} femelles). La peau a été évaluée en aveugle pour les paramètres suivants : inflammation du derme/sous-cutané, mort des cellules épidermiques, acanthose, hyperkératose, formation de croûte sérocellulaire et érosion/ulcération. Ces paramètres ont été notés sur une échelle de 0 à 4 selon la gravité et l'étendue à l'exception de l'érosion/ulcération, qui a été notée comme présente (1) ou absente (0). Des images représentatives ont été prises à l'aide de NIS-Elements BR 3.2 64bit et plaquées dans Adobe Photoshop avec des ajustements d'éclairage appliqués à l'image entière. Le grossissement d'origine est indiqué.

Mesures d'urine.Les taux de protéines urinaires ont été évalués par le dosage des protéines de Bradford (Thermo Fisher Scientific). Des échantillons d'urine ont été testés à une dilution de 1:40 dans du PBS, et la concentration de protéines dans l'urine a été déterminée sur la base de dilutions en série de concentrations connues de BSA. Le rapport albumine/créatinine urinaire a été évalué en utilisant le test d'albumine Albuwell et le kit Creatinine Companion (Exocell) selon les instructions du fabricant.

Collecte d'échantillons humains et analyse par cytométrie en flux.Cette étude a été approuvée par le comité d'examen de l'établissement de l'Université de Washington (STUDY00001145). Le sang total a été prélevé dans des tubes héparinés de volontaires sains et de patients atteints de LED après consentement éclairé. Les neutrophiles (PMN) et les PBMC ont été isolés par séparation en gradient discontinu de Ficoll-Paque (GE Healthcare). Les PMN ont été purifiés à partir du culot d'érythrocytes par sédimentation à 5 % de dextrane. Après la lyse des RBC, les cellules ont été colorées avec des anticorps marqués par fluorescence achetés auprès de Biolegend, et l'expression de CXCR4 et le pourcentage de cellules ICAM1hiCXCR1lo ont été évalués dans les PMN (CD66b plus) et les LDG (CD15 plus, CD14lo et CD10 plus dans les PBMC (19)). La stratégie de déclenchement pour les LDG et la coloration ICAM1hiCXCR1lo basée sur FMO est présentée dans l'annexe SI, Fig. S11. Les échantillons ont été traités à l'aide du cytomètre en flux CytoFLEX (Beckman Coulter) et les données ont été analysées avec la version 10 du logiciel FlowJo (Tree Star).

Analyses statistiques.Les données ont été analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.) et présentées sous forme de moyenne ± SEM. La différence statistique entre les deux groupes de données a été déterminée par rapport aux témoins non irradiés (D-1) à l'aide du test de Student. Une ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples et post hoc de Tukey a été utilisée pour déterminer la signification statistique entre les trois groupes.