PARTIE 1 Effets de type antidépresseur de l'extrait de Cistanche Tubulosa sur des rats souffrant d'un stress chronique imprévisible grâce à la restauration de l'homéostasie du microbiote intestinal

De plus en plus de preuves montrent que les troubles neuropsychiatriques, tels que la dépression, sont liés au microbiome intestinal par l'axe intestin-cerveau.Cistanches Herbaest bien connu pour le traitement de la déficience du "rein-yang" en médecine traditionnelle chinoise (MTC) et a été utilisé pour le traitement des maladies neurodégénératives ces dernières années. Dans cette étude, le modèle de dépression induite par le stress chronique imprévisible (CUS) a été établi pour explorer l'impact deCistanche tubulosa(CTE) sur les tests comportementaux, les neurotransmetteurs monoamines et les facteurs neurotrophiques dans l'hippocampe et le côlon, la composition du microbiote intestinal et la production d'acides gras à chaîne courte (AGCC). De plus, une analyse de corrélation a été utilisée pour évaluer la relation fonctionnelle entre le microbiote intestinal altéré, les neurotransmetteurs et les neurotrophines modifiés dans l'hippocampe et le côlon, et la concentration perturbée d'AGCC. CTE a significativement amélioré les comportements de type dépression chez les rats sous CUS. Le niveau cérébral d'5-hydroxytryptamine (5-HT) et l'expression du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) chez les rats CUS ont été restaurés par CTE. L'abondance relative du microbiote intestinal et les concentrations d'acétate et d'acide hexanoïque pourraient également être modulées par le traitement CTE. Nous avons en outre montré que l'application du CTE chez les rats CUS entraînait une forte corrélation entre la composition du microbiote intestinal perturbé, les niveaux de neurotransmetteurs de l'hippocampe et la production de SCFA métabolites neuroactifs. Dans l'ensemble, ces résultats identifient la CTE comme un traitement potentiel des symptômes dépressifs en restaurant l'homéostasie du microbiote intestinal pour les troubles de l'axe microbiote-intestin-cerveau, ouvrant de nouvelles voies dans le domaine de la neuropsychopharmacologie.

Mots clés: Cistanche tubulosa, antidépresseur, stress chronique imprévisible, microbiote intestinal, axe microbiote-intestin-cerveau

Pour plus d'information veuillez contacter:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola a de nombreux effets, cliquez ici pour en savoir plus

INTRODUCTION

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong en chinois) est officiellement enregistré comme les tiges succulentes séchées deCistanche désertique(YC Ma) etCistanche tubulosa(Schrenk) dans la Commission de la pharmacopée chinoise (2015). C'est une médecine traditionnelle chinoise (MTC) bien connue pour traiter l'insuffisance rénale, l'impuissance, l'infertilité féminine, la leucorrhée morbide, la métrorragie profuse,

Échinacosideen cistanche peut favorisercicatrisation

et constipation sénile (Commission de la pharmacopée chinoise, 2015). Des études antérieures ont révélé plusieurs principaux constituants chimiques deCistanches Herba, y compris les glycosides phényléthanoïdes (PhG), les iridoïdes et les glycosides iridoïdes, les lignanes, les alditols, les oligosaccharides et les polysaccharides. L'analyse pharmacologique a montré que Cistanches Herba présente un large éventail d'activités neuroprotectrices, immunomodulatrices, anti-inflammatoires et hépatoprotectrices (Jiang et Tu, 2009; Fu et al., 2017). Les PhG ont été considérés comme les principaux composants actifs de Cistanches Herba possédant diverses activités pharmacologiques, telles que neuroprotectrices, immunomodulatrices, anti-inflammatoires, hépatoprotectrices, anti-oxydantes, etc. (Jiang et Tu, 2009 ; Fu et al., 2017). Cistanches Herba a été enregistré à l'origine dans le Classic of Herbal Medicine ("Shennong Bencao Jing" en chinois), un livre bien connu sur les plantes médicinales écrit entre 200 et 250 après JC environ, comme une "herbe haute" qui peut réguler "cinq (viscères ) tensions et sept déficiences (hyperphagie, colère, humidité, froid, inquiétude, vent et pluie, et peur) » (Huang, 1982). De nos jours, Cistanches Herba est largement accepté comme tonique à base de plantes pour la débilité générale (Fu et al., 2017).C. tubulosales capsules de glycosides (Memoregain®) sont utilisées pour le traitement de la maladie d'Alzheimer (Guo et al., 2013). Un système dopaminergique dysfonctionnel est l'une des principales pathogenèses de l'hypothèse monoamine de la dépression (Duman et al., 1997 ; Krishnan et Nestler, 2008). Il a été démontré que l'échinacoside (l'un des PhG) et les PhG de la salsa de Cistanche protègent les neurones dopaminergiques contre la neurotoxicité de la dopamine (DA) induite par le 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,{ {8}}tétrahydropyridine (MPTP) qui peut augmenter les niveaux de DA dans le striatum des souris C57 (Tian et Pu, 2005 ; Geng et al., 2007). De plus, le catalpol et le géniposide sont deux iridoïdes représentatifs de Cistanches Herba, et il a été démontré qu'ils améliorent le comportement de type dépression induit par le stress chronique imprévisible (CUS) en restaurant les dysfonctionnements de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) et le catalpol peut réguler à la hausse le cerveau. expression du facteur neurotrophique dérivé (BDNF) (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). De plus, la dernière publication donne de nouvelles preuves que la décoction de Cistanches Herba a considérablement réduit la période d'immobilité dans le test de suspension de queue de souris, ce qui suggère fortement que Cistanches Herba possède des qualités potentielles de type antidépresseur (WangD. et al., 2017).

La médecine traditionnelle chinoise attire de plus en plus l'attention en tant que traitement de la dépression en raison de ses effets secondaires relativement modérés (Sarris et al., 2011 ; Feng et al., 2016). Divers types de MTC, tels que des composés individuels des médicaments bruts (ginsénoside Rb1, ginsénoside Rg3 et Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015 ; Kang et al., 2017 ; Wang GL et al., 2017 ), des matières médicinales chinoises uniques (racine de Panax ginseng, rhizome d'Acorus tatarinowii et Morinda Officinalis) (Dang et al., 2009 ; Han et al., 2013 ; Xu et al., 2016) et des décoctions de MTC (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan et Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010 ; Su et al., 2011 ; Su et al., 2014 ; Yan et al., 2016) ont été profondément étudiés et ont montré pour inverser ou atténuer les symptômes de type dépression. Par exemple, Kai-Xin-San s'est avéré atténuer considérablement les symptômes des rats dépressifs induits par le CUS en augmentant le nombre de neurotransmetteurs, de facteurs neurotrophiques et de leurs récepteurs correspondants, et en favorisant l'expression de la synaptotagmine et de la densité de la colonne vertébrale dendritique (Yan et al. , 2016).

Néanmoins, les études antérieures sur la MTC s'appuient sur les résultats de tests comportementaux de type dépresseur et se concentrent sur le mécanisme d'action pharmacologique conventionnel. Le lien entre l'efficacité antidépressive de la MTC administrée par voie orale et le microbiote intestinal n'est pas bien compris. De plus en plus de preuves soutiennent que le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans la régulation des fonctions cérébrales, en particulier la dépression et d'autres troubles liés au stress (Foster et Neufeld, 2013 ; Sherwin et al., 2017). Par exemple, le stress chronique entraîne une dérégulation de la structure microbienne de l'intestin du rat, avec une diminution du rapport Firmicutes/Bacteroidetes, et plus précisément, une diminution de l'abondance relative de Lactobacillus et une augmentation d'Oscillibacter (Meng et al., 2017). De plus, la transplantation fécale de microbiote dérégulé de patients déprimés à des souris sans germes a conféré un phénotype de type dépression chez ces animaux, indiquant que le microbiote intestinal dérégulé provoque des symptômes comportementaux et physiologiques de dépression et d'anxiété (Kelly et al., 2016; Zheng et al ., 2016). Dans des expérimentations animales, certains modulateurs du microbiote tels que les probiotiques et les prébiotiques se sont avérés améliorer le comportement de type dépression chez des souris souffrant de stress chronique en améliorant le microbiote intestinal (Bravo et al., 2011 ; Bharwani et al., 2017 ; Burokas et al., 2017 ).

Compte tenu de l'association entre le microbiote intestinal et le développement de la maladie, ainsi que de la plasticité de la structure du microbiote intestinal, nous avons décidé d'étudier les effets du microbiote intestinal sur la médiation de la dépression qui ont attiré notre attention et ont été étudiés (Chang et al., 2017 ; Xu et al ., 2017). Pour ce faire, le séquençage du gène de l'ARNr 16S a combiné l'analyse des métastats (White et al., 2009) pour analyser la composition du microbiote intestinal. Dans la présente étude,C. tubulosaa été sélectionné pour évaluer ses effets de type antidépresseur car il a un niveau plus élevé de PhG par rapport àC. deserticola. Un modèle de dépression induite par le CUS chez le rat a été établi pour explorer l'impact deExtrait de C. tubulosa(CTE, composé de 48,6 % de PhG, de 6,9 % de glycosides iridoïdes et de 20,0 % de saccharides totaux) sur des tests comportementaux, des neurotransmetteurs monoamines et des facteurs neurotrophiques dans l'hippocampe et le côlon, la composition du microbiote intestinal et les chaînes courtes production d'acides gras (AGCC). De plus, la relation fonctionnelle entre le microbiote intestinal modifié a modifié les neurotransmetteurs et les neurotrophines dans l'hippocampe et le côlon, et la concentration perturbée d'AGCC a été étudiée. L'analyse de corrélation a été utilisée pour étayer les preuves que le CTE cible le microbiote intestinal pour le traitement de la dépression en modulant l'axe microbiote-intestin-cerveau.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Matériaux

La fluoxétine (FLX) a été achetée auprès d'Aladdin Industrial Inc. (Shanghai, Chine). Les kits ELISA 5-hydroxytryptamine (5-HT), noradrénaline (NE) et BDNF ont été achetés auprès de l'Institut de bioingénierie de Nanjing Jiancheng (Nanjing, Chine). L'acétonitrile de qualité HPLC a été acheté chez Merck (Darmstadt, Allemagne). De l'eau désionisée a été préparée à partir d'eau distillée à l'aide d'un système de purification d'eau Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, États-Unis). Tous les autres réactifs et produits chimiques utilisés étaient de qualité analytique.

tiges séchées deC. tubulosaont été collectés dans le comté de Hetian (Xinjiang, Chine). Les échantillons de spécimens de référence ont été authentifiés par le professeur Xiaobo Li et déposés à l'herbier de l'École de pharmacie de l'Université Jiao Tong de Shanghai (Shanghai, Chine). La poudre homogèneC. tubulosales tiges ont été mises en suspension dans dix fois de l'éthanol à 70 pour cent et chauffées au reflux trois fois, chacune pendant 1 h à 100 degrés. Les extraits ont été filtrés à l'aide de gaze, évaporés sous vide à 65 degrés et lyophilisés. L'échantillon a été redissous puis séparé par la résine macroporeuse D101. Après adsorption, la fraction éluée avec de l'eau est rejetée. Le CTE a été obtenu après élution avec 40 % d'éthanol, puis évaporé sous vide à 65 degrés et lyophilisé.

Analyse de la composition chimique du CTE

La teneur relative en PhG dans le CTE a été déterminée par spectrophotométrie UV à 330 nm en utilisant l'échinacoside comme standard. La teneur relative en iridoïdes et glycosides iridoïdes a été mesurée par spectrophotométrie UV avec la méthode à double longueur d'onde pour éviter l'interférence spectrale des PhG (237 nm a été utilisé pour la quantification spectroscopique, un point isobestique à 280 nm a été utilisé pour la longueur d'onde de référence), le géniposide a été utilisé comme norme. La teneur totale en glucides du CTE a été déterminée par la méthode colorimétrique au phénol-acide sulfurique avec le glucose comme étalon (Chow et Landhausser, 2004).

Les principaux constituants chimiques du CTE ont été caractérisés par UPLC-Q-TOF-MS. L'analyse UPLC-Q-TOF-MS a été réalisée sur un système Waters ACQUITY UPLC (Waters Corp., Milford, MA, États-Unis) avec une colonne ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 mm id, 1,7 段m, Waters Corp., États-Unis) par élution en gradient à l'aide de 0.1 % d'acide formique acétonitrile (A) et de 0.1 % d'acide formique dans l'eau (B) à une débit de 0,4 ml/min. Le profil de gradient était : 0-5 min (A : 5-20 pourcent), 5-7,5 min (A : 20-30 pourcentage), 7,5-10 min ( A : 30-70 pourcent), 10-11 min (A : 70-100 pourcent), et maintenu pendant 1,5 min. Le gradient a été recyclé à 5 % en 0,5 min et maintenu pendant 2,5 min pour l'essai suivant. Le volume d'injection était de 3 [il. La température du four à colonne a été fixée à 35 degrés.

La spectrométrie de masse a été réalisée à l'aide d'un spectromètre de masse Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, États-Unis). L'ionisation a été réalisée en mode électrospray négatif (ESI). Les paramètres MS étaient les suivants : tension capillaire, 2,0 kV ; tension de cône, 20 V ; température de la source, 120 degrés ; température de désolvatation, 500 degré ; débits de gaz de cône et de désolvatation, 50 et 1,000 L/h, respectivement. Pour une mesure précise de la masse, la leucine-enképhaline a été utilisée comme masse de blocage pour générer un [MH]-ion (m/z 554,2615). Une expérience MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) dans deux fonctions de balayage a été réalisée comme suit : fonction 1 (basse énergie) : m/z 50-1,000, temps de balayage de 0,25 s, délai inter-scan de 0,02 s , énergie de collision de 6 eV ; fonction 2 (haute énergie) : m/z 50-1,000, temps de balayage de 0,25 s, délai inter-scan de 0,02 s, rampe d'énergie de collision de 20-45 eV. Les données ont été traitées à l'aide du logiciel UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, États-Unis).

cistancheboîteaméliorer la fonction rénale

Expériences sur les animaux

Des rats mâles Sprague-Dawley (200 土 20 g) ont été achetés auprès de la Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Pékin, Chine) et hébergés au Laboratory Animal Center de l'Université Jiao Tong de Shanghai (Shanghai, Chine). Les animaux ont été logés en groupes à température ambiante contrôlée (25 °C 2 degrés, 55 °C 10 % d'humidité relative) avec un cycle lumière-obscurité de 12 h 12. Les rats ont été autorisés à accéder librement à la nourriture et à l'eau des rats de laboratoire réguliers pendant 1 semaine. Les installations et les protocoles des animaux ont été approuvés par le Comité d'éthique animale de l'Université Jiao Tong de Shanghai (Shanghai, Chine).

Après 1 semaine d'acclimatation, 40 rats naïfs ont été soumis à une période d'entraînement au saccharose de 72 h et à des tests de base au saccharose. Les rats ont été divisés en cinq groupes (n=8) en fonction de leur préférence pour le saccharose dans le test de base du saccharose (Figure supplémentaire S1). Le groupe témoin et le groupe CUS ont reçu une solution saline (10 ml/kg). Pour les trois autres groupes, CTE à dose élevée (CTEH) (400 mg/kg), faible dose (CTEL) (200 mg/kg) et FLX (10 mg/kg) ont été administrés par voie intragastrique 1 h avant la procédure CUS (8h00 à 9h00) au cours de 4 semaines.

Un stress chronique imprévisible a été développé comme décrit précédemment (Willner, 1997 ; Xue et al., 2013), à l'exception du groupe témoin non stressé, une série de facteurs de stress ont été appliqués aux rats : un éclairage stroboscopique de faible intensité pendant la nuit (120 éclairs/ min), bruit blanc (100 dB) pendant 1 h, privation d'eau pendant 24 h, bouteilles d'eau vides pendant 1 h (après privation d'eau), privation de nourriture pendant 24 h, nage forcée (5 min), contention physique ({{11 }} h), cage souillée pendant 24 h (200 ml d'eau dans une litière de sciure de bois de 100 g), pincement de la queue (1 min), inclinaison de la cage à 45 degrés pendant 24 h, choc pendant 30 min et illumination nocturne (12 h). Les facteurs de stress ont été appliqués de manière continue et aléatoire pendant 4 semaines, dont les détails sont décrits dans le tableau supplémentaire S1. La nourriture et l'eau étaient librement disponibles pour les rats témoins non stressés, qui sont restés tranquilles dans une autre pièce, à l'exception de la période de privation de 14 h avant chaque test de saccharose. Un rat est mort au cours de la procédure CUS. Le test de nage forcée (FST) a été effectué après

4 jours d'administration aiguë et après 28 jours de stress, un test de préférence au saccharose (SPT) (jour 29), un test en champ ouvert (OFT) (jour 31) et un test d'alimentation avec suppression de la nouveauté (NSFT) (jour 33) ont été effectués. Les grandes lignes d'une conception pour le CUS et les tests comportementaux sont présentées dans la figure supplémentaire S2.

Un test de nage forcée a été effectué comme décrit précédemment (Porsolt et al., 1978). La procédure consistait en des séances de pré-test et de test, utilisant le même appareil et les mêmes conditions (diamètre 20 cm, hauteur 45 cm, contenant 25 cm d'eau maintenue à 26 degrés). Au cours de la session de prétest, les rats ont été forcés de nager pendant 15 min ; 24 h plus tard, les rats ont été placés dans le même appareil pour une séance de test de nage de 5 min. Le comportement de nage à l'intérieur

5 min ont été observées avec une caméra vidéo, et la durée d'immobilité a été mesurée et analysée.

Pour le SPT, les rats ont d'abord été entraînés à consommer une solution de saccharose à 1 % (v/v) pendant 72 h avant le SPT. Le test de base du saccharose avant la procédure CUS et le SPT à la fin du CUS ont été effectués comme décrit précédemment (Xue et al., 2013).

Un test en champ libre a été effectué à la fin de la procédure CUS, l'appareil et la méthode étaient les mêmes que ceux détaillés précédemment (Xue et al., 2013). Un système de suivi vidéo (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) a été utilisé pour enregistrer la distance totale parcourue.

Le test d'alimentation avec suppression de la nouveauté a été évalué comme décrit précédemment (Xue et al., 2013) et la latence pour commencer à manger dans les 5 minutes a été enregistrée et analysée.

Mesure des neurotransmetteurs et des facteurs neurotrophiques

Après des tests comportementaux, au moins quatre boulettes fécales ont été prélevées sur chaque rat, placées dans des tubes coniques stériles et immédiatement congelées à -80°C pour analyse de la communauté microbienne et des AGCC. Après cela, les rats ont été sacrifiés; l'hippocampe et le côlon ont été isolés et pesés immédiatement. Les échantillons de tissus ont été lavés avec une solution saline, congelés instantanément dans de l'azote liquide et conservés à -80°C pour stockage. Après décongélation séquentielle à -20°C et 4°C, les échantillons de tissus ont été homogénéisés dans une solution saline et centrifugés pendant 25 min à 2 500 tr/min/4°C. Le surnageant résultant a été collecté et stocké à 4°C jusqu'à utilisation. Les niveaux de 5-HT dans l'hippocampe et le côlon, de NE dans l'hippocampe et de BDNF dans l'hippocampe ont été déterminés par des kits ELISA commerciaux selon les protocoles du fabricant (Hou et al., 2017).

Analyse du profil de composition du microbiote intestinal

L'ADN total du microbiote intestinal à partir d'échantillons fécaux a été extrait comme décrit précédemment (Wei et al., 20{{20}}4). Chaque échantillon fécal (0.2 g) a été mélangé dans 1 ml de PBS et complètement homogénéisé deux fois, puis centrifugé à 200 g pendant 6 min. Le surnageant a été additionné de 20 à 20 % de PVP et centrifugé à 300 g pendant 6 min. Le surnageant résultant a ensuite été centrifugé à 12 000 g pendant 6 min et les culots cellulaires ont été récoltés. Les culots cellulaires ont été lavés avec du PBS puis remis en suspension dans 300 lysats I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA・Na2・2H2., pH 8,0). La suspension a été mélangée avec 100 µl de solution de lysozyme (100 mg/ml) et 20 µg de RNase à 1 %, 37°C dans un bain chaud pendant 30 min, puis ajouté 300 µl de lysat II (100 mM NaCl, 500 mM Tris base, pH 8,0) . La suspension cellulaire a été mélangée doucement avec 50 à 20 % de SDS, baignée de glace pendant 5 min. L'ADN a ensuite été purifié par extraction séquentielle avec du PVP à 1 %, du phénol équilibré au Tris et du chloroforme-alcool isoamylique (vol/vol/vol/vol, 3,125 :25 :24 :1) et du chloroforme-alcool isoamylique (vol/vol, 24 :1) suivie d'une précipitation à -20°C pendant 2 h avec deux volumes d'éthanol et 50 µl de NaAc 3 M. L'ADN a été recueilli par centrifugation, séché à l'air et dissous dans 100 ul d'eau déminéralisée stérile. La pureté de l'acide nucléique a été testée à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). L'ADN génomique total a ensuite été soumis à une amplification par PCR à l'aide d'amorces spécifiques aux régions V3-V4 du gène d'ARNr 16S : l'amorce sens 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') et l'amorce inverse 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). Les amplicons PCR ont été purifiés avec des billes Agencourt AMPure (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, États-Unis) et quantifiés à l'aide du kit de dosage PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis). Après l'étape de quantification individuelle, les amplicons ont été regroupés en quantités égales et un séquençage de 2 x 300 pb a été effectué à l'aide de la plate-forme Illumina MiSeq avec le kit de réactif MiSeq v3 à Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, Chine). Les lectures appariées ont été assemblées à l'aide du logiciel FLASH (version 1.2.7), les lectures de séquences brutes ont été rognées de qualité à l'aide du logiciel QIIME (version 1.8.0) pour supprimer les codes-barres incompatibles et les séquences inférieures aux seuils de longueur. Ensuite, les séquences filtrées ont été regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) avec un seuil de similarité de séquence de 97 % en utilisant QIIME avec UCLUST. La diversité bêta a été réalisée sur QIIME pour l'analyse pondérée des coordonnées principales UniFrac (PCoA). Enfin, le logiciel Meta stats a été utilisé pour comparer les différences de composition taxonomique microbienne intestinale entre différents groupes.

Analyse de la concentration des AGCC

La concentration d'AGCC (y compris l'acétate, le propionate, le butyrate, l'isobutyrate, l'acide valérique, l'acide isovalérique et l'acide hexanoïque) dans les échantillons fécaux de rat a été déterminée par chromatographe en phase gazeuse GC{{0}} (Shimadzu, Japon), équipé avec une colonne DB-FFAP (30 mx 0.25 mm x {{10}}.25 cm, Agilent, États-Unis). Des solutions étalons d'acétate, de propionate, de butyrate, d'isobutyrate, d'acide valérique, d'acide isovalérique et d'acide hexanoïque ont été préparées à1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0.01 et 0,005 mg/ml avec de l'éther (dont 2- acide méthylvalérique 0,1 mg/ml comme étalon interne), respectivement. Chaque échantillon fécal (0,2 g) a été mélangé dans 0,8 ml d'eau déminéralisée par vortex et centrifugation à 5,000 tr/min pendant 20 min à 4°C, 450 il de surnageant ont été ajoutés par 50 il de H2SO4 à 50 % et 500 il d'étalon interne solution, vortexer pendant 1 min et centrifugé à 12,000 rpm pendant 10 min, puis le mélange a été placé dans 4OC pendant 30 min. Le surnageant a été prélevé pour analyse GC. L'analyse des AGCC a été effectuée comme décrit précédemment (Wang et al., 2016).

Analyses statistiques

Toutes les données ont été présentées sous forme de moyennes 土 SEM. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, États-Unis) avec une ANOVA à un facteur suivie du test de Dunnett ou du test t de Student. Les données ont été exclues des analyses si elles étaient supérieures à deux écarts-types par rapport à la moyenne. Les valeurs de p <0.05 ont="" été="" considérées="" comme="" statistiquement="" significatives.="" l'analyse="" de="" corrélation="" de="" pearson="" a="" été="" utilisée="" pour="" évaluer="" l'association="" entre="" l'abondance="" relative="" du="" microbiote="" intestinal,="" les="" scfa,="" les="" niveaux="" d'hippocampe="" 5-ht,="" ne="" et="" bdnf="" et="" le="" côlon="">

RÉSULTATS

Analyse de la composition chimique du CTE

La composition chimique du CTE a d'abord été analysée en profondeur. Comme le montre le tableau 1, les PhG étaient le principal composant du CTE, avec une teneur relative de 48,6 %, les iridoïdes et les glycosides iridoïdes étaient de 6,9 % et les saccharides totaux étaient de 20,0 %. Ces

les composants de CTE ont ensuite été caractérisés à l'aide de UPLC-Q-TOF-MS. Au total, 27 constituants ont été détectés et identifiés, dont 20 constituants de PhG, cinq iridoïdes et glycosides iridoïdes et deux oligosaccharides. Des informations détaillées, y compris le temps de rétention, la précision de la MS et les ions fragmentés MS/MS, sont répertoriées dans les informations complémentaires (tableau supplémentaire S2). Le chromatogramme d'ions totaux (TIC) UPLC-Q-TOF-MS de CTE est illustré à la figure supplémentaire S3.

Le CTE a amélioré les comportements dépressifs chez les rats CUS

Chez les rats CUS, le temps d'immobilité total dans le FST et la latence pour manger dans le NSFT ont été significativement diminués par le traitement CTE, et la préférence pour le saccharose dans le SPT et la distance totale parcourue dans l'OFT ont été augmentées.

La figure 1A illustre les effets aigus du CTE sur le temps d'immobilité dans le FST chez les rats CUS. Par rapport au groupe modèle CUS, l'administration orale aiguë de 3- jours de CTE a réduit de manière significative le temps d'immobilité total dans le FST [ANOVA unidirectionnelle, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Une analyse posthoc plus poussée a révélé que l'administration

TABLEAU 1|composition chimique deC. tubulosaL'extrait de CTE avec le groupe à forte dose (test de Dunnett, p <{{0}}.05) et le groupe à faible dose (test de Dunnett, p <0,05) a montré une réduction marquée du temps d'immobilité total dans le FST .

Les effets du CTE sur la préférence du saccharose dans le SPT chez les rats CUS sont illustrés à la figure 1B. La procédure de stress de vingt-huit jours a entraîné une diminution significative de la préférence pour le saccharose dans le groupe modèle CUS par rapport aux rats témoins non stressés [ANOVA unidirectionnelle, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09 ; test de Dunnett, p < 0,05],="" indiquant="" que="" le="" modèle="" cus="" a="" été="" développé="" avec="" succès.="" en="" tant="" que="" témoin="" positif,="" le="" groupe="" flx="" a="" augmenté="" de="" manière="" significative="" la="" préférence="" pour="" le="" saccharose="" chez="" les="" rats="" cus="" [anova="" unidirectionnelle,="" f(4,34)="3.993," p="0.009 ;" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05],="" démontrant="" la="" validité="" prédictive="" du="" modèle="" cus.="" l'administration="" orale="" chronique="" de="" cte="" dans="" le="" groupe="" à="" forte="" dose="" a="" montré="" des="" effets="" clés="" sur="" la="" préférence="" pour="" le="" saccharose="" [anova="" unidirectionnelle,="" f(4,34)="3.993,p=0.009 ;" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,01],="" ce="" qui="" l'a="" ramené="" à="" des="" niveaux="" normaux="" chez="" les="" rats="" cus.="" le="" cte="" avec="" le="" groupe="" à="" faible="" dose="" a="" montré="" une="" tendance="" à="" la="" hausse="" mais="" l'effet="" n'était="" pas="" statistiquement="" significatif="" (test="" de="" dunnett,="" p="">

Comme le montre la figure 1C, la distance totale parcourue dans l'OFT a également été utilisée pour évaluer les effets du CTE sur les rats CUS. Comparé aux rats non stressés, le groupe de modèles CUS a manifesté une distance totale beaucoup plus courte [ANOVA unidirectionnelle, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01 ; Le test de Dunnett, p < 0.001]="" après="" une="" 4-="" semaine="" d'exposition="" au="" cus,="" et="" le="" traitement="" flx="" témoin="" positif="" ont="" augmenté="" la="" distance="" totale="" chez="" les="" rats="" cus="" [anova="" unidirectionnelle,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001 ;" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05].="" l'administration="" orale="" quotidienne="" de="" cte="" à="" forte="" dose="" et="" à="" faible="" dose="" a="" montré="" un="" effet="" évident="" sur="" la="" distance="" totale="" chez="" les="" rats="" cus="" [anova="" unidirectionnelle,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,01="" pour="" le="" groupe="" à="" dose="" élevée,="" p="">< 0,001="" pour="" le="" groupe="" à="" faible="" dose,="" respectivement].="" la="" figure="" supplémentaire="" s4="" montre="" la="" carte="" des="" pistes="" d'activité="" dans="">

La figure 1D montre les effets du CTE sur la latence à manger dans le NSFT chez les rats CUS. La procédure de stress de vingt-huit jours a entraîné une augmentation significative de la latence pour commencer à manger dans le groupe modèle CUS par rapport aux rats témoins non stressés [ANOVA unidirectionnelle, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19 ; test de Dunnett, p < 0,05],="" indiquant="" que="" le="" modèle="" cus="" a="" été="" développé="" avec="" succès.="" l'administration="" orale="" à="" long="" terme="" de="" cte="" avec="" une="" dose="" élevée="" a="" montré="" des="" effets="" évidents="" sur="" la="" latence="" pour="" commencer="" à="" manger="" par="" rapport="" au="" groupe="" cus="" (test="" t="" de="" student,="" t="2.759," p=""><0,05), tandis="" qu'une="" faible="" dose="" de="" cte="" a="" montré="" aucun="">

Le CTE a restauré le niveau de neurotransmetteurs et de facteurs neurotrophiques chez les rats CUS

Les effets du CTE sur les niveaux de {{{{10}}}} HT et NE dans l'hippocampe des rats CUS sont illustrés aux figures 2A,B. La procédure de stress de quatre semaines a entraîné une réduction significative de 5-HT [ANOVA unidirectionnelle, F(4,34)=17.13, p=0.0{{39 }}01 ; Test de Dunnett, p < 0.001]="" et="" ne="" [anova="" unidirectionnelle,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006 ;" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,001]="" concentration="" dans="" l'hippocampe="" des="" rats="" cus="" par="" rapport="" à="" celle="" du="" groupe="" témoin,="" et="" l'antidépresseur="" flx="" a="" significativement="" restauré="" les="" niveaux="" de="" 5-ht="" dans="" l'hippocampe="" [anova="" unidirectionnelle,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001 ;" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,001].="" après="" administration="" orale="" de="" cte="" dans="" le="" groupe="" à="" forte="" dose,="" une="" augmentation="" significative="" du="" niveau="" de="" 5-ht="" a="" été="" observée="" [anova="" unidirectionnelle,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001" ;="" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,001]="" alors="" que="" les="" concentrations="" de="" ne="" n'étaient="" pas="" modifiées.="" de="" même,="" l'expression="" du="" bdnf="" a="" été="" significativement="" réduite="" dans="" le="" groupe="" modèle="" cus="" par="" rapport="" aux="" rats="" non="" stressés="" (test="" t="" de="" student,="" t="4.171," p="">< 0,01)="" (figure="" 2c).="" administration="" orale="" à="" long="" terme="" de="" cte="" à="" forte="" dose="" (test="" t="" de="" student,="" t="2.548," p="">< 0,05)="" et="" flx="" (test="" t="" de="" student,="" t="2.263," p="">< 0,05="" )="" augmentation="" de="" l'expression="" du="" bdnf="" par="" rapport="" au="" groupe="" modèle="" cus.="" le="" cte="" à="" faible="" dose="" n'a="" montré="" aucun="" effet="" significatif="" sur="" l'expression="" du="">

Le niveau de {{0}} HT dans le côlon des rats CUS était différent de celui de l'hippocampe, et la procédure de stress de 4- semaine n'a eu aucun impact sur le côlon 5- HT (Figure 2D ). À l'inverse, l'administration orale de CTE à forte dose a stimulé les niveaux de 5-HT dans le côlon par rapport au groupe modèle CUS (test t de Student, t=2.173, p < 0,05).="" le="" cte="" à="" faible="" dose="" n'a="" montré="" aucun="" effet="" sur="" le="" niveau="" d'ht="" du="" côlon="">

Le CTE a réglementé la composition microbienne intestinale des rats CUS

L'effet du CTE sur la composition microbienne intestinale des rats CUS a été évalué par la méthode basée sur le séquençage du gène de l'ARNr 16S. Il a été constaté que 28 jours d'administration orale de CTE altéraient la composition microbienne intestinale des rats CUS et affectaient divers

niveaux taxonomiques microbiens parmi les groupes de rats (niveau de classe 1, niveau d'ordre 1, niveau de famille 1, niveau de genre 8 et niveau d'espèce 2). Cela suggère que la communauté microbienne intestinale pourrait jouer un rôle dans les effets antidépresseurs du CTE. Des informations détaillées sur les taxons microbiens intestinaux significativement modifiés à différents niveaux taxonomiques sont présentées dans le tableau 2.

Le séquençage MiSeq a donné un total de 2 132 980 lectures brutes, après le processus de contrôle de la qualité, de débruitage et d'élimination des chimères. Ensuite, les lectures ont été regroupées en OTU, qui ont été attribuées aux taxons du phylum au niveau de l'espèce. L'étude de l'analyse de la diversité bêta a été réalisée pour explorer la similitude des modèles de communauté bactérienne parmi les cinq groupes de rats. La PCoA basée sur les distances UniFrac pondérées du microbiote intestinal des cinq groupes de rats d'étude est illustrée à la figure 3A. L'analyse de la diversité bêta par PCoA a montré une nette séparation de la communauté microbienne du groupe témoin et du groupe modèle CUS, tandis que le groupe CTE à dose élevée avait tendance à être plus proche du groupe témoin par rapport au groupe CUS.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 pour cent. Comme le montrent les figures supplémentaires S5A, B, la procédure de stress de 4 semaines a entraîné une tendance non significative vers une augmentation du niveau de Firmicutes et une diminution non significative des Bacteroidetes dans le groupe modèle CUS par rapport au groupe témoin. Après administration quotidienne de CTE à forte dose et à faible dose, l'abondance relative des Firmicutes et des Bacteroidetes est revenue à des niveaux similaires au groupe témoin, mais sans signification statistique. Et bien que des changements similaires aient été observés pour le rapport Firmicutes/Bacteroidetes parmi les groupes de rats, aucune différence statistique n'a été montrée (Figure supplémentaire S5C). Une tendance non significative vers une diminution du niveau de phyla cyanobactéries a été trouvée dans le groupe modèle CUS par rapport aux rats témoins non stressés ; tandis que l'administration de CTE à forte dose a entraîné une augmentation significative de l'abondance relative des cyanobactéries par rapport au groupe CUS (Figure supplémentaire S5D).

Au niveau du genre, Bacteroides et Ruminococcus étaient deux des taxons microbiens les plus abondants qui représentaient environ 30 pour cent d'abondance relative dans les cinq groupes de rats. La procédure de stress de quatre semaines a entraîné une réduction significative de l'abondance relative de Bacteroides et une augmentation significative de Ruminococcus dans le groupe modèle CUS par rapport aux rats témoins non stressés (figures 4A, B). L'administration à long terme de CTE a entraîné une augmentation significative de l'abondance de Bacteroides ainsi qu'une diminution significative de Ruminococcus par rapport aux rats CUS. De plus, six genres de Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus et Brachybacterium ont montré des différences statistiquement significatives entre le groupe modèle CUS et le groupe témoin (figures 4C-H). Après 28 jours de traitement de CTE, l'abondance relative des six genres susmentionnés a été respectivement changée à des niveaux similaires au groupe témoin.

Une faible abondance de Deinococcus à différents niveaux taxonomiques, y compris au niveau de la classe (Déinocoques), au niveau de l'ordre (Deinococcales), au niveau de la famille (Deinococcaceae) et au niveau du genre (Deinococcus) a été détectée dans le groupe de rats CUS, alors qu'elle n'a pas été détectée dans le contrôle groupe et les groupes d'administration (figures 5A-D).

Au niveau de l'espèce, Weissella beninensis était beaucoup plus faible dans le groupe CUS que dans le groupe témoin, et une augmentation significative de l'abondance relative a été observée après l'administration de CTE à forte dose (figure 5E). Inversement, l'administration de CTE a inversé l'augmentation significative de l'abondance relative du conglomérat de Brachybacterium observée chez les rats CUS (figure 5F).

AGCC modulés CTE chez les rats CUS

Les concentrations d'AGCC (y compris l'acétate, le propionate, le butyrate, l'isobutyrate, l'acide valérique, l'acide isovalérique et l'acide hexanoïque) dans les échantillons fécaux de rat ont été analysées par GC et sont présentées à la figure 6. Les niveaux d'acétate [ANOVA unidirectionnelle, F( 4,32)=2.721, p=0.0467 ; Test de Dunnett, p < 0.05]="" et="" acide="" hexanoïque="" [anova="" unidirectionnelle,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328 ;="" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05]="" ont="" été="" significativement="" augmentés="" chez="" les="" rats="" du="" groupe="" modèle="" cus="" par="" rapport="" au="" groupe="" témoin.="" après="" administration="" à="" long="" terme="" de="" cte="" à="" forte="" dose,="" acétate="" (test="" t="" de="" student,="" t="2.182," p="">< 0,05)="" et="" acide="" hexanoïque="" [anova="" unidirectionnelle,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328 ;" test="" de="" dunnett,="" p="">< 0,05]="" les="" concentrations="" étaient="" principalement="" diminuées="" par="" rapport="" au="" groupe="" cus,="" indiquant="" que="" le="" cte="" pourrait="" exercer="" son="" activité="" antidépressive="" en="" modulant="" les="" scfa="" du="" métabolite="" neuroactif="" désordonné.="" l'administration="" de="" cte="" avec="" un="" groupe="" à="" faible="" dose="" a="" montré="" une="" tendance="" à="" la="" baisse="" mais="" aucun="" effet="" remarquable="" sur="" les="" concentrations="" d'acétate="" et="" d'acide="">

Analyse de corrélation du microbiote intestinal, des neurotransmetteurs et des neurotrophines dans l'hippocampe, 5-HT dans le côlon et les AGCC

Pour explorer la relation fonctionnelle entre le microbiote intestinal altéré au niveau du genre, les neurotransmetteurs et les neurotrophines modifiés dans l'hippocampe et le côlon, et la concentration inquiétante d'AGCC, les coefficients de corrélation de Pearson ont été développés (Meng et al., 2017). Les corrélations entre eux (r > 0.4 ou r < -0.4,="" p="">< 0,05)="" sont="" illustrées="" à="" la="" figure="" 7.="" les="" coefficients="" indiquent="" de="" fortes="" corrélations="" entre="" la="" composition="" altérée="" du="" microbiote="" intestinal="" au="" niveau="" du="" genre,="" la="" concentration="" de="" sept="" types="" d'agcc="" et="" des="" neurotransmetteurs="" monoamine="" liés="" à="" la="" dépression="" (5-ht="" et="" ne).="" l'abondance="" de="" ruminococcus="" a="" montré="" une="" corrélation="" négative="" significative="" avec="" une="" concentration="" de="" 5-ht="" dans="" l'hippocampe,="" ce="" qui="" signifie="" que="" la="" procédure="" cus="" entraîne="" une="" augmentation="" de="" l'abondance="" relative="" de="" ruminococcus="" et="" une="" diminution="" des="" concentrations="" de="" 5-ht.="" après="" traitement="" avec="" cte,="" l'abondance="" relative="" de="" ruminococcus="" a="" été="" réduite="" au="" niveau="" du="" groupe="" témoin,="" et="" les="" niveaux="" de="" 5-ht="" se="" sont="" améliorés.="" de="" plus,="" l'abondance="" relative="" de="" bacteroides="" était="" positivement="" corrélée="" avec="" un="" niveau="" de="" 5-ht="" dans="">

hippocampe, et négativement associée à la concentration de butyrate, d'isobutyrate, d'acide valérique, d'acide isovalérique et d'acide hexanoïque ; l'abondance de Parabacteroides a montré une corrélation positive significative avec un niveau de 5-HT dans l'hippocampe et la concentration de propionate, alors qu'elle a montré une corrélation négative avec les concentrations d'isobutyrate et d'acide isovalérique ; une association significativement positive entre l'abondance relative de Butyricimonas et le niveau de NE dans l'hippocampe a également été observée, et l'abondance relative de Deinococcus était positivement corrélée à la concentration d'acétate. Cela a démontré que le CTE pourrait exercer son activité antidépressive en modifiant la composition du microbiote intestinal, en perturbant les niveaux de neurotransmetteurs de l'hippocampe et en restaurant les SCFA des métabolites neuroactifs. Les données détaillées de l'analyse de corrélation sont présentées dans le tableau supplémentaire S3.

cistanchepeut traiterDiabète

DISCUSSION

Identification de l'activité anti-dépression du CTE et de ses avantages cliniques

Cette étude a évalué l'activité antidépressive du CTE chez des rats CUS, confirmé l'efficacité de modèles in vivo tels que FST, SPT, OFT et NSFT, et confirmé l'activité antidépressive deC. tubulosachez les rats CUS qui est fréquemment utilisé pour le traitement de l'insuffisance rénale, de l'impuissance et de l'infertilité féminine dans la MTC. Actuellement, les antidépresseurs les plus couramment prescrits sont la venlafaxine, un inhibiteur de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline (IRSN), suivi de l'inhibiteur sélectif de la recapture de la sérotonine (ISRS) FLX (Thase et al., 2001 ; Mcintyre, 2017). Cependant, il a été démontré que ces antidépresseurs possèdent des effets secondaires graves, notamment une toxicité cardiaque, une pression artérielle, un dysfonctionnement sexuel et des troubles du sommeil (Ferguson, 2001 ; Jin et al., 2015). Parmi toutes les classes d'antidépresseurs, les ISRS et les IRSN sont corrélés à l'incidence la plus élevée de dysfonction sexuelle (Montejogonzalez et al., 1997 ; Clayton et al., 2014). Il convient de noter en particulier l'incidence globale de la dysfonction sexuelle, qui est de 59,1 % (604/1 022) lorsque tous les antidépresseurs sont considérés dans leur ensemble ; et environ 40 % des patients présentent une faible tolérance aux dysfonctionnements sexuels, ce qui affecte gravement l'observance des médicaments (Clayton, 2001). Compte tenu des inconvénients du traitement actuel de la dépression, Cistanches Herba présente un grand potentiel d'application clinique, non seulement en raison de sa puissante activité antidépressive, mais aussi parce queCistanches Herbaa été traditionnellement utilisé pour traiter l'impuissance, ce qui devrait au moins éliminer une préoccupation des effets secondaires les plus courants causés par d'autres antidépresseurs (Fu et al., 2017). De plus, Cistanches Herba ne montre aucun signe de toxicité et de changements liés au traitement