Progrès dans l'identification moléculaire de Cistanche

Abstrait:CistanchesHerba, une matière médicinale rare et précieuse en Chine, a une valeur médicinale et écologique élevée. Au milieu des progrès des techniques de biologie moléculaire, diverses techniques d'identification moléculaire basées sur l'ADN ont été progressivement améliorées et des progrès importants ont été réalisés dans la recherche surCistanchesHerbe. Cet article passe en revue les techniques d'identification moléculaire à base d'ADN pourCistancheet discute des limites et des perspectives d'application, qui devrait servir de référence pour l'identification précise et l'évaluation de la qualité des Cistanches Herba, la protection et l'utilisation rationnelle des ressources, et la variété de l'élevage.

Mots clés:Cistanche; identification moléculaire; technique des marqueurs moléculaires; l'identification et la qualité; conservation des ressources

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Cistanche est la tige charnue à feuilles sèches de Cistanche deserticola YC Ma etCistanche tubulosa(Schenk) Wight, une plante du genreCistanchedans la famille Cistanche. Jiangyun, Cunyun, Cistanche et Chagangaoya (langue mongole) sont connus sous le nom de "ginseng du désert" [2]. Ces dernières années, alors que les ressources du Cistanche sauvage sont sur le point de s'épuiser et que la demande intérieure augmente de jour en jour, un grand nombre de produits contrefaits de Cistanche ont afflué sur le marché des plantes médicinales chinoises, provoquant d'énormes fluctuations des prix du marché. , et la qualité des matériaux médicinaux ne peut être garantie, ce qui met gravement en danger la sécurité des médicaments cliniques. sexe [3]. Par conséquent, la préservation, la recherche et le développement et l'utilisation rationnels des ressources de germoplasme végétal de Cistanche sont imminents, et l'identification précise des ressources de germoplasme végétal de Cistanche est particulièrement importante.

aussi important. L'édition 2020 de la "Pharmacopée de la République populaire de Chine" (ci-après dénommée "Pharmacopée chinoise") indique uniquement que les tiges charnues et écailleuses séchées de Cistanche deserticola sont utilisées comme de véritables médicaments. Du point de vue de la situation, en plus des plantes Cistanche et Cistanche tubehua recensées dans l'édition 2020 de la "Pharmacopée chinoise", il y a aussi Cistanche sinensis G. Beck, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, Lanzhou Cistanche C. lanzhouensis ZY Zhang, etc. [4], il existe également un grand nombre de phénomènes de dopage contrefaits. Avec le développement et l'amélioration continue de la technologie de la biologie moléculaire, la technologie d'identification moléculaire présente les avantages d'une moindre consommation d'échantillons, d'une vitesse et d'une précision élevées, et a été largement utilisée dans l'identification des espèces d'animaux et de plantes. Le développement de la recherche sur l'exploitation des ressources est également relativement rapide [5]. À l'heure actuelle, des progrès ont été réalisés dans l'identification des matériaux médicinaux de Cistanche par la technologie d'identification moléculaire. Selon la classification de la technologie des marqueurs moléculaires nécessaires à l'identification moléculaire [6], cet article passe en revue l'identification du germoplasme de Cistanche deserticola et d'autres aspects, et discute de l'existence de l'identification du germoplasme de Cistanche deserticola. Analyser les problèmes et proposer des solutions correspondantes, visant à fournir une référence pour la protection, l'utilisation rationnelle et la culture de nouvelles variétés de plantes Cistanche.

1 Application de la technologie des codes-barres ADN dans l'identification des plantes Cistanche

1.1 Technologie de code-barres ADN

En 2003, le professeur Paul Hebert de l'Université de Guelph au Canada a introduit la technologie des codes-barres dans le monde biologique et a proposé le concept de "code-barres ADN" [7]. La technologie des codes-barres ADN est une méthode efficace pour identifier la médecine traditionnelle chinoise et les matières premières multisourcées. Pour l'ADN respectif, les fragments candidats ont été amplifiés par la réaction en chaîne par polymérase d'amorce générale (PCR), les produits d'amplification par PCR ont été purifiés, séquencés et analysés, la séquence de code-barres d'ADN cible a été recherchée et un système de reconnaissance de code-barres d'ADN a été construit [8 ]. En conclusion, l'identification par code-barres ADN est une méthode d'identification biomoléculaire qui utilise un ou quelques fragments d'ADN standard relativement courts pour l'identification des espèces [9].

Ces dernières années, grâce à la combinaison de la technologie de séquençage à haut débit et de la technologie d'identification des codes-barres ADN, une nouvelle technologie capable de détecter simultanément des séquences de codes-barres de plusieurs espèces dans des échantillons mixtes a été développée - le métabarcode ADN, dont le principe de base consiste à appliquer un séquençage à haut débit. La technologie obtient la séquence amplifiée du code-barres mixte et identifie la composition des espèces dans l'échantillon mixte au moyen d'une analyse bioinformatique[10].

1.2 Sélection des séquences de code-barres ADN

Les séquences de code-barres pouvant être utilisées dans la technologie de code-barres ADN comprennent l'ADN de la coenzyme mitochondriale Ⅰ (CO Ⅰ), l'ARNr 12S, les séquences d'ARNr 16S et l'ADNr ribosomique 18S pour l'identification des espèces animales[11] ; ADNr 16S ribosomal pour l'identification bactérienne[12] ], fragments spécifiques du gène de l'espaceur interne transcrit (ITS) ribosomal et séquences CO I pour l'identification fongique[13] ; en raison de la lenteur de l'évolution des génomes mitochondriaux chez les plantes, les fragments de codes-barres sont principalement sélectionnés sur le génome du chloroplaste Les fragments de gènes proposés comprennent principalement rpoB, rpoC1, matK, rbcL et UPA, et les fragments de région non codante comprennent atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI et

Gène nucléé ITS[14]. En 2006, le groupe de recherche de Chen Shilin a testé la capacité de discrimination de l'ITS2 sur plus de 6 600 échantillons de plantes et a constaté que l'efficacité d'identification de l'ITS2 au niveau de l'espèce était aussi élevée que 92,7 %, ce qui indique que la séquence ITS2 peut identifier les codes-barres ADN standard de plantes médicinales et espèces étroitement apparentées. ITS2 a été utilisé comme un nouveau type de code-barres ADN universel pour les plantes médicinales [15] et a été reconnu par des experts internationaux [16].

En 2013, le Comité national de la pharmacopée a discuté et approuvé l'inclusion des lignes directrices pour l'identification moléculaire des codes-barres ADN pour les matériaux médicinaux chinois dans l'édition supplémentaire de la "Pharmacopée chinoise". ITS2 est le système d'identification par code-barres ADN de base pour les matières médicinales végétales [17].

À l'heure actuelle, de nombreux chercheurs ont mené des recherches d'identification moléculaire sur les plantes Cistanche. Selon les recherches de Chen Shilin et al. [18], ITS2 convient comme séquence de code-barres standard pour l'identification des plantes médicinales. Sun Zhiying et al [19] ont découvert que la séquence ITS2 peut être utilisée comme base pour identifier efficacement la phytothérapie chinoise Cistanche deserticola et ses produits contrefaits dans les codes-barres ADN. Wang Xiaoyue et al[20] ont utilisé les codes-barres ITS2 pour identifier 4 produits obscurcis courants de Cynomorium, Cistanche, Liedang et Cistanche, et ont établi avec succès la « carte d'identité moléculaire » des produits obscurcis de Cistanche. La méthode d'identification des plantes médicinales par les séquences ITS2 est relativement mature et présente les avantages de la rapidité, de la précision et de l'efficacité. Par conséquent, l'utilisation de la séquence ITS2 pour identifier les plantes Cistanche est devenue la méthode la plus couramment utilisée.

1.3 Flux de travail du codage à barres ADN

Le flux de travail du codage à barres ADN est similaire au fonctionnement de la recherche phylogénétique moléculaire, et les principales étapes sont illustrées à la figure 1. Gu Xiuyan [21] a obtenu la séquence de base de l'ITS et a analysé les différences entre les espèces, et a constaté que Cistanche est étroitement lié à Cistanche saline, et Cistanche à Lanzhou est étroitement liée à Cistanche, qui fournit également une base pour le développement de nouvelles sources de médicaments de Cistanche. base. Li Zhenhua et al [22] ont effectué des recherches sur l'identification moléculaire de l'ADN sur Cynomorium, Cistanche et Huanghua Liedang, et ont réalisé une identification rapide et précise de Cistanche et des contrefaçons de Cynomorium, Cistanche et Huanghualiedang par PCR spécifique au site.

Bref, il existe déjà un processus relativement complet d'identification des espèces végétales à l'aide de codes-barres ADN. L'identification des plantes Cistanche en analysant les séquences d'ADN et en établissant une base de données connexe peut fournir une base supplémentaire pour l'identification et la classification des plantes Cistanche à l'avenir.

1.4 Analyse des données du code-barres ADN

Le traitement et l'analyse des données obtenues est une tâche très importante[18]. Une fois le séquençage terminé, une comparaison de séquence et une correction manuelle sont effectuées pour éliminer les séquences et les régions d'amorce de mauvaise qualité. Les logiciels couramment utilisés incluent Chromas, CExpress[23], etc. ; L'analyse de la distance génétique de la séquence finale est généralement réalisée par le logiciel MEGA [24] pour analyser la distance génétique entre les échantillons de différentes espèces végétales, et le modèle K2P [25-26] est utilisé pour calculer la distance intraspécifique entre les espèces ; puis construisez l'arbre de phylogénie voisin (NJ), en utilisant le site Web en ligne iTol [27] pour améliorer et embellir l'arbre de développement (https://itol.embl.de/), et vérifiez le taux de support de chaque branche en fonction de le bootstrap (1000 répétitions).

La méthode BLAST est un algorithme de recherche basé sur BLAST. Il est nécessaire d'établir ou de télécharger une base de données de séquences de référence pour l'identification des espèces sur la base de données GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) pour l'analyse ultérieure des fragments de gènes et le travail d'identification des espèces [28]. Xu Danyun et al [29] ont utilisé 3 paires d'amorces universelles de code-barres d'ADN pour identifier 22 espèces de plantes Lauracées et ont identifié avec succès 20 espèces de plantes. Adolfo et al [30] ont identifié avec succès 3 espèces de plantes Pueraria en utilisant les codes-barres ITS2 et matK. Les études ci-dessus démontrent qu'en obtenant et en analysant les séquences d'ADN des plantes médicinales, les espèces végétales peuvent être identifiées rapidement et efficacement.

2 Application d'autres techniques de marqueurs moléculaires dans l'identification des plantes Cistanche

Pour les organismes, leurs traits au-dessus du niveau moléculaire sont finalement déterminés par des traits moléculaires. Par rapport à l'analyse morphologique [31] et à l'analyse chromosomique [32], les marqueurs moléculaires peuvent révéler le vrai visage de la diversité génétique biologique. Sarwat et al [33] ont utilisé le polymorphisme de longueur de fragment amplifié (AFLP), la technologie de locus microsatellite polymorphe amplifié sélectivement (SAMPL), l'amplification interséquence simple des répétitions (ISSR), l'ADN polymorphe amplifié aléatoire (RAPD) et d'autres techniques de marqueurs moléculaires pour détecter la diversité génétique. d'échantillons de Tribulus terrestris prélevés à différents endroits en Inde, et les résultats ont montré que ces quatre techniques de marqueurs moléculaires peuvent obtenir différentes empreintes ADN uniques à chaque région géographique. L'Union internationale pour la protection des obtentions végétales (UPOV) utilise également l'identification des marqueurs moléculaires de l'ADN comme moyen auxiliaire pour les tests DHS (distinction, uniformité et stabilité) des variétés végétales [34]. À l'heure actuelle, les technologies de marqueurs moléculaires telles que AFLP, RAPD et ISSR sont relativement matures et largement utilisées dans l'identification des plantes Cistanche (tableau 1).

Soutien:

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