Une stratégie innée de détection de pathogènes impliquant l'ubiquitination de protéines de surface bactériennes Partie 1

INTRODUCTION

L'invasion pathogène déclenche une batterie de réponses immunitaires stimulées par les mécanismes de surveillance de l'hôte. Ceci est généralement initié par la reconnaissance de structures moléculaires microbiennes conservées connues sous le nom de modèles moléculaires associés aux pathogènes (PAMP). Une détection efficace de ces PAMP par les récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) induit rapidement diverses réponses immunitaires de l'hôte via l'activation de voies de signalisation complexes déclenchant la clairance des agents pathogènes.

Ces dernières années, avec le développement de la biotechnologie et l'amélioration continue de la technologie de recherche, les gens ont une meilleure compréhension de la relation entre les molécules microbiennes et l'immunité. Les molécules microbiennes conservées sont une classe de molécules microbiennes qui peuvent être reconnues par les organismes et déclencher des réponses immunitaires. Ils comprennent principalement des composants moléculaires de micro-organismes tels que des bactéries, des virus et des champignons, et sont hautement conservés et spécifiques. Des études ont montré que les molécules microbiennes conservées peuvent résister à divers agents pathogènes et renforcer l'immunité en activant le système immunitaire de l'organisme.

Les molécules microbiennes conservées déclenchent des réponses inflammatoires et immunitaires en activant des molécules importantes du système immunitaire, telles que les lymphocytes T, les lymphocytes B et les macrophages. Après avoir reconnu les molécules microbiennes conservées, ces cellules libèrent divers médiateurs immunitaires, notamment des cytokines et des chimiokines, attirant ainsi d'autres cellules immunitaires pour rejoindre la réponse immunitaire. Dans le même temps, les molécules microbiennes conservées peuvent également servir d'antigènes pour activer les réponses anticorps dans le corps, formant ainsi une protection anticorps. L'interaction de ces cellules et des facteurs immunitaires peut mieux protéger le corps contre les agents pathogènes.

De nombreuses études ont montré que les molécules microbiennes conservées peuvent améliorer l'immunité de l'organisme, prévenant et traitant ainsi une variété de maladies, telles que les maladies infectieuses, les maladies allergiques, le cancer, etc. Par exemple, le vaccin recombinant contre l'hépatite B couramment utilisé est fabriqué sur la base du molécule microbienne conservée sur l'antigène de surface du virus de l'hépatite B. La réponse immunitaire du corps peut être induite par l'inoculation du vaccin, pour générer l'anticorps de surface du virus de l'hépatite B, afin d'atteindre l'objectif de prévention de l'infection par le virus de l'hépatite B.

En conclusion, il existe un lien fort entre les molécules microbiennes conservées et l'immunité. En utilisant pleinement la fonction immunomodulatrice des molécules microbiennes conservées, l'immunité du corps peut être améliorée et diverses maladies peuvent être mieux prévenues et traitées. Par conséquent, nous devons prêter une attention active à la recherche appliquée sur les molécules microbiennes conservées et promouvoir leur application dans la prévention et le traitement des maladies. De ce point de vue, nous devons améliorer l'immunité. Cistanche peut améliorer considérablement l'immunité, car la cendre de viande contient une variété d'ingrédients biologiquement actifs, tels que des polysaccharides, deux champignons et Huangli, etc. Ces ingrédients peuvent stimuler le système immunitaire. Différents types de cellules augmentent leur activité immunitaire.

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À ce jour, plusieurs classes de PRR, telles que les récepteurs de type Toll, les récepteurs de type gène I inductible par l'acide rétinoïque (RIG-I), les récepteurs de type NOD et les récepteurs d'ADN (capteurs cytosoliques pour l'ADN), ont été découvertes et caractérisées (1 ). Ces PRR sont à la pointe de la reconnaissance des agents pathogènes extracellulaires et intracellulaires et détectent diverses classes de molécules dans les microbes, notamment les protéines, les lipides, les glucides et les acides nucléiques (2). Ceci est essentiel pour arrêter la progression de la maladie et favoriser la survie de l'hôte.

La surveillance du milieu intracellulaire pour la restriction de la prolifération des agents pathogènes est essentielle pour préserver la stérilité cytosolique. Une violation de ces mécanismes de défense fournit à l'agent pathogène un refuge contre l'immunité innée extracellulaire et offre une opportunité de multiplication et de dissémination rapides au sein de l'hôte (3). Par conséquent, de puissants mécanismes de détection des agents pathogènes et des systèmes de défense autonomes des cellules sont essentiels pour limiter les agents pathogènes invasifs. L'ubiquitination est une stratégie qui joue un rôle central dans la reconnaissance et l'élimination des agents pathogènes (4).

La voie de dégradation dictée par l'ubiquitination agit comme une frontière finale contre les bactéries vivant dans le cytosol qui échappent souvent à la destruction endocytaire classique en rompant les vacuoles contenant des agents pathogènes pour envahir le cytosol de l'hôte. Plusieurs ligases d'ubiquitine E3 hôtes ont été identifiées pour décorer les cargaisons, y compris les agents pathogènes intracellulaires avec des chaînes de poly-ubiquitine (Ub) (5), et bien que peu de cibles bactériennes telles que les protéines de la membrane externe aient été détectées (6), une connaissance approfondie de la stratégie d'identification du substrat reste limité.

Une étude récente a démontré que les protéines effectrices sécrétées contenaient le domaine associé à l'ubiquitine (UBA) chez Mycobacterium tuberculosis (Mtb) qui recrutent passivement des fragments d'ubiquitine, délivrant finalement l'agent pathogène aux autophagosomes associés à la protéine 1A/1B-chaîne légère 3 (LC3) associée aux microtubules. (7). Parallèlement, des substrats d'ubiquitine inhabituels tels que le lipopolysaccharide (LPS) et le glycane ont été élégamment illustrés dans quelques agents pathogènes bactériens, montrant la polyvalence des substrats d'ubiquitination (8, 9).

De manière complémentaire, Rickettsia parkeri s'est avéré modifier activement les protéines de surface, les protégeant de l'ubiquitination et de la destruction ultérieure (10). Ensemble, ces études indépendantes soulignent l'importance de la localisation de surface du substrat d'ubiquitine. Cependant, l'identité d'un substrat protéique dans l'agent pathogène et la manière dont il pourrait être identifié avec précision par la ligase E3 de l'hôte restent insaisissables.
Un certain nombre d'ubiquitine ligases hôtes, telles que la répétition riche en leucine et le motif stérile contenant 1 (LRSAM1), Parkin, Ring finger protein 166 (RNF166), RNF213, Ariadne RING-BetweenRING-RING (RBR) E3- l'ubiquitine protéine ligase 1 (ARIH1), l'E3-protéine ubiquitine ligase 1 spécifique au SMAD (Smurf1) et le complexe contenant la protéine Skip-Cullin-F-box 2 (SCFFBXO2) sont signalés pour décorer les pathogènes ou les vacuoles contenant des pathogènes avec une variété de topologies de chaînes d'ubiquitine (8, 9, 11-18). Notamment, en particulier, LRSAM1 par auto-ubiquitination génère éventuellement un signal d'ubiquitine robuste autour de la bactérie pour recruter la machinerie autophagique (19, 20). Les ligases d'ubiquitine responsables du marquage des agents pathogènes sont également impliquées dans le maintien de l'homéostasie cellulaire, créant un système extrêmement frugal pour une utilisation efficace et optimale des ressources.

Parmi les différentes topologies de chaînes d'ubiquitine formées sur l'agent pathogène, la décoration M1-Ub entraîne principalement l'induction de l'inflammation (21), tandis que les topologies de chaînes K48- et K63-Ub ciblent efficacement les microbes vers le autophagie ou système protéasomique, respectivement (22). Nous avons récemment démontré que la chaîne K48-Ub a un effet antibactérien plus dominant que K63-Ub (23). Généralement, les protéines cellulaires destinées à la dégradation protéasomique sont marquées par des ligases spécifiques de la chaîne K48- Ub. Le signal critique pour la reconnaissance du substrat par de telles ligases est principalement dirigé par un motif degron (24).

Dans cette étude, nous identifions l'existence de motifs degron dans les protéines de surface de bactéries phylogénétiquement diverses d'origine Gram-positive et Gram-négative. Le ciblage de tels substrats par la machinerie d'ubiquitination propulse une élimination efficace des agents pathogènes de la cellule hôte. En utilisant cela, nous démontrons la conversion d'une protéine de surface non ubiquitinable en un substrat d'ubiquitine par l'ingénierie de l'insertion de degron pour favoriser la clairance bactérienne. Ce principe simple mais générique d'identification des substrats bactériens sert potentiellement de mécanisme conservé de reconnaissance des agents pathogènes cytosoliques, promettant d'être efficace et polyvalent pour repousser les infections bactériennes.

RÉSULTATS

La chaîne K48-Ub favorise la détection des pathogènes bactériens cytosoliques

Lors de la détection de l'invasion cytosolique par des agents pathogènes, l'hôte les a marqués avec des chaînes poly-Ub pour déclencher leur clairance (22). Étant donné que ces chaînes polyUb sont principalement composées de K48- et K63-Ub, nous avons d'abord exploré la prédominance et la localisation spatiale de ces types de chaînes sur deux agents pathogènes phylogénétiquement distincts, Streptococcus pneumoniae (SPN) et Salmonella enterica serovar Typhimurium (STM), qui provoquent respectivement une pneumonie et une gastro-entérite chez l'homme. Pour ces agents pathogènes, la survie et la prolifération dans le cytosol de la cellule hôte ont été documentées (13, 25). En utilisant des anticorps spécifiques à la liaison de l'ubiquitine, nous avons observé qu'une proportion significativement plus élevée de bactéries intracellulaires étaient marquées avec le type de chaîne K48- Ub (~ 26 % pour SPN et 37 % pour STm) contrairement à K63- Ub (Fig. 1A).

L'analyse de la localisation spatiale par microscopie à illumination structurée (SIM) a indiqué que les bactéries cytosoliques (sans restes vacuolaires) ou exposées au cytosol (dans l'endosome endommagé) sont principalement associées à K48-Ub, tandis que K63-Ub le signal était localisé sur les endosomes endommagés, marqués à la galectine -8 (Gal8 ; marqueur de détection des dommages aux endosomes) (Fig. 1, B à E) (26). Environ 99 et ~ 76 % des SPN et STm ubiquitinés par K 48-, respectivement, étaient dépourvus de Gal8 (Fig. 1F). La présence bactérienne dans le cytosol a ensuite été validée par microscopie électronique à transmission (MET) et immunomarquage avec un marqueur membranaire FM4-64 (fig. S1, A à F). Nous avons trouvé respectivement 78,4 et 80,4 % de SPN et STm K48-Ub-positifs, dépourvus de toute association membranaire, tandis que 77,7 et 74,4 % de SPN et STm K63-Ub-positifs, respectivement, étaient confinés dans la vacuole (Fig. 1G). Ensemble, ces résultats suggèrent que le revêtement de la surface bactérienne avec des chaînes K48-Ub est un mécanisme majeur de détection des agents pathogènes utilisé par l'hôte pour reconnaître les microbes vivant dans le cytosol.

Degron est un code générique pour l'ubiquitination bactérienne

Nous avons ensuite tenté d'identifier le substrat pour l'ubiquitination de K48 sur la surface bactérienne. De manière critique, les ligases d'ubiquitine E3 hôtes, qui seraient impliquées dans l'ubiquitination bactérienne, sont également impliquées dans des fonctions cellulaires cruciales (12, 14) où les chaînes K48-Ub agissent comme un signal majeur pour la protéostase cellulaire. Nous avons émis l'hypothèse que des principes similaires pourraient être adoptés par l'hôte pour l'identification du substrat K48-Ub sur la surface bactérienne. Pour les protéines hôtes, la présence d'un motif tripartite (une séquence primaire degron suivie d'un résidu de lysine proximal et d'une région désordonnée entre les deux) est signalée comme une condition préalable à l'ubiquitination de K48 (24).

Nous avons criblé les protéines de surface de SPN pour la présence de caractéristiques similaires (Fig. 1H), identifiant BgaA et PspA comme cibles putatives pour l'ubiquitination (Fig. 1H et Fig. S2, A et B). BgaA est une -galactosidase qui fonctionnerait comme une adhésine pour le SPN, tandis que PspA est une protéine de liaison à la choline qui lie la lactoferrine et est nécessaire pour l'évasion du complément (27, 28). Nous avons observé une réduction d'environ 50 à 53 % de l'association du type de chaîne K48-Ub pour les mutants ΔbgaA et ΔpspA, sans aucune modification des niveaux de K63-Ub (Fig. 1I). Cette réduction était prononcée (~ 75 pour cent) dans une souche à double knock-out (ΔbgaAΔpspA), suggérant la nature non redondante de ces substrats d'ubiquitine (Fig. 1I).

De plus, l'expression de BgaA-T (une version tronquée de la protéine, constituée des acides aminés 1 à 1049) et de PspA dans les cellules hôtes conduit à leur ubiquitination avec la topologie K48-Ub (Fig. 1J). La validité des cibles prédites a été confirmée par complémentation et le modèle a été renforcé en utilisant le mutant ΔhysA (protéine de surface SPN qui ne remplit pas les critères de degron tripartites) comme contrôle pour marquer les niveaux d'association K 48- Ub (Fig. 1I ).

Nous avons ensuite exploré l'effet de la décoration K48-Ub sur la clairance bactérienne.

L'absence de substrats K48-Ub a entravé la clairance bactérienne, ce qui a entraîné une amélioration significative de la persistance intracellulaire pour les deux souches SPN mutantes (~ 1,8- fois pour ΔbgaA et ~2- fois pour ΔpspA) ( figure 1K). L'universalité de notre approche de prédiction de substrat a été validée par l'identification de plusieurs protéines exposées en surface dans divers autres agents pathogènes en tant que substrats putatifs pour l'ubiquitination (tableau S1). L'un de ces candidats putatifs, une protéine de membrane externe RlpA sur STm, a été confirmé comme cible pour la machinerie d'ubiquitination de l'hôte, car le mutant ΔrlpA présentait une association réduite d'environ 1,5- fois avec K48-Ub par rapport à l'Ub sauvage -type (WT) STm (Fig. 1L). Cette découverte a établi la large applicabilité de notre stratégie de sélection de substrat. À notre connaissance, ce sont les premières protéines de surface bactériennes reconnues par la machinerie d'ubiquitination de l'hôte pour la détection et la clairance des agents pathogènes.

Un motif tripartite est une condition préalable au marquage précis par l'ubiquitine des protéines de surface bactériennes

Suite à l'identification du substrat, nous avons cherché à tester les caractéristiques critiques du motif tripartite qui formait l'épine dorsale de notre écran (Fig. 2A et Fig. S2A). La suppression de la séquence degron ( 102VTPKEE107) dans BgaA-T a entraîné une chute d'environ 50 % de l'association du type de chaîne K 48- Ub, par rapport au SPN WT, indépendamment de la cinétique de croissance et de la capacité d'adhérence cellulaire similaires (Fig. 2C et Fig. S3, A et B). Cette réduction était comparable à la souche knock-out ΔbgaA, confirmant le phénotype spécifique de degron. Outre la séquence degron, un résidu de lysine à proximité immédiate est crucial pour la fixation de la fraction ubiquitine au substrat. Dans BgaA, la séquence degron s'accompagne de deux ubiquitinations proximales de K48 considérablement réduites par rapport à BgaA-T (Fig. 2D). Notamment, la possibilité d'un changement conformationnel sévère de la protéine BgaA-TΔDegron pour affecter l'ubiquitination a été annulée par la prédiction in silico et la spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) de la protéine BgaA-TΔDegron purifiée, qui a montré des signatures structurelles similaires à BgaA-T (fig. S3, C et D). Comme BgaA, la suppression de la séquence degron (327PETPAPE333) et la mutation de la lysine (K315R) dans PspA ont également entraîné une réduction significative de l'association K48-Ub, associée à une capacité de survie prolongée (fig. S4, A à D).

Nous avons ensuite conçu la protéine de surface SPN HysA, dépourvue à l'origine d'une séquence degron primaire, en ajoutant une séquence degron dans une région structurellement désordonnée de la protéine qui contient un résidu de lysine (Fig. 2, F et G, et fig. S2, C doigt de pied). Cette modification a conféré la reconnaissance et l'ubiquitination K48 de la protéine HysA précédemment non ubiquitinable. Les niveaux d'association K48-Ub des souches SPN portant la protéine HysA modifiée (ΔbgaA : pHysADegron-BgaA et ΔpspA : pHysADegron-PspA) étaient 2,2- et 3,2- fois plus élevés que soit ΔbgaA et ΔbgaA: souches pHysA ou ΔpspA, respectivement (Fig. 2H).

La décoration améliorée des souches ΔbgaA: pHysADegron-BgaA et ΔpspA: pHysADegron-PspA avec K 48- Ub a privé SPN du gain de survie fourni par l'absence de degron dans ΔbgaA et ΔbgaA: pHysA ou ΔpspA (Fig. 2I). Toutes les souches de SPN modifiées ont produit des niveaux similaires de pneumolysine toxine formant des pores (Ply) (Fig. 2, B et G), qui est une condition préalable aux lésions de l'endomembrane et à l'ubiquitination ultérieure (25). Cela annule la contribution possible de dommages membranaires faibles ou étendus favorisant un changement marqué des niveaux d'ubiquitination dans les souches mutantes SPN. Collectivement, ceux-ci suggèrent que l'ajout artificiel de la séquence degron favorise la détection et l'élimination médiées par l'ubiquitine et l'élimination des agents pathogènes. Notamment, la séquence degron dans BgaA était hautement conservée à travers différents sérotypes pneumococciques (fig. S5A).

Cependant, dans le sérotype 19F qui est souvent associé à un risque accru de décès par pneumonie bactériémique et septicémie (29-31), le degron primaire s'est avéré muté (P104Q). Nous avons observé que l'imitation de cette mutation dans BgaA (fig. S5B) conférait une mauvaise ubiquitination et une capacité de survie améliorée à ΔbgaA:pBgaA-TP104Q par rapport à ΔbgaA:pBgaA-T (fig. S5, C et D). Cela met en évidence la reconnaissance du degron en tant que stratégie utilisée par l'hôte pour se protéger contre les infections bactériennes graves.

SCFFBW7 est une ubiquitine ligase antimicrobienne E3

La séquence canonique degron présente dans les substrats d'ubiquitine sélectionnés devrait être identifiée par le complexe ubiquitine ligase SCFFBW7 E3 (24), qui est impliqué dans la régulation du cycle cellulaire et de la croissance (32). Il est composé de deux protéines conservées, la protéine 1 associée à la kinase en phase S (SKP1) et un membre de la famille des protéines Cullin, ainsi qu'une protéine à boîte F variable qui fournit une spécificité de substrat (33). Pour vérifier l'implication de SCFFBW7 dans l'ubiquitination SPN, nous avons d'abord évalué l'association de FBXW7 avec SPN. Nous avons trouvé qu'environ 31 % des SPN intracellulaires étaient associés à FBXW7 lors de l'analyse par immunofluorescence (Fig. 3A et Fig. S6A). Comme prévu, FBXW7-SPN positif également colocalisé avec l'ubiquitine K48 (fig. S6B). Pour prouver l'implication de SCFFBW7, le marquage des bactéries avec des chaînes K48-Ub a été examiné par immunofluorescence, suite à la régulation à la baisse de l'expression des gènes Cullin1, SKP1 et FBXW7 à l'aide de petits ARN interférents ciblés (siARN ; fig. S7, A à C).

En particulier, le silençage de FBXW7 a été validé par le niveau d'accumulation de cycline E1 dans les cellules traitées avec siFBXW 7- (fig. S7F). Nous avons observé une réduction d'environ 45 à 60 % de l'association SPN avec K48-Ub dans les cellules knockdown Cullin1, SKP1 et FBXW7 (Fig. 3B), ce qui, à son tour, a conduit à ~1.6- à 1. 75- fois plus de persistance du SPN dans les cellules hôtes (Fig. 3E). Le ciblage spécifique du motif degron par SCFFBW7 a été prouvé par des différences inchangées dans la colocalisation K48-Ub et la capacité de survie des souches ΔpspAΔbgaA et ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron dans les cellules traitées avec siFBXW7- (fig. S8, A à D). Ces résultats ont été étayés par des réductions notables de l'ubiquitination de K48 de BgaA-T dans les cellules hôtes après l'inactivation de FBXW7 (Fig. 3C).

De plus, in vitro, l'ubiquitination avec du BgaA-T purifié (fig. S9, A à D) et les composants du complexe SCF démontre sans ambiguïté que SCFFBW7 est la véritable ligase E3 responsable de l'ubiquitination de BgaA. Le SCFFBW7 recombinant était capable d'ubiquitiner la BgaA-T purifiée, mais n'a pas réussi à ubiquitiner la variante BgaA-TΔDegron à suppression de degron ou la variante de substitution lysine-arginine BgaA-TK97R (Fig. 3D). De plus, les cellules hôtes exprimant la variante FBXW7R505C, qui présente une capacité de reconnaissance altérée pour la cycline E1 (un substrat de FBXW7) (fig. S7E), ont montré une réduction (~ 50 %) de l'ubiquitination K48 du SPN, ainsi que ~2- fois survie plus élevée des SPN par rapport aux cellules WT (Fig. 3, F et G). Ces expériences prouvent le rôle clé de la ligase SCFFBW7 E3 dans la détection d'agents pathogènes vivant dans le cytosol et dans leur ciblage vers des voies de destruction.

La phosphorylation médiée par GSK3 -du motif degron potentialise l'activité antimicrobienne de SCFFBW7

En général, les protéines F-box reconnaissent les substrats phosphorylés pour favoriser leur ubiquitination (34). Nous avons donc étudié la probabilité et l'impact de la phosphorylation des substrats bactériens sur le revêtement K48-Ub de l'agent pathogène. L'analyse bioinformatique a révélé la présence d'un résidu de thréonine phosphorylable putatif ( 102VT * PKEE107) dans la séquence degron de BgaA. Nous avons observé que la souche SPN hébergeant une mutation BgaA-TT103A (ΔbgaA: pBgaA-TT103A) (Fig. 4A) présentait une colocalisation réduite de 71 % avec K 48- Ub par rapport à WT (Fig. 4B), révélant la pertinence de phosphorylation dans la reconnaissance du substrat par le complexe SCF.

De manière critique, la diminution de la propension à la phosphorylation de BgaA dans ΔbgaA: pBgaA-TT103A a abrogé la capacité de l'hôte à éliminer les charges bactériennes intracellulaires (~ 1,8- fois) (Fig. 4C). Parallèlement à BgaA, un variant de PspA degron (ΔpspA: pPspAT329A) a également montré une baisse de 51 % de la colocalisation de K48-Ub associée à une persistance intracellulaire prolongée (fig. S10, A à C). En général, les substrats cibles de SCFFBW7 ont une thréonine/sérine (T/S*) à côté d'un résidu proline, qui est phosphorylé par une protéine kinase dirigée par la proline, GSK3 (35–37). Nous avons donc tenté de démêler l'implication de GSK3 dans l'augmentation de la reconnaissance du substrat.

Nous avons d'abord démontré que GSK3 est étroitement affilié au SPN ubiquitiné, marqué par FBXW7 (Fig. 4, D et E). Par la suite, en effectuant un test de kinase in vitro, nous avons observé que GSK3 pouvait phosphoryler la BgaA-T recombinante. Dans le même temps, le variant BgaA-TT103A est resté non phosphorylé (Fig. 4F). Cela a validé l'identité du résidu thréonine dans la séquence degron de BgaA-T en tant que cible pour la phosphorylation médiée par GSK3 -. L'inactivation ciblée de GSK3 par l'ARNsi (fig. S7D) a entraîné une réduction d'environ 58% de l'ubiquitination K48 du SPN (Fig. 4G). Cette ubiquitination réduite, suite à la régulation à la baisse de l'expression de GSK3, a entraîné une diminution de la capacité de l'hôte à éliminer les agents pathogènes envahis par les cellules (~ 1, 5- fois) (Fig. 4H) mais n'a montré aucun effet sur ΔbgaA : pBgaA-TT103A (fig. S8, E et F). Collectivement, cela fournit la première preuve d'une kinase hôte, en particulier GSK3, régulant l'ubiquitination des protéines de surface bactériennes pour une élimination efficace des agents pathogènes (Fig. 4I).

L'ubiquitination des agents pathogènes cytosoliques confère des destins distincts pour leur élimination. En particulier, l'ubiquitination de K48 favorise le ciblage des substrats vers les protéasomes (22). De même, nos résultats suggèrent une association de SPN ubiquitiné avec la sous-unité protéasomique, 7 (fig. S11, A et C). De plus, l'inhibition du protéasome par le traitement au MG132 améliore la persistance du SPN WT mais n'altère pas la capacité de survie de ΔpspAΔbgaA. Des phénotypes similaires ont été observés dans le cas des mutants STm et ΔrlpA (fig. S11, B et D).

La surveillance des pathogènes guidée par degron protège l'hôte de la septicémie

Nous avons ensuite cherché à déterminer l'impact de la reconnaissance SPN via la machinerie d'ubiquitination cellulaire sur les résultats de l'infection. En utilisant un modèle établi de septicémie SPN (38), nous avons comparé la virulence du mutant ΔbgaA avec celle du SPN WT ainsi que des souches complémentées avec soit BgaA-T (ΔbgaA:pBgaA-T) soit une version dépourvue de la séquence degron ( ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron). Conformément aux rapports précédents (39), la souche de suppression de bgaA a montré une virulence atténuée, tandis que les souris infectées par WT, ΔbgaA: pBgaA-T ou ΔbgaA: BgaA-TΔDegron ont succombé à l'infection (Fig. 5A et fig. S12, A à D) . Cependant, le groupe de souris infectées par la souche SPN dépourvue de la séquence degron a montré une proportion plus élevée de décès mais avec une mortalité retardée par rapport au groupe infecté par ΔbgaA:pBgaA-T (P=0.0492, test du log-rank) (Fig. 5A). La comparaison des charges bactériennes dans le sang (Fig. 5B) et la rate (Fig. 5C) et l'évolution dans le temps des signes visibles de la maladie chez les souris infectées (Fig. 5D) ont confirmé la tendance à une virulence accrue dans la souche ΔbgaA: pBgaATΔDegron.

Des études antérieures ont démontré que la septicémie SPN est établie à partir d'un réservoir de bactéries dans la rate (38). Alors que la première vague de bactéries envahissantes dans la circulation est rapidement éliminée par les mécanismes immunitaires innés de l'hôte, une proportion de SPN survit et prolifère dans les macrophages spléniques, avant de se réensemencer dans le sang. Nous avons émis l'hypothèse que l'apparition retardée d'une maladie grave chez les souris infectées par ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron pourrait être le résultat d'une survie prolongée du SPN dans les macrophages spléniques, en raison d'une reconnaissance intracellulaire réduite des bactéries par la machinerie d'ubiquitination de l'hôte. À l'appui de cela, nous avons observé l'apparition retardée de la deuxième vague de bactériémie chez les souris infectées par la souche ΔbgaA:pBgaA TΔDegron par rapport à ΔbgaA:pBgaA-T (24 heures contre 12 heures), après la phase de clairance précoce (Fig. 5E).

Cependant, dans la phase d'éclipse, au cours de laquelle les bactéries sont éliminées du sang, le nombre de bactéries spléniques était systématiquement plus élevé chez les souris infectées par ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron (Fig. 5F). Ces résultats suggèrent que la phase de propagation du SPN dans les macrophages spléniques est prolongée en l'absence de reconnaissance intracellulaire de l'infection via la machinerie d'ubiquitination. En conséquence, des densités bactériennes accrues peuvent s'accumuler dans la rate (Fig. 5F), se répandant ensuite dans le sang en plus grand nombre, ce qui peut expliquer la mortalité retardée mais accrue des souris infectées par ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron. Ensemble, ces données démontrent que la reconnaissance et l'ubiquitination du SPN intracellulaire contribuent au contrôle de l'hôte des agents pathogènes pendant la septicémie.

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