Un vaccin contre l'adénovirus contenant une sous-unité tronquée de la protéine S1 du SRAS-CoV-2 Spike conduit à une réponse immunitaire spécifique chez la souris

Résumécôté :Le développement d'un vaccin efficace et sûr contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) est une approche cruciale pour gérer la pandémie de coronavirus 2 de maladie respiratoire aiguë sévère (SRAS-CoV-2) à la lumière des conditions actuelles. Dans cette étude, nous avons produit un segment raccourci du gène de pointe optimisé du SRAS-CoV-2 (2 043 pb, appelé S1) capable de coder pour une protéine S1 tronquée. La protéine a été testée pour déterminer si elle pouvait provoquer une immunisation efficace chez la souris contre le SRAS-CoV-2. La présence de la protéine S1 a été confirmée par immunofluorescence et Western blot. Un vaccin adénovirus portant le fragment du gène S1 (Ad-S1) a été administré par voie intramusculaire à des souris quatre fois sur 4 semaines. L’immunité humorale à la protéine S1 du SRAS-CoV-2 a été démontrée chez toutes les souris immunisées. Le sérum de souris immunisées a démontré une excellente activité anti-infectieuse in vitro. Une réponse immunitaire humorale robuste contre le SRAS-CoV-2 a été observée chez les souris après vaccination avec Ad-S1, ce qui suggère que le vaccin contre l'adénovirus pourrait faciliter le développement de vaccins contre le SRAS-CoV-2 et d'autres vaccins génétiquement distincts. virus.

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Mots clés : SRAS-CoV-2 ; vaccins; vecteur adénoviral; Gène S1 ; immunité

1. Introduction

La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) est souvent associée à une défaillance multiviscérale et à des taux de mortalité élevés [1] et constitue une menace majeure pour la sécurité publique dans le monde entier. Au 15 juillet 2022, la pandémie de COVID-19 persistait à l'échelle mondiale, avec 557 917 904 cas confirmés, dont 6 358 899 décès, signalés à l'Organisation mondiale de la santé (OMS). En outre, un total de 12 130 881 147 doses de vaccin ont été administrées au 11 juillet 2022. Par conséquent, la conception et le développement de vaccins contre le nouveau coronavirus (nCoV) revêtent une grande importance et constituent l’une des principales priorités de santé mondiale. La protéine S est un facteur clé dans l’entrée du coronavirus 2 de la maladie respiratoire aiguë sévère du SRAS-CoV-2 (SRAS-CoV-2) dans les cellules hôtes [2,3]. La protéine se lie au récepteur de l’hôte et permet au virus de pénétrer en douceur dans la cellule hôte [4]. Les glycanes liés au N dépassent de la surface du trimère et décorent largement la protéine S, affectant le repliement de la protéine S, l'immunité humorale et le traitement de la protéase de la cellule hôte [5]. La protéine S du SRAS-CoV-2 a une densité de glycanes liés à l'azote plus faible que les autres protéines S induites par les coronavirus pathogènes humains [6]. Par conséquent, la protéine S peut être hautement immunogène et constitue une cible majeure des anticorps neutralisants. La protéine S possède trois domaines structurels, parmi lesquels le domaine S1 est l'antigène de surface de la protéine S le plus important [4]. En raison de la difficulté de produire de grandes protéines recombinantes (le domaine extracellulaire de la protéine S est d'environ 1 300 acides aminés) et du risque d'amélioration dépendante des anticorps (ADE) de l'infection, S1 (environ 700 acides aminés) et son domaine de liaison au récepteur (RBD, environ 200 acides aminés) sont largement considérées comme les cibles potentielles les plus attractives pour un vaccin contre le coronavirus [7,8]. L'adénovirus humain de sérotype 5 (HAdV-C5) est largement utilisé en virologie fondamentale comme vecteur de thérapie génique et d'administration de vaccins [9]. HAdV-C5 possède une diversité naturelle et peut parasiter la plupart des hôtes, ce qui constitue la base du développement des expérimentations animales. Les vecteurs adénoviraux recombinants présentant des défauts de réplicabilité et de réplication construits à partir de HAdV-C5 ont été largement utilisés dans l'administration de vaccins et la thérapie génique (9, 10). Actuellement, les adénovirus ont été approuvés comme vaccins contre les infections respiratoires aiguës et de nombreux essais ont été réalisés sur de tels vaccins, comme contre le paludisme et le VIH-1 [9]. Dans cet article, nous décrivons un vaccin à vecteur adénovirus humain déficient en réplication contre le SRAS-CoV-2, ainsi que sa préparation et son application. Dans cette étude, le vaccin contre l'adénovirus a été construit comme suit : le vecteur était un adénovirus humain HAdV-C5 à réplication défectueuse avec délétion E1 et E3, le plasmide squelette était un adénovirus recombinant avec pBHGlox∆E1,3Cre, la lignée cellulaire d'empaquetage était des cellules HEK293, et le gène cible était le gène de la protéine S1 tronqué du SRAS-CoV-2. L’expression de la protéine S1 dans le vaccin a été identifiée par des tests de Western blot et d’immunofluorescence. Pour déterminer la qualité des réponses immunitaires induites par les candidats vaccins basés sur les pointes, la réponse en anticorps post-vaccination a été examinée en détail. Le bénéfice immunitaire du vaccin a été évalué à l’aide d’un test de liaison des anticorps (test immuno-enzymatique [ELISA]) et d’un test de neutralisation des anticorps. Nos résultats constituent la base du développement et de l'évaluation de vaccins et de traitements contre le COVID-19 basés sur la protéine S1.

2. Matériels et méthode

2.1. Cellules et animaux

Les lignées cellulaires de rein de singe HEK293 et ​​Vero E6 ont été utilisées dans cette étude. Les deux lignées cellulaires ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 2% de sérum bovin fœtal (FBS) et de 1% de pénicilline et de streptomycine à 37 ◦C avec 5% de CO2 et une humidité saturée. Vingt souris femelles C57BL/6 (6 à 8 semaines) ont été achetées au centre expérimental animalier du Zhejiang, province du Zhejiang. Les souris ont été divisées au hasard en deux groupes de 10 souris dans chaque groupe. Un groupe a été immunisé (injection intrapéritonéale de 100 µL) avec un vecteur Ad5 exprimant la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 (Ad5-S) et l'autre avec du PBS (injection intrapéritonéale de 100 µL) comme contrôle. La quantité totale de virus était de 5 × 109 VP. Toutes les souris ont été immunisées par injection intramusculaire D0/D14 [11,12]. À J14, 100 µL de sang périphérique ont été prélevés, le sérum a été séparé et la deuxième injection a été administrée deux heures après le prélèvement sanguin. A J28, le sang a été collecté par ponction rétro-orbitale et le sérum a été séparé. Des anticorps de liaison ont été détectés 3 jours après chaque prélèvement sanguin, des anticorps neutralisants ont été détectés 7 jours après chaque prélèvement sanguin et des cytokines ont été détectées 7 jours après le deuxième prélèvement sanguin. Toutes les souris ont été euthanasiées ; tous les tests ont été effectués en stricte conformité avec les « Directives pour le soin et l'utilisation des animaux expérimentaux de la République populaire de Chine » et approuvés par le Conseil d'éthique de l'Université Shuren du Zhejiang.

2.2. Vaccins

Toutes les souches de SRAS-CoV-2 utilisées dans cette étude ont été collectées auprès de patients COVID-19 avec leur consentement. Le Laboratoire clé d'État pour le diagnostic et le traitement des maladies infectieuses a développé un vaccin à adénovirus (cellule Vero, souche WuHan, numéro GISAID : EPI_ISL_415711) contre le SRAS-CoV-2, puis le Le vaccin a été fabriqué dans un environnement conforme au niveau de biosécurité (BSL). La spécification du vaccin est de 0,5 ml/dose et contient du Tris, du NaCl, du sucre de canne, du MgCl2,6H2O, du C6H9N3O2, de l'éthanol absolu et la protéine S1 du SRAS-CoV-2.

2.3. Construction d'adénovirus recombinants

La séquence protéique S1 du SRAS-CoV-2 (n° QRU91950.1) a été obtenue auprès de PubMed. Selon la dégénérescence du gène, la séquence nucléotidique de codon optimisée adaptée à l'expression des cellules de mammifères a été conçue sur la base du principe que la séquence d'acides aminés de la protéine produit codée par la protéine S1 du SRAS-CoV-2 est restée inchangée. La longueur totale était de 2043 pb. La séquence de 50 précurseurs a été synthétisée avec l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et la séquence codant pour l'acide aminé 2-688 du SRAS-CoV-2 S1 et la séquence précurseur du tPA ont été ligaturées. Une séquence Kozak et un site de restriction Spel ont été ajoutés devant le codon d'initiation et le site de restriction Xbal a été ajouté après le codon de terminaison. Les séquences nucléotidiques des gènes ci-dessus ont été synthétisées et clonées dans pUC18 par Sangon Biotech pour obtenir le plasmide cloné du gène synthétique. La séquence du gène S1 synthétisée et le vecteur pDC316 ont été digérés avec les endonucléases de restriction SpeI et XbaI. Le fragment cible et le vecteur ont été récupérés du gel et connectés pour former un plasmide navette. Le plasmide navette du SRAS-CoV -2 a été emballé avec le plasmide squelette du système adénovirus AdMax pBHGloxd∆E1 et 3Cre par co-transfection de cellules HEK293. La solution virale primaire a été obtenue après congélation-décongélation et centrifugation répétées, et le virus a été amplifié et cultivé après purification sur plaque.

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2.4. Détermination du titre d'adénovirus

Des cellules HEK293 en bonne santé ont été sélectionnées et remises en suspension pour préparer une suspension cellulaire à 5,0 × 105 cellules/mL, qui a été ensemencée dans une plaque à 24-puits (1 mL/puits ) et cultivé à 37 ◦C dans un environnement à 5% de CO2. L'échantillon a été dilué en série dix fois et un échantillon dilué (0,1 ml) de 10−5 à 10−8 cellules a été inoculé sur une plaque à puits 24-. . Ensuite, les plaques ont été exposées à une infection à 37 ◦C avec 5 % de CO2 pendant 48 h. Ensuite, le milieu de culture a été retiré, du méthanol pré-refroidi (0,5 ml) a été ajouté et les échantillons ont été fixés à -20 ◦C pendant 20 min. Après fixation, les échantillons ont été lavés avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et bloqués avec 1% d'albumine sérique bovine (BSA, 0,2 ml) à 37 ◦C pendant 1 h. Ensuite, les anticorps primaires (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1: 2000) et secondaires (Goat pAb to MS IgG2a (HRP), Abcam ab97245, 1: 1000) ont été ajoutés et incubés pendant 1 h, au cours de laquelle du PBS a été utilisé pour le lavage. Après incubation, une solution de travail nouvellement préparée (0,2 ml) a été ajoutée et incubée pendant 5 à 10 minutes à température ambiante. Ensuite, la solution de travail a été jetée, les échantillons ont été lavés avec du PBS et du PBS (1 ml) a été ajouté à nouveau. Le nombre moyen de cellules positives dans le champ microscopique (cat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope) a été calculé, où un gradient avec 5 à 50 cellules positives dans le champ de vision a été sélectionné et au moins cinq zones ont été sélectionnées au hasard pour le comptage. . Le nombre de champs visuels dans chaque puits de la plaque à puits 24- a été calculé. Ensuite, le titre du virus a été calculé selon la formule (1) suivante :

2.5. Pcr en temps réel

Pour détecter l'expression de l'ARNm des cellules HEK293 suite à une infection virale, nous avons extrait l'ARN intermédiaire conformément au mode d'emploi de TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA). L'ARN total a été extrait à l'aide de TRIzol et traité avec de la DNase I sans RNase RQ1 (Promega, Madison, WI, USA) pour éliminer l'ADN résiduel. L'ADN complémentaire (ADNc) a été obtenu par transcription inverse de l'ARN extrait à l'aide d'un kit de réactifs PrimerScript ™ RT avec le kit gDNA Eraser (Takara, Kusatsu, Japon). Des fragments d'ADN ont été générés avec les amorces spécifiques P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30 ) et P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30 ) du gène cible (S1). Le gène a été amplifié avec les amorces P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) et P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30 ) comme contrôle interne (GAPHD).

2.6. Western Blot

Le lysat cellulaire et le surnageant ont été séparés par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide (SDS-PAGE), puis transférés sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF). Les transferts ont été visualisés avec un équipement d'imagerie par transfert Western (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). En bref, les membranes ont été transférées dans du TBST (50 mL de Tris-HCl, pH 7,5, 8 g de NaCl [0,5 mL], 0,2 g de KCl, 0,5 mL de Tween. -20) avec 5 % de lait en poudre écrémé et agité sur un shaker décolorant à température ambiante pendant 1 h. Les membranes des groupes expérimentaux et témoins ont été retirées de la solution de scellement et incubées avec l'anticorps primaire : [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, cat.#40591- T62, Sino Biological, Pékin, Chine)] à température ambiante. Les anticorps primaires ont été secoués et incubés toute la nuit sur un agitateur décolorant à 4 °C. Le transfert a été rincé avec une solution de TBST et incubé pendant 2 h avec l'anticorps secondaire [immunoglobuline G (IgG) de lapin anti-chèvre H&L (HRP) (1: 10 000, cat. # ab6721, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni)]. Après rinçage, les transferts ont été incubés pendant 1 min avec un kit de solution LumiBest ECL Substrate (cat. #4AW011-100, 4A Biotech), puis observés dans un imageur.

2.7. Test d'immunofluorescence

Les cellules HEK293 (3 × 106/puits) ont été ensemencées dans des plaques à 12-puits. Après 48 h, les cellules ont été infectées par un adénovirus contenant le gène S1 (Ad-S1). Après 48 h, le milieu a été aspiré et les cellules ont été lavées une fois avec du PBS contenant 2% de BSA et fixées pendant 15 minutes avec du méthanol pré-refroidi pendant 15 minutes à -20 ◦C. Après trois lavages avec 2 % de BSA dans du PBS, les cellules ont été perméabilisées avec 0,5 % de Triton X-100 pendant 10 min. Ensuite, les cellules ont été bloquées pendant 1 heure avec 2 ml de BSA à 2%, la solution de blocage a été jetée et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Par la suite, 2 ml d'anticorps primaire [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] ont été ajoutés à chaque puits et incubé à température ambiante pendant 1 h ou 4 ◦C pendant la nuit. Ensuite, l’échantillon a été rincé trois fois avec 2 % de BSA pendant 5 minutes par rinçage. Ensuite, 2 ml d'anticorps secondaire [IgG H&L de chèvre anti-lapin (Alexa Fluor 488) (1: 1000, cat. # 550037, ZenBio)] ont été ajoutés à chaque puits et incubés à température ambiante pendant 1 h. Ensuite, les échantillons ont été rincés trois fois avec 2% de BSA pendant 5 minutes par rinçage. Une solution de 40,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (2 ml, 1 mg/mL) (1:400, cat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) a été ajoutée à chaque puits. et a réagi pendant 10 min dans l'obscurité. L'analyse a été observée avec un système d'imagerie EVOS ™ M7000 (cat. # AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

La protéine S du SRAS-CoV-2 (1 µg/mL) a été recouverte pendant la nuit dans des plaques à 96-puits (100 µL/puits) avec 0. 05 M de tampon bicarbonate. Après lavage avec du PBST (0,2 g de KH2PO4, 2,9 g de Na2HPO4·12H2O, 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 0,5 ml de Tween-20, ajouter de l'eau jusqu'à 1000 ml) cinq Plusieurs fois, une solution de blocage a été ajoutée et incubée à 37 ◦C pendant 1 h. L'échantillon de sérum a été dilué et ajouté à chaque puits (100 µL/puits). Après 1 h d'incubation à 37 °C, les échantillons ont été lavés cinq fois avec du PBST. L'anticorps primaire [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] a été ajouté et incubé pendant 1 h, puis les échantillons ont été lavés cinq fois avec du PBST, suivis d'une incubation d'une heure à 37 ◦C avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort [IgG H&L de chèvre anti-lapin (HRP) (1: 10 000, cat. # ab6721, abcam)] et cinq lave avec du PBST. Après avoir ajouté de l'anhydride 3, 30, 5 et 50-tétraméthylbiphényle pendant 5 min, la réaction a été arrêtée avec de l'acide sulfurique 2 M. La densité optique a été mesurée à 450 nm et 630 nm par un instrument de marquage enzymatique (Molecular Devices, SpectraMax 190), puis ajustée à une courbe standard.

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2.9. Détermination des cytokines 

La plaque (cat. #T-k15048D-1, MSD) a été lavée trois fois avec 150 µL/puits de tampon de lavage et un échantillon préparé de 50 µL a été ajouté à chaque puits. Ensuite, la plaque a été scellée avec un joint adhésif et incubée à température ambiante sous agitation pendant 2 h. Ensuite, la plaque a été lavée trois fois avec 150 µL/puits de tampon de lavage et 25 µL de solution d’anticorps de détection ont été ajoutés à chaque puits. La plaque a été à nouveau scellée et incubée à température ambiante sous agitation pendant 2 h. Ensuite, la plaque a été lavée trois fois avec au moins 150 µL/puits de tampon de lavage ; 150 µL de tampon de lecture 2 × T (MSD) ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a été analysée sur un instrument MSD.

2.10. Anticorps neutralisant

2.10.1. Test de neutralisation des pseudovirus

L'activité de neutralisation du sérum de souris a été testée à l'aide d'un système pseudoviral du virus de la stomatite vésiculaire (VSV). Le sérum a été inactivé dans un bain-marie pendant {{0}},5 h à 56 °C, puis dilué en série jusqu'à la plage requise. Les cellules HEK293 ont été étalées dans une plaque à 96- puits. Le sérum dilué a été mélangé avec 200 CCID50 (la dose virale pouvant infecter 50 % de la culture cellulaire)/100 µL de suspension virale dans un rapport de 1 : 1 et placé dans un incubateur à CO2 (37 ± 1 ◦C) pendant 2 heures. Ensuite, 100 µL de solution d'entretien du virus contenant 0,5 % d'anticorps double pénicilline-streptomycine ont été ajoutés à chaque puits, et le mélange neutralisé a été inoculé dans une plaque à 96-puits contenant des cellules à raison de 100 µL par puits, avec deux puits répétés pour chaque dilution. Dans le même temps, un contrôle cellulaire normal a été défini et les cellules ont été incubées dans un incubateur à CO2 (37 ± 1 ◦C) pendant 96 h. Ensuite, 200 CCID50/100 µL de solution virale ont été dilués à 10-1~10-3. Le milieu de culture cellulaire dans la plaque à puits 96- a été jeté, 150 µL de la solution d'entretien du virus ont été ajoutés à chaque puits et la dilution de la solution virale a été inoculée à une concentration de 10-1~{{33} } dans les puits de la plaque à puits 96- (50 µL par puits). Chaque dilution a été répétée dans 8 puits ; un contrôle cellulaire normal a été établi en même temps, suivi d'une culture pendant 96 h. Les modifications du CPE cellulaire ont été observées au microscope inversé. Le contrôle cellulaire normal ne doit présenter aucun changement cytopathique et le contrôle positif doit présenter des changements de CPE. Les paramètres de neutralisation (dilutions sériques converties en logarithmes) ont été calculés en observant le CPE. Le critère séronégatif/positif était de 1 :12 comme critère positif/négatif,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Test de neutralisation en direct

L'activité de neutralisation du sérum de souris a été évaluée par un test de neutralisation en direct. Le sérum dilué a été mélangé avec du SARS-CoV-2 et incubé à 37 ◦C pendant 1 h. Le mélange a été ajouté à une plaque à puits 96- pour infecter les cellules Vero E6. Après 72- heures d'incubation à 37 ◦C, l'effet cytopathique du virus (CPE) a été observé sous un grossissement × 40 et le titre de neutralisation (l'inverse de la dilution sérique à 50 % requise pour neutraliser l'infection virale) a été calculé. Les procédures ci-dessus ont toutes été réalisées dans un environnement de niveau de biosécurité 3.

2.11. Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées par un test t à deux échantillons utilisant SPSS 26. Les valeurs p inférieures ou égales à 0,05 ont été considérées comme significatives. La tendance centrale a été mesurée avec le titre moyen géométrique (GMT).

3. Résultats

3.1. Construction d'adénovirus recombinants

Le plasmide navette d'adénovirus recombinant pAdeno-CMV-S1 avec une insertion correcte a été obtenu ; son diagramme de structure est présenté sur la figure 1. L'adénovirus recombinant contenait le génome HAdV-C5 dépourvu de la région E1/E3. Un diagramme schématique du vecteur adénovirus recombinant obtenu par la transfection du plasmide navette et du plasmide cytosquelette dans des cellules HEK293 est présenté à la figure 1.

3.2. Caractérisation de l'adénovirus recombinant

Le plasmide recombinant contenant le gène cible a été identifié par PCR (voir la figure 2A pour les résultats de l'électrophorèse sur gel). Il s'agissait d'une expérience répétée. Les séquences d'amorces étaient MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag et S1-R acaataagtagggactgggtc, et le séquençage a confirmé que la séquence était cohérente avec la conception. L’expression du SRAS-CoV-2 S1 dans les cellules a été détectée par Western blot (Figure 2B) et immunofluorescence indirecte (Figure 2C). La coloration de la bande (~ 75 kDa) a été détectée par Western blot et correspondait à la position attendue de la bande. Au niveau transcriptionnel, l'expression in vitro de S1 a été détectée par PT-PCR. Les résultats ont montré que l’expression de l’ARNm S1 dans les cellules HEK-293 était significativement supérieure à celle du groupe témoin.

Figure 1. Construction d’un vaccin à adénovirus recombinant et stratégie expérimentale. (A) pAdeno-CMV-S1 est un plasmide navette d’adénovirus recombinant contenant le gène cible S1. pBHGlox∆E1,3Cre est le plasmide squelette de l'adénovirus. pBHGlox∆E1,3Cre et pAdeno-CMV-S1 ont été extraits avec un kit d'extraction de plasmide QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Pékin, Chine). Un jour avant la transfection, les cellules HEK293 ont été passées dans un flacon de culture cellulaire de 25 cm2. Le milieu de culture était du DMEM contenant 5% de FBS sans antibiotiques. Le deuxième jour, 60 à 80 % des cellules ont été sélectionnées et la solution de transfection a été ajoutée aux cellules. Après 7 jours de transfection, les cellules ont été grattées, centrifugées, le surnageant jeté et les cellules ont été réanimées avec du PBS. Les cellules ont été congelées et décongelées à plusieurs reprises à -80 ◦C et 37 ◦C. Après centrifugation, le surnageant contenait la solution virale primaire. La souche d'adénovirus recombinante a été purifiée, amplifiée et obtenue après un traitement ultérieur et désignée Ad-S1. Le vaccin a été injecté par voie intramusculaire à des souris pour des études de suivi. (B) L’échelle de temps représentée pour la vaccination et le prélèvement de sang.

3.3. Titre d'adénovirus

Dans cette expérience, une moyenne de six cellules positives a été calculée dans cinq champs microscopiques et le virus présent dans le puits a été dilué 108 fois. Sur la base de la formule décrite dans la section Matériel et méthode, le titre d’adénovirus était de 4,74 × 1011 unités formant des plages (pfu)/mL (Figure 2D).

3.4. Immunité cellulaire post-vaccination

Au cours de la période de test, il y a eu des changements statistiquement significatifs dans les cytokines sériques (p inférieur ou égal à 0,05), qui ont principalement montré que la concentration de chimioattractant des kératinocytes/oncogène régulé par la croissance humaine (KC/GRO) était diminué et les concentrations d'IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } et TNF- ont été augmentés, tandis que la concentration d'IL-6 n'a pas été modifiée de manière significative (Figure 3).

Figure 2. Identification de la protéine recombinante HAdV-C5 – SARS-CoV-2 S1 et détermination du titre d'adénovirus. (A) Détection PCR du plasmide recombinant avec le gène cible S1. (B) Détection par Western blot du SRAS-CoV-2. Les cellules HEK293 à croissance exponentielle ont été infectées par le SRAS-CoV-2 pendant 48 h, puis la protéine cellulaire a été extraite et séparée par SDS-PAGE. L'expression du SRAS-CoV-2 a été confirmée par Western blot avec des IgG anti-lapin de chèvre. (C) Microscopie par immunofluorescence de cellules HEK-293 infectées par Ad-S1 (vert). Les cellules ont été contre-colorées avec du 40, 6-diamidino- 2-phénylindole (DAPI) pour colorer les noyaux. Barre d'échelle 1000 µm. (D) Le test de plaque a été utilisé pour la mesure. Micrographies représentant les dilutions 10-5, 10-6, 10-7 et 10-8 (de gauche à droite).

Figure 3. Ad-S1 a induit une modification des taux plasmatiques de cytokines de type 1/2, d'interférons de type 1 et d'autres cytokines. Les résultats ont été détectés en prélevant du sang sur les souris 7 jours après la première immunisation. Les données sont présentées sous forme de nuages ​​de points en boîte et en moustaches. Chaque cercle représente un seul individu. Les valeurs p ont été calculées à l'aide d'un test t à deux échantillons.

3.5. Détection des anticorps anti-SRAS-CoV-2 S1 après la vaccination

ELISA a révélé que des anticorps spécifiques du SRAS-CoV-2- étaient présents chez les souris injectées avec le premier et le deuxième Ad-S1, mais pas chez celles injectées avec la capside de l'adénovirus témoin ou la solution PBS (Ad/PBS) (Figure 4A). Des titres d'IgG de 1:210 et 1:212 ont été détectés chez les souris vaccinées Ad-S1-deux semaines après la première et la deuxième vaccination, respectivement. Le titre de dilution 28 jours après la vaccination (J28, GMT 2297,4) était 6,1- fois supérieur à celui à J14 (GMT 378,9).

Figure 4. Ad-S1 a induit des titres élevés d’anticorps (A) et une activité de neutralisation (B, C) chez la souris. (A) ELISA des IgG sériques spécifiques du SRAS-CoV-2-de souris immunisées contre Ad-S1-. (B) Analyse des activités pseudovirales du sérum des souris immunisées Ad-S 1-. (C) Analyse des activités neutralisantes du sérum des souris immunisées Ad-S 1-

3.6. Test d'anticorps neutralisants

La provocation par le SRAS-CoV-2 des cellules Vero E6 a permis la détection d'une activité neutralisante dans le sérum de souris immunisée (Figure 4B, C). Les titres de neutralisation D14 et D28 des cellules Vero E6 immunisées par Ad-S1-contre le virus vivant du SRAS-CoV{{10}} in vitro étaient de 1 :24,3 et 1 :26,3, respectivement. Le test sur pseudovirus a donné des résultats similaires à ceux du test sur virus vivants, avec des titres de neutralisation allant jusqu'à 1:28,1 et 1:29,6 à J14 et J28, respectivement. Le titre neutralisant du pseudovirus D28 (GMT 769,0) était 2,7- fois supérieur à celui du D14 (GMT 283,7).

4. Discussion

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 à<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

Dans cette étude, nous avons construit un vaccin à adénovirus recombinant SRAS-CoV-2 contenant la sous-unité S1 du SRAS-CoV-2 et l'avons désigné Ad-S1. Comme CanSinoBIO, dont la commercialisation a été approuvée [28], nous avons utilisé HAdV-C5 dans ce vaccin. L'adénovirus est largement utilisé en thérapie génique recombinante et comme vecteur de vaccin. Cependant, le taux de séropositivité au HAdV-C5 atteint 75 à 80 % dans la population normale [29]. Cela implique que l’immunité avant stockage contre les vecteurs HAdV-C5 réduit considérablement l’immunité induite par le vaccin. Développé à l'Université d'Oxford au Royaume-Uni, ChAdOx1 nCoV-19 utilise un vecteur adénovirus de chimpanzé qui, en revanche, a un taux séropositif plus faible chez l'homme et, lorsqu'il est positif, présente généralement un titre d'anticorps sériques plus faible [30] . Par conséquent, des vecteurs adénoviraux capables d’échapper à l’immunité préexistante peuvent être explorés pour améliorer l’efficacité protectrice du vaccin adénoviral. Dans la présente étude, le statut sérique des souris avant et après la vaccination a été déterminé par des tests ELISA et de neutralisation et a mis en évidence l’immunité humorale des candidats vaccins. Le sérum produit après injection intramusculaire du vaccin chez la souris a efficacement protégé les cellules Vero E6 de l’infection par le SRAS-CoV-2 in vitro (Figure 4). Nous avons également détecté une réponse immunitaire plus forte et une meilleure protection chez les souris après une seconde immunisation (Figure 4). Nos résultats expérimentaux sont similaires aux résultats expérimentaux traditionnels.

Alors que la recherche sur le SRAS-CoV-2 se poursuit, plusieurs études ont démontré que la tempête de cytokines secondaire à l'infection par le SRAS-CoV-2 peut affecter la production de lymphocytes T, rendant difficile pour les patients de maintenir une immunité à long terme contre SRAS-CoV-2 [31]. Par conséquent, il est nécessaire de déterminer si Ad-S1 peut induire une immunité médiée par les lymphocytes T chez la souris. Nos résultats ont démontré que les concentrations d'IFN et d'IL -12 ont augmenté et que les concentrations d'IL -4 ont diminué dans le groupe Ad-S1, indiquant que la survie et la croissance des cellules Th1 induites par le vaccin chez les souris. La sécrétion d'IL-12, d'IL-10 et de TNF par les cellules Th1 a légèrement augmenté dans le groupe expérimental. Ces résultats ont indiqué qu'Ad-S1 induisait efficacement une réponse des lymphocytes T biaisée Th1- chez la souris (32). L'augmentation de l'IL-5 indique que les cellules Th2 participent également à la réponse immunitaire et produisent certains effets. La concentration de KC/GRO dans le groupe expérimental était significativement réduite par rapport à celle du groupe témoin PBS, ce qui pourrait être dû à la chimiotaxie réduite des neutrophiles qui supprimait la réponse inflammatoire et permettait de contrôler légèrement les effets secondaires du vaccin. Cela serait plus bénéfique pour les personnes immunodéprimées, comme les personnes âgées ou les patients sous chimiothérapie. Li M., et coll. [29] ont développé un vaccin adénovirus utilisant Ad68 comme vecteur. Les résultats ont montré que l'activité neutralisante in vivo du SRAS-CoV-2 pouvait être détectée dans les deux semaines suivant l'immunisation intramusculaire des souris BALB/c, puis a continué à augmenter, et le titre d'anticorps neutralisants (PRNT ID50) a atteint 957,3 à huit heures. semaines. Pendant ce temps, dans l’étude de Liu J. et al. [33], des vaccins utilisant AdC6 et AdC68 comme vecteurs ont été développés ; les réponses en anticorps de liaison et neutralisantes après l'immunisation ont été générées 14 jours après la dose, avec un titre d'IgG de 7 108 (titre moyen géométrique, GMT ; AdC6) et 5 489 (GMT, AdC68). Le titre de neutralisation 50 (NT50) du test de neutralisation du pseudovirus était de 125 (GMT, AdC6) et 67 (GMT, AdC68).

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Dans la présente étude, les souris vaccinées avec Ad-S1 présentaient des titres d'IgG de 1:1010 et 1:122 détectés par ELISA deux semaines après la première et la deuxième vaccination, respectivement. Le titre de dilution d'ad-s1 était de 378,9 (GMT) 14 jours après l'inoculation et de 2297,4 (GMT) 28 jours après l'inoculation. Dans le test d'anticorps de neutralisation, les cellules Vero E6 immunisées avec Ad-S1 ont montré une neutralisation de 1:24,3 et 1:26,3 à J14 et J28 contre le virus vivant du SRAS-CoV-2 in vitro, respectivement. Les titres de neutralisation du pseudovirus à J14 et J28 étaient respectivement de 283,7 (GMT) et 769,0 (GMT). Ainsi, le vaccin dans cette étude s’est avéré plus efficace en termes de réponse immunitaire dans le modèle murin.

En raison des limites des conditions expérimentales, nous n’avons pas effectué d’analyse ELISpot (enzyme-linked immunosorbent spot) des cellules immunitaires de la rate des souris expérimentales. De plus, les expériences de protection contre les attaques du SRAS-CoV-2 sur des souris n'ont pas pu être réalisées en raison des limites du laboratoire de protection physique. Cependant, nous avons déterminé que le vaccin était très efficace sur des modèles murins et pouvait être utilisé comme souche vaccinale de réserve idéale. En outre, l'immunogénicité, l'innocuité et l'efficacité des candidats vaccins potentiels contre le SRAS-CoV-2 doivent être examinées sur des modèles animaux supplémentaires (par exemple, lapins, primates, ratons laveurs, chiens), car les modèles de souris peuvent ne pas reproduire complètement les effets immunologiques humains. caractéristiques.

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5. Conclusions

Les données obtenues à partir de nos études précliniques sur le vaccin adénovirus ont démontré que le vaccin présente une sécurité et une efficacité suffisantes. Par conséquent, il pourrait s’agir d’un vaccin prophylactique prometteur et réalisable contre l’infection par le SRAS-CoV-2.

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