Effets anti-allergiques et anti-inflammatoires de la néférine sur les cellules RBL -2 H3 Plus

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3. Débat

La pathogenèse de la dermatite atopique (DA) n'est pas entièrement comprise, mais la maladie est médiée par une réponse immunitaire anormale de l'immunoglobuline E (IgE) dans le dysfonctionnement de la barrière cutanée. Parmi eux, les mastocytes (MC) peuvent provoquer des maladies allergiques médiées par les IgE, y compris la maladie d'Alzheimer. Lorsque les mastocytes sont activés, ils libèrent leurs particules cytoplasmiques liées à la membrane, entraînant la libération d'une variété de molécules. Ces molécules jouent un rôle important dans la pathogenèse de la MA et la défense de l'hôte [27]. Parce que l'inhibition de l'activation ou de la dégranulation des mastocytes aide à réguler diverses réactions d'hypersensibilité médiées par les IgE, les mastocytes sont l'une des cibles idéales pour explorer les médicaments anti-allergiques. Dans notre étude, les mastocytes sont dégranulés en réponse au composé 48/80 et à l'ionophore calcique A23187, et anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Nous avons constaté que la référence inhibait efficacement l'effet de dégranulation des mastocytes, montrant sa réaction anti-allergique. De plus, l'augmentation du calcium intracellulaire et l'activation de MAPK ont été inhibées par référence. De plus, l'infiltration des mastocytes cutanés causée par le DNCB et le comportement de grattage causé par le composé 48/80 ont également été réduits. Ainsi, le mécanisme de la dermatite anti-atopique à la néférine a un effet multiplicateur sur les kératinocytes et les mastocytes.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completeo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) in the disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una diversead de moléculas. Estas moléculas juegan un papel important en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos aide une régulière varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la reference inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activación de MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, également réduit l'infiltration de mastocitos en la peau causada par DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Par conséquent, le mécanisme de la dermatite antiatópica de la neferina a un effet multiplicateur sur les queratinocitos et les mastocitos.

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Le cytoplasme des mastocytes trouvés dans les tissus est rempli de grosses particules denses de médiateurs inflammatoires préformés [28]. Le processus de libération de ces médiateurs des granules de sécrétion dans les mastocytes est appelé dégranulation. Étant donné que l'inhibition de la dégranulation des mastocytes peut réguler diverses réactions d'hypersensibilité médiées par les IgE, les mastocytes sont l'une des cibles idéales pour explorer les médicaments anti-allergiques [29,30]. Nos résultats montrent que la référence a un très bon effet sur la dégranulation des mastocytes indépendamment de l'utilisation d'antigène, de stimulateur de récepteur ou d'ionophore. Cela montre que la référence est un agent anti-allergique potentiel (Figure 2).

Tous les granules pré-stockés, les médiateurs nouvellement synthétisés, et même les granules et leurs composants peuvent être utilisés comme indicateurs d'activation de MC [31]. De plus, la méthode standard est la mesure de la concentration intracellulaire de Ca4t. La plupart des sécrétagogues MC (par exemple, antigène, composé 48/80) qui ont été généralement utilisés en laboratoire ont provoqué une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2 plus. En fait, l'augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2 plus peut également déclencher une dégranulation de MC. Habituellement, l'augmentation du Ca4t intracellulaire est induite par l'activation de MC avec des composés, tels que les pompes à thapsigargine (bloquant spécifiquement Sarco/Ca2 endoplasmique plus ATPase, SERCA) et les ionophores (c'est-à-dire l'ionomycine et l'A23187) [32,33]. Par conséquent, dans l'activation MC dépendante du Ca2t, la mesure de l'influx de Ca2t est également considérée comme une méthode pour déterminer les conditions d'activation du MC. Dans la recherche MC, Fura-2 est largement utilisé pour la détermination des changements intracellulaires de Ca2 plus. Dans nos expériences, nous avons constaté que l'intensité de fluorescence des mastocytes activés était significativement supprimée après avoir été traitée avec référence (Figure 3). Des rapports antérieurs indiquaient que l'augmentation de la concentration intracellulaire de Ca4t était en accord avec la libération d'histamine [34]. Par conséquent, nous en déduisons que la libération d'histamine sera également inhibée par le traitement de référence. D'autres expériences sont justifiées pour vérifier cette hypothèse.

Les mastocytes ont des sorties fonctionnelles significativement différentes.dose de cistanche redditCelles-ci incluent la dégranulation, la formation de précurseurs de l'acide arachidonique, la chimiotaxie et la production de cytokines, et dépendent toutes dans une certaine mesure des signaux calciques, quels que soient les stimulants [32] La MC activée libère des cytokines, qui sont les principaux médiateurs des allergies et des maladies inflammatoires [ 35]. La production de cytokines par les mastocytes activés est le résultat de l'induction de la transcription des gènes des cytokines dans ces cellules. La stimulation des mastocytes entraîne l'activation de NF-kB et AP-1 et la production de nombreuses cytokines [36]. Les voies de signalisation en cascade MAPK jouent un rôle essentiel dans la régulation de l'expression des cytokines. L'activation de ces voies par l'activation de PKC par PI entraîne l'activation de divers gènes, y compris des gènes de cytokines inflammatoires tels que IL-1, IL-6 et TNF [37]. Nos études récentes ont montré que la référence peut inhiber les cytokines libérées par l'activation des kératinocytes. Dans le même temps, nous avons également constaté que l'activation de la voie de MAPK sera également inhibée par le traitement de référence [18]. Dans notre étude actuelle, nous avons montré que la référence peut également réduire l'expression des cytokines par l'inhibition de l'activation de MAPK dans les mastocytes (Figures 4 et 5). L'activation de NFkB est également réduite en raison de l'inhibition de l'activation de MAPK (Figure 6).

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Un certain nombre d'études ont rapporté qu'une variété de cytokines chez les patients atteints de MA sont élevées, entraînant un dysfonctionnement de la barrière cutanée, y compris les cytokines sécrétées par les kératinocytes et les cytokines dérivées de Th2- [38,39]. De plus, il a été rapporté que ces cytokines sécrétées peuvent également réguler à la baisse l'expression des protéines des jonctions serrées (T]) et des gènes de différenciation terminale, notamment la filaggrine (FLG), la loricrine (LOR) et l'involucrine (IVL) [39,40 ]L'expression de la (pro)filaggrine est diminuée dans la MA et est inversement associée à la tryptase MC et à l'IL-6[41]. L'IL-1 médie l'inflammation chronique chez les souris dont la barrière cutanée est altérée [35]. Dans une étude précédente, il a été rapporté que les expressions de FLG, IVL et LOR étaient régulées à la baisse après l'application de DNCB sur la peau dorsale de souris NC/Nga [42,43]. Dans la présente étude, les expressions de FLG, IVL et LOR étaient considérablement réduites dans la peau dorsale du groupe témoin, ce qui indiquait que la barrière épidermique était altérée. L'administration de référence a significativement récupéré les expressions diminuées de FLG, IVL et LOR après le traitement du DNCB, tandis que l'administration de référence a légèrement augmenté les expressions d'IVL et LOR par rapport au groupe témoin (Figure 8). Il est connu que le composé 48/80 est un activateur efficace des mastocytes cutanés. La réponse cutanée stimulée par le composé 48/80 peut induire un comportement de grattage en libérant de l'histamine des mastocytes [44]. L'histamine libérée par les mastocytes activés joue un rôle important dans l'augmentation de la perméabilité vasculaire provoquée par le composé 48/80. Au cours du prurit humain, l'histamine libérée par les mastocytes par divers stimuli est également prise en compte. être un médiateur important. Par conséquent, l'inhibition de la dégranulation des mastocytes est une étape importante dans la régulation de la libération d'histamine lors du comportement de grattage. Dans ce composé d'étude, 48/80 ont provoqué une activation efficace des mastocytes de la peau. Cependant, le prétraitement avec référence a considérablement réduit le niveau de dégranulation des mastocytes (Figure 2).bienfaits de l'extrait de cistancheCes résultats indiquent que l'effet comportemental anti-grattage de référence peut être dû à la réduction de la perméabilité vasculaire en régulant la dégranulation des mastocytes (Figure 9).

Il est généralement établi que les patients atteints de MA souffrent d'un dysfonctionnement de la barrière cutanée, d'une inflammation cutanée ou des deux, il est donc difficile de trouver des méthodes de traitement appropriées. Par conséquent, une thérapie combinée est généralement recommandée. Nos recherches récentes ont prouvé que jamais n'a de fonction immunomodulatrice et de capacité de réparation de la barrière. Par conséquent, une caractéristique de référence importante dans le traitement de la MA à l'avenir est le maintien de la fonction cutanée et l'amélioration de l'hydratation cutanée et de la réparation de la barrière. La référence peut également réduire le comportement de grattage induit par les allergènes et les irritants. De plus, la marche atopique est une maladie liée à un phénomène qui survient et progresse étape par étape. La dermatite atopique est souvent observée dans la petite enfance. L'allergie alimentaire survient souvent après 1-2 ans. La rhinite allergique peut souvent commencer avant et après l'école. Les symptômes de l'asthme apparaissent à différents moments, mais la plupart d'entre eux surviennent après une rhinite allergique. Après l'enfance, la dermatite atopique et certaines allergies alimentaires peuvent s'améliorer ou disparaître. La rhinite allergique et l'asthme ne sont pas faciles à guérir[45,46]. Par conséquent, ce sont des phénomènes comorbides dans les maladies. Les produits naturels dont les références ont le potentiel thérapeutique de la comorbidité, et leur efficacité dans les pathologies apparentées mérite d'être étudiée dans le futur.

4. Matériels et méthodes

4.1.Cellules leucémiques basophiles de rat

Les cellules de leucémie basophile de rat (RBL-2H3) étaient un cadeau de TLHwang, Chang Gung University, Taoyuan, Taiwan. Les cellules RBL-2H3 sont des mastocytes muqueux utilisés pour étudier la dégranulation induite par un antigène ou un ionophore calcique, le Ca4t intracellulaire et la transduction du signal [29]. Les cellules ont été cultivées dans de l'EMEM contenant 10 % de FBS, avec de la pénicilline et de la streptomycine à 37 degrés, 5 % de CO2. Le milieu de Dulbecco modifié (IM) d'Iscove et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, New York, NY, USA).

4.2.Test MTT

Le dosage du 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-2bromure de H-tétrazolium (MTT) est utilisé pour mesurer l'activité métabolique des cellules. Les cellules RBL-2H3 ont été ensemencées dans une plaque de culture 24-puits à 5 × 10 plus /puits. Après 24 h de traitement médicamenteux, 30 μL de MTI par puits ont été ajoutés et placés dans un incubateur de cellules à 37 degrés pendant 2-4 h, puis des cristaux de formazan violets ont été dissous avec du DMSO. Un lecteur ELISA a été utilisé pour mesurer l'intensité de l'absorbance à une longueur d'onde de 550 nm comme test de viabilité cellulaire.

4.3.Mesure du niveau de Ca2 plus intracellulaire

[Ca2t] I a été mesuré avec fura-2 comme décrit précédemment[47].RBL-2Les cellules H3 ont été remises en suspension dans IMDM contenant 5 uM Fura 2-AM et 1,2 mM CaClz à 37 degrés pour 30 minutes. Après le chargement de Fura-2, les kératinocytes ont été granulés et remis en suspension dans du DMEM frais. Une aliquote (2 mL) a été transférée dans une cuvette agitée contenant 1,2 mM de CaClz.Fura-2-La fluorescence Ca a été dosée aux longueurs d'onde d'excitation de 340 et 380 nm (longueur d'onde d'émission, 505 nm) dans un PerkinElmer LS{{19 }} spectrofluorimètre (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Les données ont été enregistrées à des intervalles de 5 s [47].

4.4. Réaction quantitative en chaîne des polymères (qPCR)

Des cellules RBL{{0}}H3 ont été plantées dans une boîte de culture de 3,5 cm. Une fois que les cellules se sont développées à 90%, les cellules ont été cultivées dans un état statique pendant 24 h. Après que les cellules aient été prétraitées avec une référence pendant 20 min, elles ont été stimulées avec du TNF-a/IFN-y pendant 1 ou 24 h, respectivement. Les cellules ont été grattées, centrifugées (16,000×g,10 min,4 degrés) et le surnageant a été extrait. L'ARN a été purifié à l'aide d'un kit d'isolement d'ARN total (GeneDirex®, Vegas, NV, USA). Selon le mode opératoire du script cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD), les réactifs ont été ajoutés dans l'ordre et opérés selon les conditions indiquées pour convertir l'ARN en ADNc. De plus, le PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM) a été utilisé. Un total de 7,5 µL de ddH20, 2 µL d'ADNc, 0,25 µL d'amorces sens et antisens et 10 µL de SYBR GREEN ont été ajoutés et mélangés uniformément. Les séquences d'amorces sont présentées dans les tableaux 1 et 2. Ensuite, l'ARN a été quantifié à l'aide du système de PCR en temps réel ABI StepOnePlusTM.

4.5. Test Western Blot

Western blot est utilisé pour analyser les changements de diverses protéines dans les cellules. Les cellules RBL{{0}}H3 ont été ensemencées dans une boîte de culture de 3,5 cm. Une fois que les cellules se sont développées à 90% et ont été privées de nourriture pendant 24 h, elles ont été prétraitées avec une référence pendant 20 min, puis stimulées avec du TNF-a ou de l'IFN-y pendant 30 min ou 1 h, respectivement. Après grattage, ils ont été pulvérisés par ultrasons et centrifugés (13 200 rpm, 10 min, 4 degrés). Après centrifugation, le surnageant a été prélevé et la protéine a été quantifiée avec un kit de dosage de protéines Pierce (Pierce, Rockford, IL, USA). Il a été soumis à une électrophorèse sur un gel de SDS-polyacrylamide à 10 %, puis à une électroporation avec une membrane PVDF. Une fois le transfert terminé, la membrane PVDF a été placée dans une solution TBS-T (solution saline tamponnée Tris / 0, 05% de tween 20) contenant 5% de poudre de lait écrémé et agitée pendant 1 h pour éviter une liaison non spécifique. Ensuite, TBS-T a été utilisé pour laver 3 fois, 10 min à chaque fois. Ensuite, des anticorps primaires (dilution 1:1000) ont été ajoutés et placés à 4 degrés pendant la nuit et ont ensuite été lavés 3 fois avec du TBS-T toutes les 10 min. Après avoir ajouté des anticorps secondaires (dilués au 1:1000) pendant 1 h, la membrane PVDF a été lavée 3 fois avec du TBS-T pendant 10 min à chaque fois. Enfin, le révélateur a été ajouté et la membrane a été placée dans un système d'extraction chimique par luminescence (BIOSTEP Celvin") pour le tournage.

4.6. Dinitrochlorobenzène(2,4-Dinitrochloroben2ène, DNCB) Inflammation cutanée de type dermatite atopique induite chez la souris

Dans un premier temps, les souris ont été divisées en quatre groupes : groupe témoin, groupe DNCB (groupe négatif), témoin (3 mg/kg et 10 mg/kg) avec groupe DNCB, et dexaméthasone (0,2 mg/kg) avec Groupe DNCB (groupe positif). La dexaméthasone est une hormone corticostéroïde qui peut réduire l'enflure et les réactions allergiques. Dans cette expérience in vivo, la référence et la dexaméthasone ont été dissoutes dans du DMSO, tandis que le DNCB a été dissous dans de l'éthanol à 75 % par choc ultrasonore. Le premier a été administré par injection intrapéritonéale, et pour le second, 100 μL ont été appliqués sur la peau du dos et 20 μL ont été appliqués sur l'oreille droite. Trois jours avant l'expérience, les souris ont été anesthésiées et les poils du dos ont été enlevés, et un petit aimant de mesure (SCT-MAG-TF) a été intégré à l'arrière des pattes arrière de la souris.cistanche gengis khanAprès trois jours de repos, il a été confirmé que les souris étaient en bonne condition physique et que la peau de la zone d'épilation dorsale était normale, et l'expérience a commencé. Au cours de l'expérience, des photographies ont été prises pour enregistrer les changements d'apparence de la peau. La première étape ({{0}} jours) était la période de la dermatite atopique allergique. Après avoir mesuré les valeurs de base des souris du groupe DNCB, du groupe expérimental de référence (3 et 10 mg/kg) et DNCB, et du groupe expérimental dexaméthasone 0,2 mg/kg et DNCB, 1 % de DNCB a été appliqué uniformément sur la peau du dos et oreille droite. Le cinquième jour, les médicaments de référence et la dexaméthasone ont été injectés par voie intrapéritonéale. La deuxième étape (jour 5 à jour 14) était la ré-induction de la dermatite atopique.prolongation de la durée de vie du cistancheDans les 3 groupes expérimentaux,00,5 % de DNCB a été appliqué uniformément sur la peau du dos et l'oreille droite des souris. Le lendemain, les valeurs physiologiques de la peau et des photos ont été prises et enregistrées. Après que les souris ont été euthanasiées avec un excès de dioxyde de carbone (CO2) le 15ème jour, le tissu cutané dorsal a été retiré pour une analyse expérimentale ultérieure.

4.7.Composé 48/80-Comportement de grattage induit chez les souris BALB/c

Les poils de la peau du dos de la souris ont été coupés et 20 μL de solution de composé 48/80 par voie intracutanée ont été injectés. Les souris témoins ont reçu des injections salines à la place. Immédiatement après l'injection, l'animal a été placé dans une cage d'observation (diamètre 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokyo, Japon), et le comportement de grattage de la souris a été automatiquement et objectivement détecté et évalué. Le comportement de grattage a été mesuré pendant 60 min. MicroAct utilise les paramètres d'analyse suivants pour détecter les ondes correspondant au comportement de grattage continu des souris : seuil, 0,05 V ; écart d'événement, 0,05 s ; durée minimale, 0,25 s ; fréquence maximale, 30 Hz ; fréquence minimale, 5 Hz. 4.8.Analyse statistique

Le logiciel Sigma-Plot (version 10.0) a été utilisé pour l'analyse statistique.cistanche nzLes données sont exprimées en moyenne ± SEM, avec (*) et (#) comme notes. La signification statistique des données a été analysée par des tests t de Student bilatéraux non appariés. Les valeurs p inférieures à 0.05 et 0,01 ont été considérées comme significatives.

5. Conclusions

Dans cette étude, nous avons déterminé que la référence inhibe efficacement la dégranulation des mastocytes et réduit l'expression des cytokines pro-inflammatoires, qui peuvent réduire les symptômes de type dermatite atopique, restaurer la barrière cutanée et réduire le grattage cutané. Nous avons en outre prouvé que la référence peut non seulement agir sur les kératinocytes de la peau mais également affecter l'activation des mastocytes. Il a plus de potentiel d'application dans les maladies cutanées allergiques et inflammatoires.

Cet article est extrait de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms