Le nanoruban d'oxyde de graphène antioxydant en tant que nouvel agent de blanchiment inhibe le mécanisme de mélanogenèse associé au facteur de transcription associé à la microphtalmie

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ABSTRAIT:Dans lemélanineprocessus de synthèse, les réactions oxydatives jouent un rôle essentiel, et c'est une bonne stratégie pour inhiber la production de mélanine en réduisant le stress oxydatif. Le fullerène et ses dérivés, ou les complexes, étaient considérés comme de puissants piégeurs de radicaux libres, et nous avons ensuite appliqué le sp2nanocarbone multicouche pour découvrirmélaninemécanismes inhibiteurs de la synthèse. Dans la présente étude, nous avons utilisé de nouveaux nanomatériaux, tels que les nanotubes de carbone à parois multiples (MWCNT), les MWCNT de type court, les nanorubans d'oxyde de graphène (GONR) et les GONR de type court, comme agents anti-oxydants pour régulermélanineproduction. Les résultats ont montré que les GONR avaient de meilleures capacités anti-oxydantes dans les plateformes d'analyse du stress oxydatif intracellulaire et extracellulaire que les autres. Nous avons proposé que les GONR aient des groupes fonctionnels contenant de l'oxygène. Dans le test de diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine, nous avons découvert que le GONR pouvait chélater les ions métalliques pour piéger les espèces réactives de l'oxygène. Du point de vue de la perspicacité moléculaire, nous avons observé que ces nanomatériaux régulaient à la baisse la synthèse de mélanine en diminuant l'expression des gènes liés au facteur de transcription associé à la microphtalmie, et il y avait des conséquences similaires dans l'expression des protéines. Pour résumer, GONRs est un agent potentiel en tant que romanantioxydantet matériel de cosmétologie blanchissant la peau.

cistancheinhiber la formation de mélanine

1. INTRODUCTION

La peau est l'organe qui recouvre la surface externe du corps humain. L'interface étant en contact avec l'environnement, la couche cutanée joue un rôle important dans la protection de l'organisme contre les agents pathogènes, en évitant les pertes excessives d'eau, en régulant la température corporelle, etc. Les mélanocytes se développent dans la membrane basale de l'épiderme cutané et représentent 5 à 10 % du contenu cellulaire. Ils ont été caractérisés comme des "glandes" unicellulaires ayant des dendrites minces, longues, en forme de banderoles et ramifiées. Les mélanocytes se déplacent à travers les cellules épidermiques de leur voisinage immédiat, créant une constellation de cellules épidermiques autour de chaque mélanocyte. Il existe de nombreuses causes internes et externes du vieillissement cutané, et l'un de ces facteurs est le rayonnement ultraviolet (UV) du soleil.1 Pendant l'exposition aux UV, les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans la peau augmentent considérablement, ce qui est connu sous le nom de stress oxydatif.Plusieurs facteurs de toxicité environnementale améliorent également le stress oxydatif sur la peau, tels que les pesticides, le tétrachlorure de carbone, les métaux lourds, les amines aromatiques et les particules 2,5 (PM2,5).2 Dans le mécanisme biochimique, les oxydants intracellulaires sont générés à partir du système non enzymatique, les transformant en ROS pour déclencher la voie de la mélanogénèse.

En plus des ROS, de nombreux facteurs affectent la production de mélanine, notamment l'expression des gènes, l'inflammation, les changements endocriniens et l'absorption des pigments.1 Dans les premières étapes de la production de mélanine, la tyrosinase joue un rôle dans la catalyse de la tyrosine en phéomélanine et en eumélanine. Les mécanismes de fabrication des deux pigments sont similaires, notamment l'hydroxylation de la L-tyrosine en 3,4-dihydroxy-L-phénylalanine (L-DOPA) et l'oxydation de la L-DOPA en dopaquinone. Dans l'étape suivante, la dopamine est oxydée par la protéine 1 liée à la tyrosinase (TRP-1) et la protéine 2 liée à la tyrosinase (TRP-2) dans le mélanosome, qui est régulée par le facteur de transcription associé à la microphtalmie (MITF) formermélanine.Enfin, la mélanine est mûrie et précipitée au sein du stratumcorneum.4,5 Celles-ci pénètrent dans les kératinocytes voisins de la couche basale et protègent leur ADN des éventuelles mutations ou modifications induites par les UV. Le mûrimélaninedans les mélanosomes est transféré aux kératinocytes6−9 et conduit finalement à une pigmentation durable. Les lentigines, les taches de rousseur et les taches brunes/noires causent parfois des problèmes sociaux chez les hommes et les femmes. Le blocage du stress oxydatif ou la suppression de l'activité de la tyrosinase est une stratégie pour réguler à la baisse le syndrome d'hyperpigmentation et les troubles dermatologiques.Antioxydantsguérir les hyper-pigmentations et les dommages cellulaires causés par les ROS.10,11 Par conséquent, les composés antioxydants synthétisés ont de nombreuses applications biofonctionnelles dans les applications de soins de la peau.

Le fullerène (C60), le nanotube de carbone (CNT), le graphène et le nanoruban de graphène (GNR) sont quatre types de nanocarbone sp2 largement étudiés dans le monde.12 Le fullerène et ses dérivés ou complexes ont longtemps été considérés comme de puissants piégeurs de radicaux libres. Yodoh et al. ont utilisé du C60 soluble dans l'eau comme agent protecteur contre la dégénérescence induite par le stress catabolique. Injac et al. a conclu que C60(OH)24 est un fortantioxydantcomposé lorsque le stress oxydatif est trop élevé. Okuda et al. ont suggéré que les complexes C60 peuvent prévenir les lésions cellulaires médiées par le NO.13,14 Tong et al. ont montré que les complexes C60 pourraient être des candidats prometteurs pour le traitement des maladies cérébrales causées par des niveaux accrus de superoxyde. En fait, une société japonaise a identifié des fullerènes avec une forte activité antioxydante à usage cosmétique en 2006. Lucente Schultz et al. ont démontré que la capacité de piégeage des radicaux oxygène des NTC monoparois fonctionnalisés (SWCNT) est près de 40 fois supérieure à celle des C60 dendritiques.15−19Fenoglio et al. ont observé que les NTC à parois multiples (MWCNT) possédaient une remarquable capacité de piégeage des radicaux au contact d'une source externe de radicaux hydroxyle ou superoxyde. En 2004, Novoselov et al. ont d'abord démontré que le graphène présentait un fort effet ambipolaire électrique et pouvait être prometteur pour des applications électroniques.21 Par la suite, ils ont continué à montrer que le graphène possède des propriétés électroniques qui sont distinctives pour un gaz 2D de particules décrit par l'équation de Dirac. 22,23 Depuis ces deux articles révolutionnaires, de plus en plus d'attention a été accordée à la recherche basée sur le graphène.24−30 Par exemple, Qiu et al. en 2014 a montré que l'oxyde de graphène et le graphène à quelques couches présentent desantioxydantactivité et peut protéger diverses molécules biomoléculaires de l'oxydation.31Han et al. a démontré expérimentalement en 2007 que l'écart énergétique des GNR peut être contrôlé pendant le processus de lithographie en modifiant la largeur du ruban.32 Parmi les quatre nanocarbones, les GNR ont reçu le moins d'attention. À notre connaissance, il existe peu de recherches sur les propriétés antioxydantes des nanorubans d'oxyde de graphène (GONR).31,33 Par conséquent, dans cette étude, nous avons soigneusement préparé des MWCNT, des MWCNT courts, des GONR et des GONR courts et avons cherché à comparer systématiquement leurs propriétés antioxydantes et les résultats associés. .

2. RÉSULTATS ET DISCUSSION

2.1. Morphologie des MWCNT et des GONR.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm à 2−3 μm. Simultanément, on a observé que le traitement à l'acide nitrique rend rugueuses les surfaces lisses des tubes. Certaines encoches et formes irrégulières sont affichées dans l'image à fort grossissement. En outre, l'utilisation de MWCNT et de courts MWCNT par des réactions micro-ondes permet d'obtenir respectivement GONR et shortGONR. Nous avons également illustré les images TEM à faible et fort grossissement de GONR et de GONR court. En raison du décompression longitudinal majeur et de la coupe horizontale mineure, il semble que les GONR étaient plus courts que les MWCNT. D'autre part, les images à fort grossissement montraient des diamètres plus grands, c'est-à-dire 0.11−0.18 μm, des GONR que ceux des MWCNT, indiquant que le processus de décompression a réussi. De même, les GONR courts présentaient une longueur plus courte et un diamètre plus grand que les MWCNT courts. Dans le compresseur d'air de notre nouveau processus de décompression, les structures en couches minces des GONR étaient inférieures à ce que nous avions obtenu dans le premier rapport pour la même puissance micro-onde de 250 W tout en conservant les MWCNT centraux plus épais. apparaissent à la place de la structure de nanoruban entièrement décompressée à travers toutes les puissances de micro-ondes dans le nouveau processus. Pour comparer avec le court GONR dans nos études précédentes, 34 la puissance de micro-ondes plus élevée a généré plus d'encoches sur le côté des rubans et n'a pas formé de beaux bords de ruban lisses. Notez que nous avons utilisé deux types différents de grilles Cu dans la figure 1a. Pour les MWCNT et les GONR de longueur suffisante, la grille Gu avec une forme en dentelle stabilisée avec du carbone (produit no. 01881-F, Ted Pella, Inc., USA) a été utilisée. Les trous ouverts dans un film de carbone en dentelle ont empêché une image de transmission superposée entre les nano carbones et le film de carbone. Les réseaux gris foncé appartiennent au film de carbone en dentelle. Cependant, la grille Gu avec formvar stabilisé avec du carbone (produit n° 01800-F, Ted Pella, Inc., USA) était nécessaire pour le MWCNT court et le GONR court. En effet, les gros trous dans le film de carbone en dentelle ont causé des problèmes pour maintenir efficacement le MWCNT court et le GONR court. Comme illustré sur la figure 1, le contraste gris clair sous les MWCNT courts et les GONR courts est une légère couche de carbone. Cette couche de carbone a stabilisé le film de formvar exposé au faisceau d'électrons via ses propriétés de conduction thermique et électrique.

2.2. Configurations de liaison des MWCNT et des GONR.

Les spectres Raman des quatre nanocarbones sont présentés sur la figure 1b ; la bande D des GONR était supérieure à celle des MWCNT après le processus de décompression. Cela a été attribué au niveau d'oxydation plus élevé et à un plus grand nombre de structures de bord de GONR par rapport aux MWCNT. Ce phénomène est également similaire à ce que nous avons observé en 2011.12 En raison du niveau de graphitisation élevé, la bande G des MWCNT avait le nombre de pleine largeur à mi-hauteur le plus bas. Les ratios ID/IG des quatre nanocarbones étaient respectivement de 0.076, 0.502, 0.483 et 0.700. En bref, la diminution de la longueur et de l'oxydation de surface a augmenté le niveau de défaut et a ainsi rendu les rapports ID/IG plus élevés. Le pic D 'est présent dans tous les graphènes défectueux et est considéré comme une mesure de qualité. 35 Comme illustré à la figure 1b, les pics D 'dans les quatre spectres deviennent plus importants après le processus de coupe ou de décompression, ce qui suggère qu'il s'agit de processus destructeurs qui introduisent nombreux défauts. La figure 1c, d affiche les spectres de spectroscopie photoélectronique à rayons X des quatre nanocarbones. Apparemment, le pic D 'est le plus clair pour les GONR courts. Comme le montre la figure 1c, le niveau d'O a augmenté de manière significative de 7,6 % (MWCNT) à 19,9 % (GONR) en raison de la forte capacité d'oxydation du KMnO4 dans un environnement acide. D'autre part, le niveau d'O a légèrement augmenté de 0,8 % de MWCNT aux MWCNT courts. Il est important de noter que le niveau d'O le plus élevé est de 38,3 % pour le GONR court, ce qui implique que les extrémités des nanorubans seraient plus faciles à attacher aux groupes fonctionnels oxygénés que les surfaces sp2 planes. Le plus grand nombre de pleine largeur à mi-maximum et le passage à l'énergie de liaison élevée des pics C 1s après le processus de décompression des deux MWCNT et des MWCNT courts sont illustrés à la figure 1d. Pour les oxydes de graphène, les pics déconvolués dans l'énergie de liaison élevée pourrait être attribué aux liaisons C−C(CC), C−O,CO et COOH.36 Nous avons caractérisé GONR (200W) en 2013,37 et les résultats étaient similaires aux résultats de cette étude.Cette étude a conclu les phénomènes de spectres Raman, ce qui signifie que davantage de groupes fonctionnels contenant de l'oxygène ont été générés lors de la transformation du tube en ruban (Figure 2).

2.3. Propriétés antioxydantes des MWCNT et des GONR.

2.3.1. Détermination des dosages d'activité de piégeage des radicaux libres 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle.

1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl (DPPH) l'activité de piégeage des radicaux libres est unantioxydantplate-forme appliquée pour détecter la capacité antioxydante ; les résultats pour les quatre nanocarbones sont décrits dans le tableau 2. Dans le test DPPH, la vitamine C à une concentration de 100 μM a été utilisée comme contrôle positif. Pour tester les activités antioxydantes des MWCNT, des MWCNT courts, des GONR et des GONR courts, des doses de 1, 5 et 10 mg/L ont été incubées dans la solution réactionnelle pour mesurer les propriétés. Les MWCNT, les MWCNT courts, les GONR et les GONR courts avaient des capacités inhibitrices modérées à 1{{20}} mg/L (19,2 ±0.3, 12,1 ± 0,3, 26,8 ± 0,3 et 30,0 ± 0,4 pour cent), tandis que la vitamine Chad a un état similaire à 100 μM (93,4 ± 0,1 pour cent) pour la suppression.

2.3.2. Essai d'activité chélatrice d'ions.

Dans la situation de stress oxydatif, la ferrozine peut développer un complexe avec Fe2 plus à mesurer quantitativement. En présence de médiateurs chélateurs, le complexe est rompu, provoquant la réduction des ions ferreux d'une couleur rouge foncé du complexe Fe2 plus. Nous avons utilisé l'EDTA comme contrôle positif. Le tableau 2 montre que les MWCNT, les MWCNT courts, les GONR et les GONR courts avaient une activité chélatrice à 10 mg/L (29,2 ± {{10}}.8, 28,7 ± 0. 7, 69,7 ± 0,6 et 68,9 ± 0,3 %), tandis que le témoin positif présentait une condition similaire à 100 μM (93,4 ± 0,1 %).

2.3.3. Mesure de la puissance antioxydante ferrique-réductrice.

Le dosage du potentiel ferrique-réducteur est un test simple et fiable utilisé pour quantifier la synthèse du complexe Fe(III)-ferricyanure. Dans ce test, le pouvoir réducteur des quatre nanocarbones produisant le complexe ferreux Fe(III)−TPTZ a été détecté par des changements dans la couleur de la solution du jaune au vert et au bleu. Le tableau 2 montre que les pouvoirs réducteurs de MWCNT, MWCNT court, GONR et GONR court étaient de densité optique (DO) 1,11, 1,13, 1,15 et 1,11 à 10 mg/L.

2.3.4. Les MWCNT et les GONR inhibent l'accumulation intracellulaire de ROS.

De nombreux rapports ont montré que les ROS détruisent l'intégrité structurelle des membranes cellulaires, y compris les membranes cellulaires et les membranes nucléaires, entraînant des dommages cellulaires et une perte de fonction normale. l'inhibition de la production de ROS est une bonne stratégie pour réguler à la baissemélanine synthesis. In this study, we used the 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) staining assay to analyze the intracellular oxidative stress level in MWCNT and GONR treatment cells. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) induced oxidative stimulations in MWCNT and GONR groups and was used as a negative control.41 When the concentration of PMA was 20 ng/mL, it induced oxidative stress, increasing the value to 38%; after treating GONRs and MWCNTs, the levels of ROS were downregulated to the normal level. The data showed that both materials inhibited oxidative stress levels, and the anti-oxidative effect of GONRs was higher than that of MWCNTs (Figure 3). Table 1 shows a similar consequence list. We contended that there are three reasons for our new findings: first, the order of solubility of these materials was as follows: short GONRs > GONRs >MWCNT courts> MWCNT, ce qui signifie que la zone de contact des GONR courts était la plus grande, elle était donc supérieure pour le balayage ROS. Deuxièmement, les GONR et les MWCNT étaient des structures de carbone sp2-qui pouvaient détruire l'électricité ROS par adductation ou transfert d'électrons.42 Nous avons constaté que leeffets antioxydantsdes structures de nanorubans étaient meilleures que celles des structures de nanotubes, de sorte que les nanorubans facilitent le transfert d'électrons que les nanotubes. Enfin, dans la figure 1b, nous observons que le site carboné GONR sp2-contenait plus de groupes fonctionnels oxygénés que les MWCNT, les groupes d'acide carboxylique pouvaient chélater les ions métalliques et les groupes hydroxyle pouvaient être un donneur de H pour piéger les ROS et inhiber la production de mélanine.

2.4. Cytotoxicité des MWCNT et des GONR traités dans des cellules de fibroblastes dermiques humains.

La méthode du {{0}}(4,5-diméthylth-triazole-2-yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium (MTT) a été appliquée pour évaluer le pouvoir cytotoxique propriétés des GONR sur les cellules Hs68 (Figure 3), et les cellules ont été cultivées à différentes doses de 1, 5 et 10 ug/mL. Nous avons examiné que les viabilités cellulaires des MWCNT étaient de 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 et 94,1 ± 4,7 % à des concentrations de 1, 5 et 10 mg/L, respectivement ; les viabilités pour le court MWCNT ont été calculées dans le même ordre et se sont avérées être de 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 et 98,9 ± 2,1 %. Nous avons observé que les cellules B16-F10 étaient incubées à des concentrations élevées et que la survie cellulaire des cellules Hs68 était supérieure à 80 %, ce qui suggère que le MWCNT et le court MWCNT n'avaient aucun effet toxique sur les cellules de fibroblastes dermiques humains. Les viabilités cellulaires du GONR et du GONR court étaient 86.24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 et 90,64 ± 2,5 %. Il est également souligné sur la figure 4a que GONR et shortGONR n'ont pas eu d'effet cytotoxique perceptible sur les cellules HS68. Dans des rapports antérieurs, l'utilisation de nanomatériaux non testés à des fins cosmétiques pouvait être considérée comme discutable,43,44 et était généralement due à l'attaque de l'ADN après que les nanoparticules aient pénétré dans les cellules. Après le test de cytotoxicité, nous avons constaté que nos matériaux n'entraînaient pas de toxicité pour les cellules cutanées normales. Nous avons conclu qu'après l'entrée des nanomatériaux dans les cellules, les nanomatériaux inhibent simplement la production de mélanine en diminuant le stress oxydatif et en chélatant les ions métalliques et n'endommagent pas les mitochondries ou l'ADN, ce qui signifie que les MWCNT et les GONR peuvent être utilisés en toute sécurité.

2.5. Deux types de MWCNT et de GONR dans l'activité de la tyrosinase cellulaire B16-F10 et la teneur en mélanine.

Dans lemélaninevoie de synthèse, la tyrosinase joue un rôle essentiel. La tyrosinase s'oxyde et forme l'eumélanine et la phéomélanine par une série de réactions biochimiques. Afin de déterminer si les GONR et les MWCNT inhibent les activités de la tyrosinase et provoquent une diminution de la production de mélanine, nous avons analysé l'activité de la tyrosinase dans les cellules B16-F10. Nous avons constaté que les MWCNT et les MWCNT courts inhibaient l'activité de la tyrosinase d'environ 17,1 % et 23 % à 10 mg/L. Les GONR et les GONR courts ont eu un meilleur effet dans la suppression de l'activité de la tyrosinase aux mêmes concentrations par rapport à un autre GONR. Ils étaient également dépendants de la dose et inhibaient 49,8 % et 44,7 % de l'activité de la tyrosinase, comme le montre la figure 4b.

Mélanineest un pigment indispensable dans le corps humain, mais la surexpression de la mélanine déclenche souvent une série de maladies. Dans des études antérieures, Xiao et al. ont utilisé un matériau similaire, Radical Sponge, une nanoparticule de fullerène, comme agent anti-mélanique.45 Il y a eu quelques bons résultats ; environ 20 pour cent demélaninela production pourrait être inhibée. Afin d'améliorer son efficacité, nous avons encore amélioré le matériel de test pour mesurer le taux d'inhibition de la mélanine et son mécanisme moléculaire, comme le montrent les figures 4c et 5. Les MWCNT et les MWCNT courts ont réduit la teneur en mélanine de 17,6 ± 5,5 et 13,2 ± 0. 2 % à 10 mg/L et de manière dose-dépendante. Les GONR et les GONR courts ont puissamment régulé à la baisse les valeurs à 32,0 ± 2,3 et 35,3 ± 3,4 % à 10 mg/L. Les résultats expérimentaux ont suggéré que les quatre types pouvaient inhiber la synthèse de mélanine et que les GONR avaient un effet plus fort. D'autre part, nous avons également observé que le GONR court a un meilleur effet d'inhibition de la production de mélanine. Nous concluons que les GONR courts ont plus de groupes fonctionnels et peuvent empêcher efficacement la tyrosinase catalysée par les ions métalliques, inhibant davantage la production de mélanine (Figure 2). Dans le tableau 1, on observe que l'effort de type court chélatant les ions métalliques est supérieur au type normal ; cela signifie que ces courts GONR pourraient être potentiellement appliqués dans le domaine cosmétique en tant qu'agents de soin de la peau.

2.6. Le mécanisme des MWCNT et des GONR a inhibé la teneur en mélanine cellulaire B16-F10.

Les cellules répondent au stress oxydatif externe en régulant l'expression des protéines. Les cellules B16-F10 améliorent l'expression du gène c-myc et régulent à la hausse l'AMPK pour diminuer les niveaux d'oxydation,46 et dans ce travail, MITF est un facteur de transcription spécifique de la tyrosinase pour réguler la voie du signal de synthèse de la mélanine moléculaire.47-49 Dans la figure 5a, les MWCNT et les GONR régulent à la baisse le facteur de transcription associé à la microphtalmie en réduisant le stress oxydatif, puis les gènes en aval TRP-1 et TRP-2 ont également été régulés à la baisse. Pour le niveau protéique, un phénomène similaire a été trouvé, par lequel les MWCNT et les GONR régulaient à la baisse la voie de mélanogénèse liée au MITF, puis réduisaient finalement lamélaninecontenu (Figure 5b).

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3. MATERIEL EXPERIMENTAL ET METHODES

3.1. Préparation des MWCNT et des GONR.

Le processus pertinent de fabrication des GONR a été rapporté dans un article précédent.12MWCNT (0.05 g) a été mis en suspension dans 9:1 H2SO4/H3PO4 et traité avec un réacteur à micro-ondes (CEM-Discover) avec le réglage de puissance à 250 W pendant 2 min. Après l'ajout de KMnO4 (0,25 g) aux solutions, les solutions ont été traitées avec la même puissance de micro-ondes à 65 degrés pendant 4 min12. Nous avons ensuite modifié ce processus en utilisant un temps de micro-ondes de deuxième étage plus court de 8 min en utilisant un compresseur d'air. Ici, le compresseur d'air est utilisé pour contrôler la température du réacteur à micro-ondes pendant le processus. La puissance des micro-ondes a été fixée à 250 W lors des tests préliminaires.

3.2. Préparation des MWCNT courts et des GONR courts.

Le processus pertinent pour fabriquer des GONR courts a été rapporté dans notre article précédent.34 Le temps de traitement acide a été choisi comme étant de 8 h. La puissance des micro-ondes a été fixée à 250 W, ce qui est la même que pour obtenir les GONR.

3.3. Activité de piégeage des radicaux DPPH.

Le DPPH était fréquemment utilisé pour décider de la capacité de piégeage des échantillons et des propriétés antioxydantes.50 Le DPPH est un réactif violet qui change la couleur du violet au jaune si les radicaux libres sont transférés à l'analyte. Des échantillons anti-oxydants positifs avec des concentrations appropriées ont été ajoutés à la solution, et les échantillons ont été analysés à 517 nm pendant 30 min. Nous avons utilisé les pourcentages du DPPH restant en plus des échantillons de test pour mesurer le nombre deantioxydantsnécessaire pour réduire les radicaux DPPH précédents. La vitamine C à 100 μM a été utilisée comme contrôle positif. L' activité de piégeage ( pourcentage ) a été mesurée comme

3.4. Activité de chélation des métaux.

L'ion métallique est le facteur qui provoque une oxydation excessive des lipides, et Fe2 plus est l'un des ions les plus influents.50 Différentes concentrations de nano-biomatériaux (1 μL) ont été chargées dans une plaque à puits 96-, qui contenait 2 mM de FeCl2·4H2O ( 10 μL), puis chargés dans de la ferrozine (5mM, 20 μL). Le mélange a été entièrement mélangé avec 69 μL de menthol et maintenu à température ambiante pendant 10 min. Ensuite, la solution réactionnelle de l'échantillon a été observée à 562 nm. L'EDTA a été utilisé comme contrôle positif à 100 μM, et la formule de calcul de l'activité de chélation des métaux était basée sur l'eq 1.

3.5. Réduction de puissance.

Le calcul du pouvoir réducteur est basé sur une étude précédente. 50 Tout d'abord, 2,5 μL de matériaux de graphène ont été mélangés avec du tampon PBS (67 mM, pH 6,8) et K3Fe (CN) 6 (2,5 μL, 20 pour cent), puis incubés à 50 degrés pendant 20 min. Ensuite, de l'acide trichloroacétique à 10 % (160 μL) a été mélangé avec des réactifs à 300 g centrifugés pendant 20 min. La longueur d'absorption a été déterminée à 700 nm après mélange avec 25 μL de FeCl3 (2 %). L'hydroxyanisole butylé (BHA) a été utilisé à 100 μM.

3.6. Examens de prolifération cellulaire.

La lignée cellulaire de fibroblastes dermiques humains HS68 a été utilisée pour analyser le rapport de prolifération cellulaire. HS68 a été incubé dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline et de streptomycine mélangés.50,51 Après avoir été traité avec différentes concentrations d'échantillons, nous avons appliqué le MTT pour détecter le taux de prolifération cellulaire. 8 000 cellules ont été ensemencées dans des plaques à puits 96- et traitées avec des échantillons pendant 24 h. La solution surnageante a été retirée et nous avons utilisé la solution MTT pour la culture pendant 2 h à 37 degrés. Après incubation, on a retiré le milieu contenant du MTT et on l'a dissous avec du diméthylsulfoxyde (DMSO). La solution a été lue à OD 590nm et le taux a été calculé par eq 1.

3.7. Évaluation du contenu en mélanine cellulaire.

Nous avons utilisé une méthode avec des modifications mineures basée sur le dosage précédent.52,53 Des culots cellulaires de B16−F10 du Bioresource Collection and Research Center (BCRC, CRL 6323, Hsinchu,Taiwan) ont été dissous dans un mélange de 2,0 N NaOH et 10 % de DMSO. L'échantillon a ensuite été chauffé pendant 1 h à 90 degrés et centrifugé à 10,000 g pendant 10 min supplémentaires pour obtenir le surnageant clarifié. Lamélaninele comptage a été déterminé en surveillant la DO du surnageant à 475 nm.

3.8. Activité tyrosinase cellulaire B16-F10.

Pour l'activité de la tyrosinase cellulaire B16-F10, nous nous sommes référés aux travaux précédents avec quelques modifications.50 Les cellules ont été cultivées dans des plaques à puits 12- à 105 cellules par puits. Après les traitements avec des échantillons, les cellules ont été lysées dans 1 % de Triton X-100/PBS et 2 mML-tyrosine (50 μL) pendant 3 h. Après l'incubation, nous avons retiré le milieu et lu l'absorbance à DO 590 nm. La formule d'activité de la tyrosinase a été calculée par l'équation 1.

3.9. Détection des ROS par coloration DCFDA.

En référence à l'étude précédente,54 1.2 1.105 cellules B16−F10 ont été ensemencées dans des6-plaques à puits et traitées avec diverses concentrations d'échantillons. Les cellules ont été mises en suspension dans du PBS puis chargées de DCFDA (5 μM) dans du DMEM rouge non phénol pendant 30 min à 37 degrés. Le cytomètre en flux (Guava, Merck, Allemagne) a été utilisé pour détecter le signal fluorescent du DCFDA. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission du DCFDA étaient respectivement de 488 et 535 nm.

3.10. Réaction quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel.

Nous avons suivi les méthodes de Lin et al. (2018).1La réaction en chaîne quantitative de transcription inverse-polymérase en temps réel (qRT-PCR) consistait en une amorce-sonde exclusive pour générer une fluorescence. Il a utilisé une technique de détection de fluorescence qui détecte chaque cycle à l'aide d'un 7500 qRT-PCRSystem (Applied Biosystems, USA). Il a détecté le cycle en fonction de la quantité de fluorescence libérée, puis le produit de chaque cycle a été calculé pour le contenu généré, ce qui a permis d'atteindre des objectifs quantitatifs en temps réel. Trizol (Invitrogen, USA) a été utilisé pour extraire un ARN complet du tissu pulmonaire, selon les instructions données par le fabricant. Par la suite, un kit de transcription inverse (Takara, Japon) a été utilisé pour générer de l'ADN. Dans la qRT-PCR utilisant des amorces, répertoriées dans le tableau 1, tout d'abord, l'échantillon a été chauffé pour former un seul brin d'ADN ; puis une liaison d'amorce a eu lieu pour former un ADN double brin (ADNdb), après quoi l'ADNdb SYBR Green a été combiné, pour lequel le kit de réactifs SYBR green plus (Roche, Bâle, Suisse) a été utilisé, ce qui a entraîné la libération de fluorescence. Le résultat a été passé à travers un système de détection de fluorescence. La détection des signaux fluorescents a eu lieu pendant la phase d'élongation ou d'hybridation de chaque cycle ; après la détection, le contenu de l'échantillon a été repoussé par les intensités de fluorescence détectées.55 Les niveaux d'expression des gènes cibles ont été normalisés aux niveaux de -tubuline en utilisant la méthode 2-ΔΔCt .

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3.11. Test Western Blot.

Les cellules B16-F10 ont été lysées à 4 degrés pendant la nuit avec un tampon de test de radioimmunoprécipitation (Thermo Scientific Co., USA), qui contient des inhibiteurs de protéase. Le kit d'analyse de protéines d'acide bicinchoninique (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA) a été utilisé pour quantifier la quantité de protéines. Les échantillons de protéines ont été séparés sur un gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium à 10 % et transférés sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (Pall LifeScience, Ann Arbor, MI, USA). La membrane PVDF a été bloquée avec un tampon de blocage (Thermo Scientific) pendant 1 h et incubée avec l'anticorps primaire spécifique pendant une nuit à 4 degrés. Ensuite, la membrane a été lavée deux fois avec du tampon salin Tween 20 tamponné au Tris et incubée avec des anticorps secondaires pendant 1,5 h. Après cela, la membrane a été plongée dans des réactifs de détection de chimioluminescence (Thermo Scientific) et analysée par un MiniChemi Chemiluminescenceimager (Beijing Sage Creation Science, Chine). Les sources d'anticorps comprenaient l'anti-MITF de lapin, l'anti-TRP de lapin-1, l'anti-TRP de lapin-2 et l'actine (Thermo Scientific).

3.12. Analyse des matériaux.

TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) a été utilisé pour observer la morphologie du nanocarbone. Un spectromètre micro Raman (PTT, RAMaker) a été appliqué pour vérifier les modes de résonance du nanocarbone. Des mesures de spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) ont également été effectuées pour déterminer l'analyse compositionnelle.

3.13. Analyses statistiques.

Tous les échantillons et expériences standard ont été répétés au moins trois fois. Nous avons appliqué le test t de Student pour comparer et exprimer statistiquement la moyenne des valeurs moyennes ± l'écart type.

4. CONCLUSIONS

En résumé, nous avons observé que le GONR court était un matériau potentiel pour la production de soins de la peau en raison de ses multiples propriétés biofonctionnelles (Figure 6). Les résultats ont montré que le nanocarbone jouait un rôle d'antioxydant extracellulaire et intracellulaire. Pendant ce temps, le nanocarbone a inhibé l'activité de la tyrosinase et lamélaninecontenu et n'a causé aucune blessure grave aux cellules pigmentaires. Ce travail a établi les fonctions anti-mélanogénèse de quatre types de nanocarbone ; de futures études examineront le mécanisme de ces composés sur des expressions spécifiques de gènes et de protéines liées à la maturation, au transport et à l'accumulation de la mélanine.

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