Effets anti-âge de l'extrait de culture de callosités de Leontopodium Alpinum (Edelweiss) grâce au profilage du transcriptome Partie 3

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3.4. Évaluation in vitro de l'extrait de LACCE associé à l'effet hydratant

Nous avons examiné l'effet hydratant de LACCE sur les cellules HaCaT en utilisant l'expression de l'Aquaporine 3 (AQP3), qui code la protéine de transport de l'eau et du glycérol exprimée dans les cellules de la peau, par RT-PCR en temps réel (Figure 3C). Comparé au contrôle négatif, le gène AQP3 était significativement régulé positivement par l'ajout de l'extrait de LACCE.avantages et effets secondaires de la cistanche tubulosaFait intéressant, à mesure que la concentration de l'extrait LACCE augmentait, l'expression de l'AQP3 augmentait progressivement de 3,19 (0 0,1 % LACCE) à 4,5 (1 % LACCE).

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3.5.Évaluation in vitro de l'extrait de LACCE en tant qu'agent anti-rides

Nous avons testé l'effet anti-rides de LACCE à l'aide d'un gène marqueur codant pour la métalloprotéinase matricielle-2(MMP-2), qui favorise la croissance cellulaire, par RT-PCR en temps réel (Figure 3D). L'irradiation UVB a augmenté de manière significative l'expression de MMP-2par rapport au contrôle négatif sans aucune irradiation UVB (changement de facteur 0.67 avec une valeur inférieure à0.05). L'expression de MMP-2 a été régulée à la baisse par l'ajout de LACCE contre l'irradiation UVB. En général, l'expression de MMP-2 diminuait progressivement à mesure que la concentration de LACCE augmentait. L'expression de MMP-2 dans des conditions normales sans aucune irradiation UVB était comparable à celle de LACCE à 0,5 % avec irradiation UVB.

3.6.Évaluation clinique de LACCE sur le lifting du visage et l'amélioration des rides périorbitaires, l'élasticité de la peau, la densité dermique et l'épaisseur de la peau

Pour examiner l'effet de LACCE in vivo, nous avons effectué une évaluation clinique de LACCE associée au lifting du visage et à l'amélioration des rides périorbitaires, de l'élasticité de la peau, de la densité dermique et de l'épaisseur de la peau. Pour cela, 21 femmes volontaires, elles-mêmes réparties en 12 dans la quarantaine et 9 dans la cinquantaine, ont participé à l'évaluation clinique pendant quatre semaines.

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Tout d'abord, nous avons examiné l'effet de LACCE sur les rides périorbitaires à l'aide du système haute résolution PRIMOS. Deux paramètres de rugosité différents, la rugosité moyenne (Ra) (figure 4A) et la rugosité quadratique moyenne (Rq) (figure 4B), ont été analysés. Quatre semaines après le traitement avec LACCE et le placebo, les valeurs Ra et Rq ont diminué dans les deux échantillons.extrait de cistanche tubulosa,Cependant, le taux de diminution des valeurs Ra et Rq était beaucoup plus élevé dans l'échantillon traité par LACCE que dans l'échantillon traité par placebo (tableau 2). Par exemple, le taux de diminution de la valeur Ra ​​était de 3,654 % et de 6,118 % à deux et quatre semaines, respectivement, avec une signification statistique (p<0.05). similarly,="" the="" decrease="" rate="" for="" the="" rq="" value="" was="" 3.583%and="" 6.189%="" at="" two="" and="" four="" weeks,="" respectively,="" with="" statistical="" significance=""><0.05). moreover,="" the="" ratio="" of="" volunteers="" who="" displayed="" a="" reduction="" in="" the="" roughness="" parameters="" for="" the="" lacce-treated="" sample="" was="" much="" higher="" than="" that="" for="" the="" placebo-treated="" sample.="" for="" example,="" at="" four="" weeks,="" the="" ratios="" of="" volunteers="" showing="" a="" decrease="" in="" ra="" and="" rq="" values="" were="" 90.476%="" in="" the="" lacce-treated="" sample="" and="" 57.142%="" in="" the="" placebo-treated="">

Figure 4. Tests cliniques in vivo de LACCE pour le lifting du visage et l'amélioration des rides périorbitaires, l'élasticité de la peau, la densité dermique et l'épaisseur de la peau. Les valeurs Ra (A) et Rq (B) ont été mesurées par le système haute résolution PRIMOs à trois moments différents pour observer l'effet des rides périorbitaires de LACCE (1 %). L'élasticité brute (R2)(C), l'élasticité nette (R5)(D) et les valeurs d'élasticité biologique (R7)(E) ont été mesurées pour observer l'élasticité de la peau avec LACCE. Mesure de la densité dermique (F) et de l'épaisseur de la peau (G). Mesure R au coin de la bouche (H).Avant/après :probabilité p (ANOVA mesures répétées, significatif :*p<><><0.001).lacce lacebo="" b:="" probability="" p(repeated="" measures="" anova,="" significant∶="" 十="" p=""><>

Nous avons examiné l'effet de LACCE sur l'élasticité de la peau des joues à l'aide de Cutometer. Trois paramètres différents, l'élasticité brute (R2), l'élasticité nette (R5) et l'élasticité biologique (R2)(R7), ont été mesurés (figure 4C-E). Les valeurs R2, R5 et R7 pour les conditions traitées au LACCE et au placebo ont augmenté au cours des quatre semaines.avis cistanche tubulosa,Par exemple, la valeur R2 pour l'échantillon traité par LACCE est passée de 0.728 à 0.752, tandis que la valeur R2 pour l'échantillon traité par placebo est passée de 0.74{ {10}} à 0,752 (figure 4C). De plus, le taux d'augmentation dans l'échantillon traité par LACCE était beaucoup plus élevé que celui de l'échantillon traité par placebo (tableau 3). Par exemple, les taux d'augmentation dans l'échantillon traité par LACCE étaient de 3,296 (R2), 5,816 (R5) et 6,756 (R7), tandis que les taux d'augmentation dans l'échantillon traité par placebo étaient de 1,621 (R2), 2,895 (R5), et 3,378(R7) à quatre semaines. Cependant, il n'y avait pas de différence dans le ratio de volontaires présentant une augmentation de l'élasticité de la peau entre les deux échantillons.

Nous avons examiné l'effet de LACCE sur la densité dermique et l'épaisseur de la peau à l'aide de Dermascan-C. Les deux échantillons ont montré une augmentation de la densité dermique et de l'épaisseur de la peau quatre semaines après le traitement (figure 4F, G). 26,936 à 28,168 (Figure 4F). Le taux d'augmentation de la densité dermique était beaucoup plus élevé dans l'échantillon LACCE (5,466 %) que dans l'échantillon traité par placebo (3,118 %) quatre semaines après le traitement (tableau 4). Encore une fois, le taux d'augmentation de l'épaisseur de la peau était beaucoup plus élevé dans l'échantillon LACCE (10,192 %) que dans l'échantillon traité par placebo (4,829 %) quatre semaines après le traitement. Fait intéressant, de nombreux volontaires ont montré une forte augmentation de la densité dermique (90,476 %) et de l'épaisseur de la peau (100 %) après quatre semaines de traitement LACCE.

Nous avons examiné l'effet de LACCE sur le lifting facial au coin de la bouche en utilisant l'analyse Moireé. Les échantillons traités au LACCE et au placebo ont montré une réduction du lifting facial (Figure 4H); cependant, le taux de diminution du lifting facial était beaucoup plus élevé dans l'échantillon LACCE (2,541 %) que dans l'échantillon placebo (0,437 %) après quatre semaines de traitement. Le ratio de volontaires présentant une diminution du lifting facial était plus élevé avec LACCE (85,714 %) qu'avec le placebo (57,142 %).

3.7.Analyse du transcriptome des cellules HaCaT en réponse à LACCE par RNA-Seq

Bien que l'extrait de LACCE ait montré plusieurs effets positifs en tant qu'agent cosmétique, il pourrait être intéressant d'examiner le changement du transcriptome humain en réponse à LACCE. Pour cela, nous avons utilisé 1% d'extrait de LACCE au lieu d'une concentration plus faible car nous avons supposé que l'effet possible d'une faible concentration de LACCE sur les cellules kératinocytes pourrait être faible. Les cellules HaCaT ont été traitées avec 1% de LACCE (traitement), tandis que les cellules HaCaT témoins ont été traitées avec de l'eau stérile. Trois répliques biologiques ont été appliquées pour l'ARN-Seg. Le nombre de lectures de séquences variait de 32 776 672 à 42 640,000(Tableau 5). Plus de 90 % des lectures dans les six échantillons ont été cartographiées sur les transcriptions de référence humaines contenant 159 998 transcriptions (Figure 5A). Pour l'analyse de l'expression génique, nous avons calculé les fragments par kilobase de transcription par million de valeurs (FPKM). Comme le montre la figure 5B, les valeurs FPKM des trois échantillons traités étaient plus élevées que celles des trois échantillons témoins. Après suppression des transcrits redondants, seuls 11 290 transcrits sur 68 158 transcrits ont été exprimés dans des cellules de kératinocytes humains (tableau S1).

Figure 5. Cartographie des résultats, distribution des fragments par kilobase de transcrit par million de valeurs (FPKM) et visualisation des gènes exprimés de manière différentielle. (A) Une partie des lectures cartographiées (orange) et non cartographiées (gris) sur le transcriptome de référence humain. (B) Boxplot montrant la distribution des valeurs FPKM dans chaque bibliothèque. (C) Volcano plot affichant la distribution de log1o(adj) et log2 (FC) pour tous les gènes exprimés. Pad et FC indiquent la valeur p ajustée et le changement de pli, respectivement. Dix DEG identifiés sont indiqués par des points bleus (gènes régulés à la baisse, Down), rouges (gènes régulés à la hausse, Up) et gris (gènes non exprimés de manière significative, NS).

Bien que nous ayons utilisé une concentration plus élevée de LACCE (1 %) qui était 1 0 fois supérieure au LACCE normal (0,1 %) utilisé pour les cosmétiques, le transcriptome des cellules de kératinocytes humains n'a pas changé de manière significative en réponse au traitement LACCE, comme indiqué dans le diagramme du volcan (tableau S1 et figure 5C).cistancheSur la base de la valeur de p ajustée inférieure à 0 0,001 et log2 (changement de facteur) de plus de 1, nous avons identifié un total de 10 gènes exprimés de manière différentielle (DEG) sur LACCE (tableau 6). Sur les 10 DEG,

les quatre gènes régulés à la baisse étaient des gènes codant pour un inhibiteur de la liaison à l'ADN 3, le domaine de répétition d'ankyrine 1, le domaine BTB lié à Rho contenant 3 et le N5 ribosomal 18S. Les six gènes régulés étaient des gènes codant pour l'anhydrase carbonique 2, la protéine 3 de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline, la kératine 15, la protéine 3 interagissant avec le BCL2-, la protéine 1 de liaison au facteur de croissance des fibroblastes et le transCript4 inductible par des dommages à l'ADN.

3.8. Rôles fonctionnels des gènes régulés à la hausse en réponse à LACCE

L'impact de LACCE sur le transcriptome des kératinocytes était plus doux que d'autres traitements de stress. Pour obtenir un aperçu fonctionnel des gènes régulés positivement et négativement, nous avons effectué une analyse d'enrichissement GO. Cependant, nous n'avons obtenu aucun résultat significatif pour les termes GO enrichis en raison d'un petit nombre de gènes exprimés de manière différentielle. Par conséquent, nous avons augmenté le nombre de gènes exprimés de manière différentielle en appliquant une valeur de p ajustée inférieure à 0.05 et un log2 (changement de facteur) supérieur à 0,5. En conséquence, nous avons identifié 22 gènes régulés positivement et 13 gènes régulés négativement (tableau S1). L'analyse d'enrichissement GO a identifié 36 termes GO enrichis composés de 21 termes GO (processus biologique), de deux termes GO (fonction moléculaire) et de 13 termes GO (composant cellulaire) dans des gènes régulés positivement (tableau S2). En revanche, seuls 12 termes GO enrichis pour le processus biologique ont été identifiés dans 13 gènes régulés à la baisse (tableau S2).

Selon le processus biologique, les gènes impliqués dans la kératinisation, la cornification, la mort cellulaire programmée, l'organisation de la jonction cellulaire, la régulation positive du processus de développement et l'établissement d'une barrière cutanée étaient fortement régulés (Figure 6A).cistanche wirkungPour la fonction moléculaire, le constituant structurel du cytosquelette et l'activité de la molécule structurelle étaient fortement exprimés (tableau S2). Dans le cas du composant cellulaire, les gènes du filament intermédiaire, de l'exosome extracellulaire et du filament de kératine étaient fortement exprimés (figure 6B). Sur 12 termes GO pour 13 gènes régulés à la baisse, les gènes liés à la réponse à l'ion zinc, à la régulation de l'ossification et à la régulation négative du processus biologique étaient fréquemment régulés à la baisse.

Figure 6. La structure hiérarchique des termes GO enrichis identifiés pour les gènes humains régulés positivement en réponse à LACCE. Les graphiques acycliques dirigés (DAG) visualisent la structure hiérarchique des termes GO enrichis identifiés pour les gènes régulés positivement lors du traitement LACCE selon le processus biologique (A) et le composant cellulaire (B). Chaque terme GO est indiqué par une couleur de case différente en fonction de la valeur p. Des informations détaillées sur les termes GO identifiés sont disponibles dans le tableau S2.

4. Discussion

Les cosmétiques sont classiquement définis comme tout produit préparé pouvant être appliqué sur le corps humain, y compris le visage, la peau, les cheveux, la bouche et les yeux, pour modifier ou renforcer l'apparence du corps humain [21]. De plus, les cosmétiques sont utilisés pour nettoyer, parfumer et protéger. La plupart des cosmétiques sont composés de composés chimiques qui peuvent être dérivés de sources naturelles ou synthétiques [22].

Dans cette étude, nous avons examiné les effets possibles de LACCE en tant que composé naturel pour les cosmétiques à travers divers tests in vitro et in vivo. Plusieurs résultats d'essais in vitro ont montré la forte activité antioxydante de LACCE en réponse au traitement UVB. Fait intéressant, l'effet de LACCE en tant qu'antioxydant était corrélé à la concentration de LACCE. L'activité antioxydante de LACCE (1 %) était comparable à celle de la NAC ou bien supérieure à celle de la vitamine C. LACCE contient une plus grande quantité d'acide chlorogénique, d'acide 3,5-dicaffeoylquinique, d'acide léontopodique B et d'acide léontopodique A que cultures normales de cals d'edelweiss, comme le montre une étude précédente [4]. En particulier, une étude antérieure identifiant deux acides léontopodiques de l'edelweiss a démontré le rôle fonctionnel du LACCE en tant qu'agent antioxydant [23].

L'expression de deux gènes inflammatoires a été supprimée par le traitement LACCE, suggérant le rôle possible de LACCE dans l'activité anti-inflammatoire, comme indiqué précédemment [7, 24]. Fait intéressant, il n'y avait pas de différence significative dans l'effet anti-inflammatoire entre les différentes concentrations de LACCE, ce qui indique que 1 % de LACCE pourrait être suffisant pour une application en tant qu'agent anti-inflammatoire dans les cosmétiques. En revanche, les expressions d'AQP3 et de MMP2 requises pour l'hydratation et le rides, respectivement, ont été considérablement modifiées après un traitement avec différentes concentrations de LACCE.

Un test clinique est l'étape la plus importante pour utiliser l'extrait de plante comme source cosmétique. Dans cette étude, nous avons examiné les effets in vivo de LACCE avec 21 volontaires. L'application de LACCE sur le visage et les tissus cutanés a montré des augmentations significatives de quatre facteurs différents (améliorations des rides périorbitaires, élasticité de la peau, densité dermique et épaisseur de la peau) par rapport au placebo. En particulier, l'utilisation constante de LACCE a considérablement amélioré les tissus du visage et de la peau. Bien que les extraits d'edelweiss soient connus comme source de produits cosmétiques, il s'agit du premier rapport démontrant l'application réussie de LACCE en tant que matériau cosmétique.

Pour évaluer les extraits de plantes comme source cosmétique ou médicinale in vitro, l'examen de l'expression de gènes marqueurs est une approche expérimentale populaire. Cependant, l'application de gènes sélectionnés uniquement pour l'analyse de l'expression génique présente plusieurs limites. Le récent développement rapide du séquençage de nouvelle génération facilite l'analyse de l'expression génique à l'échelle du génome. Dans cette étude, nous avons utilisé RNA-Seq pour examiner les changements à l'échelle du transcriptome dans les cellules de kératinocytes humains en réponse à LACCE. Nos résultats ont montré qu'au moins 16,56 % des gènes humains étaient exprimés dans les cellules kératinocytes, indiquant l'expression tissu-spécifique des gènes humains. LACCE a induit l'expression de nombreux gènes ; cependant, le changement global du transcriptome humain par LACCE était léger par rapport à d'autres conditions de stress. Ce résultat assure la sécurité de LACCE pour une application dans les tissus humains.

l'analyse d'enrichissement a révélé que les gènes régulés à la hausse codant pour la kératine 5 (KRT5), KRT19, KRT6A, KRT15, ​​KRT14, KRT17 et la plakoglobine de jonction (JUP) étaient impliqués dans la kératinisation et la cornification. Les kératinocytes épidermiques jouent un rôle important de barrière contre divers facteurs environnementaux [25]. Plus précisément, les cellules épidermiques différenciées terminales se transforment en kératinocytes morts par mort cellulaire programmée appelée cornification, formant une barrière épidermique puissante [26]. Après la mort cellulaire, la couche cornée de la peau apporte de nombreux avantages au visage et aux tissus, notamment une augmentation de l'élasticité, de la stabilité, de l'hydratation et de la résistance mécanique [25]. Parmi les gènes KRT identifiés, le gène codant pour la kératine15 (KRT15), membre de la famille des gènes de la kératine, est connu comme un marqueur de cellules souches du follicule pileux fortement exprimé dans les tissus cutanés [27,28]. Une étude récente a suggéré que KRT15 fonctionne dans la régénération épithéliale contre les radiations et la réparation des plaies [29,30].

En plus de plusieurs gènes codant pour les protéines KRT, les gènes codant pour DDIT4, BNIP3 et IGFBP3 fonctionnent dans la mort cellulaire programmée. Par exemple, le transcript4 (DDIT4) inductible par des dommages à l'ADN est fortement exprimé par différents stress et inhibe la cible mammifère de la voie du complexe rapamycine 1 (mTORC1) associée au traitement du cancer [31]. Des études antérieures ont identifié le gène DDIT4, qui était fortement exprimé par la dexaméthasone, qui est un agent chimiothérapeutique induisant l'autophagie des lymphocytes, suggérant son rôle possible dans la régulation de la croissance, de la prolifération et de la survie des cellules [32,33]. LACCE a montré des effets similaires à ceux de la dexaméthasone en tant qu'agent anti-inflammatoire. . De plus, BNIP3 est impliqué dans la protection des kératinocytes contre l'apoptose induite par les UVB en régulant à la hausse son expression génique [35]. Plusieurs études ont montré que l'expression de la protéine 3 de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline (IGFBP-3) est liée à la sénescence cellulaire [36,37]. L'ajout d'IGFBP-3 induit ou inhibe l'apoptose selon les types cellulaires [37]. Par exemple, l'IGFBP-3 a été régulée positivement dans les cellules cervicales immortalisées par le papillomavirus humain, ce qui a entraîné l'amélioration de la mitogenèse induite par l'IGF-1- [37]. Une étude récente a montré la régulation à la baisse de l'IGFBP-3 dans les cellules âgées sénescentes et induites par H, O2- par rapport aux cellules jeunes, suggérant son rôle possible en tant que marqueur du vieillissement [36].

BNIP3, IGFBP3, stratifin (SFN), CA2, FGFBP1, KRT17 et JUP sont impliqués dans la régulation positive du processus de développement. Parmi elles, les anhydrases carboniques sont des enzymes omniprésentes présentes chez les procaryotes et les eucaryotes, y compris les animaux et les plantes [38]. Chez l'homme, l'anhydrase carbonique catalyse la formation d'acide carbonique à partir d'eau et de dioxyde de carbone (CO2), nécessaires à la physiologie du cerveau, des reins et des os [39]. Une étude précédente a démontré que CA4 et CA9 étaient régulés positivement chez une souris pendant la période hypoxique de la plaie par RNA-Seq [40]. De plus, l'ajout de l'enzyme CA9 recombinante a favorisé la réépithélialisation de la plaie [40]. De plus, une étude du protéome a également révélé l'implication de la protéine CA2 dans le vieillissement et la neurodégénérescence chez une souris [41]. Ici, nous avons démontré que LACCE favorisait la régénération des cellules de kératinocytes humains en régulant à la hausse l'expression de CA2. La protéine de liaison au facteur de croissance des fibroblastes 1 (FGFBP1) est un chaperon sécrété extracellulaire se liant aux FGF et module la signalisation du FGF J42]. Plusieurs études ont montré que le FGFBP1 est fortement exprimé au cours de l'angiogenèse et joue un rôle important dans la carcinogenèse cutanée, l'inflammation et la cicatrisation des plaies [42-44]. De plus, la localisation cellulaire des gènes régulés positivement dans la vésicule, l'exosome extracellulaire, le filament intermédiaire et le filament de kératine suggère que ces protéines sont un composant principal du cytosquelette.

Dans les gènes régulés à la baisse, la plupart des gènes sont connus pour être induits par différents stress. Par exemple, deux gènes codant pour la métallothionéine 2a (MT2A) et la métallothionéine le (MT1E) sont induits dans des conditions de stress métallique, notamment l'ion zinc, l'ion cuivre et l'ion cadmium, et un stress oxydatif, tel que les UVB [45, 46]. De plus, un inhibiteur de la liaison à l'ADN 3 (ID3), membre des protéines hélice-boucle-hélice, est un gène précoce immédiat en réponse aux signaux mitogènes et au stress oxydatif [47]. Le domaine 1 de répétition d'ankyrine (ANKRD1), également connu sous le nom de protéine de répétition d'ankyrine cardiaque (CARP), est un cofacteur transcriptionnel qui est régulé à la hausse pendant la cicatrisation des plaies et induit l'angiogenèse [48]. ID3 et ANKRD1 sont tous deux impliqués dans la régulation négative du processus biologique. ID3 agit comme un régulateur transcriptionnel inhibant la différenciation des cellules souches et favorisant la progression du cycle cellulaire [47]. De plus, une étude récente a montré que la perte de la fonction ANKRD1 chez la souris entraînait un retard de cicatrisation, suggérant son rôle dans les blessures et les lésions tissulaires [49 ]. De plus, le domaine BTB lié à Rho contenant 3 (RHOBTB3) fonctionne pour favoriser la dégradation protéasomique des facteurs inductibles par l'hypoxie (HIF), qui sont les principaux régulateurs des réponses adaptatives à une faible teneur en oxygène [50]. De plus, la protéine transmembranaire induite par l'interféron 1 (IFITM1) inhibe l'entrée de nombreux virus dans la cellule hôte [51]. De même, le gène codant pour la protéine 6 (IFI6) inductible par l'interféron alpha est induit par l'interféron et régule l'apoptose et l'immunité innée antivirale [52,53]. La régulation à la baisse des gènes sensibles au stress par le traitement LACCE suggère que LACCE ne provoque pas de stress dans les cellules kératinocytes humaines.

5. Conclusions

Ici, nous avons évalué LACCE en tant que matériau cosmétique naturel à travers plusieurs essais in vitro et in vivo, suggérant ses effets puissants sur l'amélioration des tissus du visage et de la peau. En particulier, l'analyse du transcriptome basée sur l'ARN-Seg a révélé le mécanisme moléculaire dans les cellules de kératinocytes humains en réponse à LACCE. LACCE a régulé à la hausse le gène impliqué dans la kératinisation et la cornification, fournissant une barrière cutanée, qui est favorisée par les gènes nécessaires à la mort cellulaire programmée. De nombreux régulateurs positifs du processus de développement ont été régulés à la hausse, tandis que divers gènes induits par le stress ont été régulés à la baisse par le traitement LACCE. Dans l'ensemble, notre étude a démontré que LACCE est un agent pour les cosmétiques ou cosméceutiques anti-âge.

Cet article est extrait de Gènes 2020, 11, 230 ; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes