Le vieillissement et la longévité ont toujours été des sujets séduisants pour les organismes. En tant que type de cellule souche adulte avec la capacité d'auto-renouvellement

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Résumé:La sénescence des cellules souches mésenchymateuses (CSM) non seulement entrave l'application des CSM en médecine régénérative, mais est également étroitement corrélée au vieillissement biologique et au développement de maladies dégénératives. Dans cette étude, nous avons étudié les effets anti-âge de la curcumine (Cur) sur les MSC (cBMSC) dérivés de la moelle osseuse canine et avons élucidé le mécanisme d'action potentiel basé sur la modulation de l'autophagie. Les cBMSC ont été étendus in vitro avec des procédures standard pour construire un modèle cellulaire de sénescence prématurée.dose de cistanche redditNos preuves indiquent que par rapport au troisième passage des cBMSC, de nombreux phénotypes typiques associés à la sénescence ont été observés au sixième passage des cBMSC. Le traitement Cur peut améliorer la survie du cBMSC et retarder la sénescence du cBMSC selon les observations selon lesquelles le traitement Cur (1 uM) peut améliorer l'efficacité des fibroblastes d'unités formant colonies (CFU-F) et réguler positivement l'expression de l'ARNm des facteurs de transcription pluripotents (SOX{{5} } et Nanog), ainsi que l'inhibition des activités de la bêta-galactosidase associée à la sénescence (SA- -gal) et l'expression de l'ARNm des marqueurs liés à la sénescence (pl6 et p21) et des molécules pro-inflammatoires (facteur de nécrose tumorale- (TNF-a) et interleukine-6(IL-6)). De plus, il a été observé que Cur（0.1 uM ~ 10μM） augmentait l'activité autophagique, comme identifié par la régulation à la hausse de la chaîne légère 3 (LC3) de la protéine 1 associée aux microtubules, unc51-comme la kinase activant l'autophagie -1 (ULK1), gène lié à l'autophagie (Atg)7 et Atg12, et la génération de type II de la chaîne légère 3(LC3-II), augmentant ainsi les vacuoles autophagiques et les organites vésiculaires acides, comme ainsi que de provoquer une diminution significative du niveau de protéine p62. De plus, il a été constaté que l'activateur d'autophagie rapamycine (RAP) et Cur amélioraient partiellement les caractéristiques de sénescence des cBMSC, tandis que l'inhibiteur de l'autophagie 3- méthyladénine (3- MA) aggravait la sénescence des cBMSC et le traitement Cur était capable de restaurer l'autophagie supprimée et de contrecarrer la sénescence cBMSC induite par 3-MA. Par conséquent, notre étude met en évidence le rôle important de l'autophagie induite par Cur et ses effets sur l'amélioration de la sénescence cBMSC et fournit de nouvelles informations pour retarder la sénescence et améliorer le potentiel thérapeutique des MSC.

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Mots clés:curcumine;sénescence; autophagie; cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse canine

1. Introduction

Le vieillissement et la longévité ont toujours été des sujets séduisants pour les organismes. En tant que type de cellule souche adulte ayant la capacité d'auto-renouvellement, d'immunosuppression, de différenciation et de migration, les cellules souches mésenchymateuses (MSC) résident largement dans divers tissus et organes, tels que la moelle osseuse, le tissu adipeux, le liquide amniotique, le placenta, le cordon ombilical. cordon et muscle [1,2], et jouent un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie tissulaire tout au long de la vie d'un organisme [3,4]. De nombreuses preuves ont révélé que le vieillissement biologique et le développement de nombreuses maladies dégénératives peuvent être attribués à la sénescence des CSM [5,6]. De plus, les MSC sont des sources prometteuses de thérapie régénérative à base de cellules, mais doivent généralement être étendues in vitro pour atteindre le nombre minimum de transplantation de MSC (20-100 millions) pour les traitements [7]. Cependant, la culture in vitro n'est pas capable de simuler complètement le microenvironnement in vivo des CSM et déclenche inévitablement la sénescence cellulaire [8,9] La sénescence dans les cellules mitotiques se produit en réponse à une variété de facteurs de stress, tels que le dysfonctionnement des télomères [10], l'ADN dommages [11], le stress oxydatif [12] et l'activation des oncogènes [13], et conduit finalement à l'arrêt de la division cellulaire. De plus, les CSM sénescentes présentent un effet négatif sur les fonctions biologiques, notamment l'immunomodulation, la différenciation et la migration [14]. De nombreux travaux ont tenté d'établir des stratégies efficaces pour retarder la sénescence dans les CSM. Récemment, plusieurs produits dérivés d'herbes ont été suggérés pour favoriser la santé et la longévité de l'organisme et peuvent être des outils prometteurs pour retarder la sénescence des CSM [15].

Cistanche peut anti-âge

La curcumine (Cur), un polyphénol hydrophobe extrait du curcuma de la médecine traditionnelle chinoise, a attiré une grande attention en raison de ses effets anti-inflammatoires, antioxydants, anti-apoptotiques, anti-tumoraux et anti-vieillissement dans les cellules tissulaires et certains modèles de maladies [{ {4}}]. De nombreuses études ont démontré que Cur présente des avantages pour la santé dans les maladies liées à l'âge, notamment les maladies ostéoarticulaires, neurologiques, reproductives et cardiovasculaires [20-24]. Le vieillissement est associé à des changements musculo-squelettiques et à l'initiation et à la progression de maladies ostéoarticulaires. Il a été constaté qu'une intervention alimentaire chronique avec Cur améliore la fonction motrice de la main et des doigts chez les singes d'âge moyen et a des effets bénéfiques sur les muscles squelettiques âgés [25,26]. Les données disponibles de Buhrmann et ses collègues ont révélé que Cur peut atténuer l'arthrose d'origine environnementale en équilibrant la survie des chondrocytes et les réponses inflammatoires [27,28]. De plus, Cur exerce des effets neuroprotecteurs via la médiation de l'autophagie et de l'inflammation et peut donc être une thérapie efficace pour les patients atteints de maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alexander, la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson [29,30].

En effet, le fait que Cur possède une activité pléiotropique pourrait être attribué à ses effets d'activation et de protection sur les MSC [31,32]. Plusieurs études ont confirmé que Cur est impliqué dans la régulation des capacités immunomodulatrices ; le potentiel différentiel des CSM à différentes lignées cellulaires (neurocytes, chondrocytes, adipocytes et ostéoblastes) et dans de multiples mécanismes de signalisation est impliqué dans ce processus [2831,33-35]. De plus, Cur est également considéré comme un bon antioxydant permettant d'améliorer la durée de vie des cellules souches mésenchymateuses (ADSC) dérivées du tissu adipeux du rat en raison de l'augmentation de l'expression du gène de la transcriptase inverse de la télomérase (TERT) [36]. Une étude récente a montré que l'inhibition de p65 par Cur peut empêcher la sénescence cellulaire et l'activation inflammatoire dans les CSM dérivées du cordon ombilical humain [37].bienfaits de l'extrait de cistancheDe toute évidence, une plus grande attention a été accordée aux effets anti-âge de Cur dans les MSC en raison de leur énorme potentiel thérapeutique, mais les mécanismes sous-jacents à cet effet ne sont toujours pas clairs. Certaines preuves issues d'études in vitro ont confirmé que les effets bénéfiques exercés par Cur devraient être attribués à sa modulation de l'autophagie [29,38-41]. Han et ses collègues ont démontré que Cur peut protéger les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) des dommages oxydatifs induits par H2O 2- et que des effets positifs se produisent par l'amélioration de l'autophagie via la phosphatidylinositol 3- kinase (PI3K)/Akt/ cible mammalienne de l'inhibition de la rapamycine (mTOR) [40]. Une autre étude a montré que Cur est capable de favoriser la survie cellulaire en inhibant l'apoptose induite par l'hypoxie/réoxygénation (H/R) et l'autophagie excessive chez les cardiomyocytes [41]. Par conséquent, si Cur fonctionne comme un régulateur positif ou négatif de l'autophagie dépend du stimulus producteur de stress et du réglage cellulaire, et plus de détails sont nécessaires pour déterminer si la modulation de l'autophagie par Cur est une stratégie efficace pour retarder la sénescence MSC. En tant que principe de voie de dégradation et de recyclage des substances intracellulaires, l'autophagie joue un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie cellulaire et la résistance à la pression environnementale et a montré l'énorme potentiel de retarder la sénescence cellulaire et de traiter les maladies liées à l'âge. Le dysfonctionnement des organites et l'accumulation de métabolites toxiques sont les principales caractéristiques des CSM sénescentes [42], suggérant ainsi un lien potentiel entre l'autophagie et la sénescence. Ma et ses collègues ont découvert que l'activité autophagique des BMSC âgés était diminuée par rapport aux jeunes BMSC et que l'inhibiteur de l'autophagie 3-méthyladénine (3-MA) pouvait accélérer la sénescence chez les jeunes MSC ; en revanche, ils ont découvert que la rapamycine activatrice de l'autophagie (RAP) pouvait partiellement restaurer les propriétés biologiques des BMSC vieillissantes [5]. Une étude récente a examiné le rôle de l'autophagie modulée grâce à l'utilisation de RAP et de 3-MA dans la sénescence MSC induite par le D-galactose (D-gal) et a montré que RAP atténuait remarquablement la sénescence MSC [43]. Fait intéressant, plusieurs études ont démontré qu'une augmentation de l'autophagie est observée dans les CSM sénescentes et que l'autophagie est indispensable pour maintenir les processus de sénescence des CSM [44,45]. Par conséquent, la question de savoir si l'autophagie pourrait être considérée comme un régulateur positif ou négatif de la sénescence dans les CSM reste conflictuelle et ambiguë. Par conséquent, il serait intéressant d'étudier la relation entre l'autophagie, la sénescence des MSC et Cur, ce qui pourrait fournir une perspective plus large pour retarder la sénescence et améliorer le potentiel thérapeutique des MSC.

Dans cette étude, notre objectif principal était d'élucider si le traitement Cur pouvait retarder la sénescence MSC (cBMSC) dérivée de la moelle osseuse canine et si le mécanisme sous-jacent était corrélé à la modulation de l'autophagie. À cette fin, nous avons évalué la caractérisation phénotypique, l'activité autophagique et l'expression des gènes après exposition à Cur dans les cBMSC sénescents, ainsi que si la relation entre l'autophagie et ses effets sur la sénescence des cBMSC est déterminée en utilisant 3- MA et RAP .

2. Résultats

2.1. Caractéristiques des cBMSC

Les cBMSC ont été étendus in vitro avec des procédures standard et se sont révélés être passés de manière stable sur neuf générations (données non présentées). Les cBMSC ont affiché une apparence adhérente au plastique et semblable à un fibroblaste tout au long du processus de culture (figure 1A). La capacité de différenciation des cBMSC a été confirmée par induction adipogénique et ostéogénique (Figure 1B, C). L'immunophénotype des cBMSC a été évalué par cytométrie en flux. Les résultats ont montré que la population cellulaire exprimait positivement CD90, CD105 et ITGB1, et exprimait négativement CD31, CD34 et CD45, suggérant leur origine mésenchymateuse plutôt qu'hématopoïétique (Figure 1 et Tableau 1).

2.2.cBMSCs affichent progressivement des caractéristiques sénescentes au fur et à mesure de l'expansion in vitro

Les cBMSC à passage précoce (P1 et P3) affichent une longue forme fusiforme ou triangulaire et sont disposés dans un tourbillon après croissance in vitro (figure 2A). Par la suite, les cBMSC ont progressivement affiché des phénotypes associés à la sénescence au cours d'une culture à long terme in vitro, caractérisée par une morphologie élargie et plate et une réduction de la prolifération (figure 2A, B). De plus, les résultats d'un essai d'unité de formation de colonies de fibroblastes (CFU-F) ont montré que le nombre de CFU-F et la taille des colonies étaient significativement diminués le long des passages de culture (Figure 2C), conformément à l'ARNm régulé à la baisse expression des facteurs de transcription pluripotentes Nanog et SOX-2 au 6ème et 9ème passage (Figure 2G).

La -galactosidase associée à la sénescence (SA- -gal) est une enzyme lysosomale dont l'activité est fortement corrélée à la sénescence cellulaire [46]. Les résultats de la coloration SA- -gal ont indiqué que le nombre de cellules SA- -gal positives est passé de 7,5 ± 2,4 % (P3) à 65.0 ±5.0 pour cent (P6) et 87,3 ± 3,3 pour cent (P9), respectivement (Figure 2D).cistanche gengis khanDe plus, des augmentations de l'expression des inhibiteurs de la kinase du cycle cellulaire (p21 et p16) et des molécules pro-inflammatoires (TNF- et IL-6), qui agissent comme composants d'un phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP), ont été détectées dans le 6ème et 9ème passage (Figure 2E, F). Par conséquent, les cBMSC présentent une augmentation dépendante du passage des phénotypes sénescents et cessent la prolifération au 9ème passage.

2.3. Cur soulage l'état de sénescence des cBMSC

Les cBMSC du 6ème passage ont été incubés en l'absence ou en présence de Cur à des doses de 0.1,0.5,1,5 ou 10μmol/mL（μM） pour 12h, 24h, 48h et 72h, et leur viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide de CCK-8. Les résultats ont montré que Cur (0.1-10 uM) n'induit pas d'effet toxique dans les cBMSC et a des effets palpables sur l'augmentation de la viabilité des cBMSC après 24 h de traitement (figure 3A). Pour évaluer l'effet de Cur sur la sénescence cellulaire, les cBMSC ont été exposés à différentes concentrations de Cur (0, 1, 1 et 10 uM) pendant 24 h. Le résultat a montré que le nombre de cellules SA - - gal-positives était significativement diminué dans les cBMSC après traitement avec Cur (1 μM et 10 uM) par rapport au groupe témoin (Figure 3B). Des tests CFU-F ont été utilisés pour évaluer les effets de Cur sur l'efficacité d'auto-renouvellement des cBMSC (P6). La dose de 1 uM de Cur s'est avérée être la concentration la plus efficace pour améliorer l'efficacité du CFU-F des cBMSC. Cependant, la dose de 10 μM de Cur a eu des effets néfastes sur l'efficacité d'auto-renouvellement des cBMSC (Figure 3C). IL-6, et TNF- et régulation à la hausse de l'expression de Nanog et SOX-2 (Figure 3D-F).prolongation de la durée de vie du cistanchePris ensemble, ces résultats indiquent que Cur à une dose de 1 uM peut exercer efficacement des effets cytoprotecteurs sur les cBMSC sénescents.

2.4. Activité autophagique améliorée par le traitement Cur dans les cBMSC

L'activation fonctionnelle des lysosomes joue un rôle critique au cours de l'autophagie et les troubles de l'acidification lysosomale sont défavorables à la fonction de dégradation lysosomale [38]. Par conséquent, l'activité autophagique a d'abord été détectée par la coloration LysoTracker, qui peut surveiller l'acidification lysosomale. Le résultat a indiqué que le préconditionnement avec Cur dose-dépendante améliorait l'intensité de la fluorescence rouge dans les cBMSC, ce qui suggérait que l'acidification des lysosomes avait été augmentée (figure 4D).

Pour évaluer davantage les effets de Cur sur l'autophagie des cBMSC, nous avons utilisé les marqueurs autophagosomes protéine associée aux microtubules 1A/1Belight chain 3 (LC3) et p62/SQSTM1, qui sont des marqueurs essentiels pour évaluer le flux autophagique [47,48 ]. L'activité autophagique accrue a été observée dans les cBMSC après exposition à Cur, comme le montre une augmentation dose-dépendante de la conversion de LC{{10}}I en LC3-II, parallèlement à l'accélération de p62 dégradation(Figure 4A). En outre, l'expression de l'ARNm de ATG7, ATG12.LC3. et ULK1 ont été régulés positivement après le traitement Cur (Figure 4B). L'ultrastructure des cBMSC a été examinée par microscopie électronique à transmission. Nous avons ensuite observé une augmentation de la formation d'autophagosomes et d'autolysosomes dans les cBMSC après traitement avec Cur à des doses de 0,1, 1 et 10 μM pendant 24 h (Figure 4C).cistanche nzLa coloration par immunofluorescence a également montré que le nombre de points fluorescents ponctués caractéristiques de LC3 était significativement augmenté par le traitement Cur (Figure 4E). Ces résultats indiquent que Cur peut favoriser l'acidification lysosomale et l'activation de l'autophagie de manière dose-dépendante.

Cet article est extrait de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms