Un niveau d'exercice approprié atténue la dysbiose intestinale et l'augmentation de l'acide valérique pour améliorer la neuroplasticité et la fonction cognitive après une chirurgie chez la souris, partie 3

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Les protocoles et procédures expérimentaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Virginie (Charlottesville, VA, États-Unis ; numéro de protocole : 3114).

La mémoire est l’une des capacités que nous devons souvent utiliser dans notre vie quotidienne. Cela peut rendre les gens plus intelligents, plus sensibles et plus propices à la carrière et aux relations interpersonnelles. C’est pourquoi de nombreuses personnes souhaitent améliorer leur mémoire. Il existe une relation entre les protocoles expérimentaux et la mémoire. Explorons ensuite cette question.

Premièrement, les protocoles expérimentaux peuvent aider les gens à améliorer leur mémoire. Dans l'expérience, les gens doivent suivre certaines étapes pour terminer l'opération expérimentale. Cette activité étape par étape peut mettre le cerveau humain dans un état d’attention et de concentration élevées, favorisant ainsi l’exécution des fonctions cérébrales. Dans le même temps, vous devez vous souvenir de certaines données expérimentales et étapes expérimentales au cours de l'expérience, qui exerceront également la fonction de mémoire du cerveau. En pratiquant de cette manière à plusieurs reprises, votre mémoire s’améliorera progressivement.

Deuxièmement, l’expérience sensorielle au cours du processus de mémoire est également étroitement liée à la conception du plan expérimental. Dans les expériences, les concepteurs fixent souvent certaines tâches spécifiques au cours de l'expérience, de sorte que les participants doivent répéter la même opération plusieurs fois, comme la mémoire et l'écriture de nombres, la mémoire et la reconnaissance de blocs de couleur, etc. Cette expérience répétitive peut renforcer les capacités des individus. capacités d’attention et de mémoire, ce qui permet aux gens de traiter plus facilement ces informations dans la mémoire à long terme.

De plus, dans les expériences, l’utilisation de matériels de stimulation représentatifs (tels que des images, des sons, des odeurs, etc.) peut également produire de bons résultats. Parce que ces stimuli peuvent déclencher les processus d’excitation et de mémoire du cerveau, améliorant ainsi la capacité de mémoire des personnes. Dans le même temps, ces stimuli peuvent également être couplés à l’environnement et aux situations de la vie, réduisant ainsi l’apparition de découplage et rendant les informations plus faciles à mémoriser et plus cohérentes.

En résumé, le plan expérimental joue un rôle crucial dans l’amélioration de la mémoire humaine. En menant des expériences, les gens peuvent exercer leurs capacités cognitives, améliorer leurs niveaux de mémoire et en même temps favoriser les fonctions cérébrales. Par conséquent, nous devrions continuer à apprendre de nouvelles méthodes expérimentales et participer à davantage d’expériences pour améliorer nos niveaux de mémoire et apporter une plus grande contribution à notre carrière, nos relations et notre santé. On peut voir que nous devons améliorer la mémoire, et Cistanche deserticola peut améliorer considérablement la mémoire, car Cistanche deserticola a des effets antioxydants, anti-inflammatoires et anti-âge, qui peuvent aider à réduire l'oxydation et les réactions inflammatoires dans le cerveau, protégeant ainsi le santé du système nerveux. De plus, Cistanche deserticola peut également favoriser la croissance et la réparation des cellules nerveuses, améliorant ainsi la connectivité et le fonctionnement des réseaux neuronaux. Ces effets peuvent contribuer à améliorer la mémoire, la capacité d’apprentissage et la vitesse de réflexion, et peuvent également prévenir le développement de dysfonctionnements cognitifs et de maladies neurodégénératives.

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Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées selon le Guide des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (publications NIH numéro 80-23), révisé en 2011. Les sources des documents clés ont été répertoriées dans le tableau des ressources clés des documents supplémentaires.

Animaux et conception expérimentale

Des souris mâles C57BL/6 J âgées de huit semaines, pesant entre 19 et 22 g, ont été hébergées dans une pièce maintenue dans des conditions environnementales constantes (température de 22 à 24 degrés, cycle lumière/obscurité de 12 h et 50 ± 10 % d'humidité) avec libre accès à la nourriture. et de l'eau.

Tous ont été autorisés à s'acclimater pendant une semaine avant les expériences. Ils ont été répartis au hasard dans les groupes suivants lors de la première expérience : (1) groupe témoin (non exposé à l'anesthésie et à la chirurgie), (2) groupe d'exercice (exercé à 35–40 % de sa capacité maximale, mais n'étant pas exposé à l'anesthésie et à la chirurgie) , (3) groupe chirurgie (exposition de l'artère carotide gauche pendant 15 min sous anesthésie à l'isoflurane pendant 2 h), et (4) à (6) groupes Exe-l+Sur, Exe-m+Sur et Exe-h+Sur : exercés à 35 heures –40%, 55-60% et 75-80% de capacité maximale, respectivement, et ont été soumis à une anesthésie et à une intervention chirurgicale.

Les animaux ont été utilisés pour des tests d'apprentissage et de mémoire commençant 4 jours après l'opération (n=20) ou leur cerveau a été récolté pour des tests biochimiques 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h et 7 jours après l'opération. (n=9 ou 14), pour la coloration immunofluorescente à 48h et 19 jours après l'intervention chirurgicale (n=6), et pour la coloration de Golgi à 19 jours après l'intervention chirurgicale (n=8).

Le sang et les excréments des souris des 4 premiers groupes ont été récoltés pour mesurer les SCFA 7 jours après l'intervention chirurgicale (n=7) et pour des analyses 16 S à 3 et 7 jours après l'intervention chirurgicale (n=8) ou à la fin du protocole d'exercice de 4-semaine (n=8) ​​ou à l'heure correspondante dans les 2 premiers groupes (n=16). Les souris destinées à la récolte de tissus étaient différentes cohortes de souris utilisées pour des tests d'apprentissage et de mémoire. Dans la deuxième expérience, les souris ont été assignées au hasard à (1) le groupe Transcontrol+Sur et (2) le groupe Trans-exe+Sur.

Les souris du premier groupe ont reçu 500 ul de solution fécale du groupe témoin par gavage gastrique et 600 ul par lavement une fois par jour pendant 7 jours consécutifs après un traitement antibiotique pour éliminer le microbiote intestinal natif des receveurs. Les souris du deuxième groupe ont reçu 500 ul de solution fécale provenant de souris d'exercice par gavage gastrique et 600 ul par lavement une fois par jour pendant 7 jours consécutifs après le traitement antibiotique. Les matières fécales des receveurs ont été récoltées 14 jours après la transplantation fécale pour analyse 16 S. Les souris ont ensuite été soumises à une intervention chirurgicale.

L'apprentissage et la mémoire ont été évalués à partir de 4 jours après la chirurgie (n=15). Le cerveau a été récolté pour des études biochimiques comme dans la première expérience (n=10). Dans la troisième expérience, les souris ont été assignées au hasard à (1) le groupe Transcontrol et (2) le groupe Trans-control+Sur. Les souris des deux groupes ont reçu une transplantation de matières fécales provenant de souris témoins. Le deuxième groupe a été opéré 14 jours après la transplantation fécale. L'hippocampe a été récolté 2 jours après l'intervention chirurgicale pour mesurer le GDNF (n=10). Dans la quatrième expérience, les souris ont été assignées au hasard à (1) le groupe témoin (souris naïves qui n'ont été exposées à aucune des conditions expérimentales décrites dans cette étude), (2) le groupe antibiotique qui a reçu des antibiotiques pendant 7 jours, et (3) le groupe trans-témoin qui a reçu une transplantation d'excréments de souris témoins.

L'apprentissage et la mémoire ont été évalués 19 jours après la fin de la transplantation fécale (26 jours après la fin du traitement antibiotique dans le groupe antibiotique) (n=12). Dans la cinquième expérience, les souris ont été assignées au hasard à (1) le groupe témoin, (2) le groupe Trans-contrôle qui a reçu une transplantation d'excréments de souris témoins, et (3) le groupe Trans-chirurgie qui a reçu une transplantation d'excréments de souris chirurgicales. 

La transplantation fécale a été réalisée comme décrit dans la deuxième expérience. Les matières fécales des receveurs ont été récoltées 14 jours après la transplantation fécale pour une analyse 16 S (n=10). L'apprentissage et la mémoire ont été évalués 4 jours après la récolte de l'échantillon fécal (n=17). Dans la sixième expérience, les souris ont été assignées au hasard à (1) un groupe de chirurgie plus une solution saline normale qui a reçu 200 µl de solution saline normale (NS) par injection intrapéritonéale une fois. par semaine pendant 4 semaines, puis intervention chirurgicale, (2) exercice plus solution saline normale plus groupe chirurgical ayant reçu 200 µl de NS par injection intrapéritonéale une fois par semaine pendant la 4- semaine d'exercice à une capacité maximale de 35 à 40 %, puis intervention chirurgicale, (3 ) exercice plus acide valérique plus groupe chirurgical ayant reçu de l'acide valérique (200 mg/kg dans 200 µl) par injection intrapéritonéale une fois par semaine pendant la semaine d'exercice 4- à une capacité maximale de 35 à 40 %, puis par intervention chirurgicale.

L'injection a été effectuée le matin du premier jour d'exercice de la semaine. Une injection supplémentaire a été réalisée le jour de l'opération. Les résultats comportementaux (n=13) et biochimiques (n=10) ont été évalués comme dans la deuxième expérience. Dans la septième expérience, un mâle C57BL/ âgé de 13- semaines (pesant 23 à 27 g) 6 souris J ont été assignées au hasard à (1) le groupe témoin, (2) le groupe NS qui a reçu 4 µl de NS par injections intracérébroventriculaires une fois par jour pendant 4 jours consécutifs, et (3) le groupe acide valérique qui a reçu 4 mg/kg dans 4 µl par voie intracérébroventriculaire. injection une fois par jour pendant 4 jours consécutifs. Les ventricules cérébroventriculaires gauche et droit ont été injectés selon un calendrier alterné. L'apprentissage et la mémoire ont été évalués 4 jours après l'injection (n=15).

Dans la huitième expérience, les souris ont été assignées au hasard à (1) un groupe de chirurgie plus diméthylsulfoxyde (DMSO) ayant reçu du DMSO par injection intracérébroventriculaire une fois par jour pendant 4 jours consécutifs à compter du jour de l'opération, (2) un groupe de chirurgie plus antagoniste de C3ar ayant reçu un antagoniste de C3ar (SB290157). ) par injection intracérébroventriculaire une fois par jour pendant 4 jours à partir du jour de l'intervention chirurgicale, (3) exercice plus DMSO plus groupe chirurgical ayant reçu du DMSO par injection intracérébroventriculaire une fois par jour pendant 4 jours consécutifs à partir du jour de l'intervention chirurgicale après la semaine d'exercice de 4- à 35 heures. –40 % de capacité maximale, et (4) un groupe d'exercice plus un agoniste C3ar plus une intervention chirurgicale qui a reçu un C3aragoniste par injection intracérébroventriculaire une fois par jour pendant 4 jours consécutifs à partir du jour de l'intervention chirurgicale après la semaine d'exercice de 4- à une capacité maximale de 35 à 40 % . Les tests comportementaux ont été démarrés 4 jours après l'intervention chirurgicale comme indiqué ci-dessus (n=15).

Dans la neuvième expérience, les souris ont été assignées au hasard à (1) le groupe témoin, (2) le groupe chirurgical, (3) le groupe chirurgie plus GDNF qui a reçu du GDNF par injection intracérébroventriculaire lors de la chirurgie, et (4) le groupe chirurgie plus GDNF inactivé par la chaleur. groupe qui a reçu du GDNF inactivé par la chaleur par injection intracérébroventriculaire lors d'une intervention chirurgicale. Les hippocampes ont été récoltés 48 h après l'intervention chirurgicale pour une étude ELISA (n=12). Après une semaine d'acclimatation, des souris âgées (18- souris mâles C57BL/6 J d'un mois) pesant 30 à 36 g ont été utilisées dans trois études. Dans la première expérience, des souris âgées ont été assignées au hasard à (1) le groupe témoin, (2) le groupe d'exercice dans lequel les souris ont fait 4- semaines d'exercice à une capacité maximale de 35 à 40 %, (3) le groupe de chirurgie et (4) le groupe Exe+Sur dans lequel les souris ont effectué un exercice de 4- semaines à une capacité maximale de 35 à 40 % avant la chirurgie. Les animaux ont été utilisés pour des tests d'apprentissage et de mémoire commençant 4 jours après l'intervention chirurgicale (n=12) ou leurs cerveaux ont été prélevés pour des tests biochimiques 48 h après l'intervention chirurgicale (n=10 ou 12), pour une coloration immunofluorescente à 48 h. et 19 jours après l'intervention chirurgicale (n=6), et pour Golgistaining à 19 jours après l'intervention chirurgicale (n=8).

Le sang et les excréments des souris des 4 groupes ont été récoltés pour la mesure des SCFA 7 jours après l'intervention chirurgicale (n=7) et pour des analyses 16 S 3 et 7 jours après l'intervention chirurgicale (n=8) ou à la fin. du protocole d'exercice de 4-semaine ou à l'heure correspondante dans les 2 premiers groupes (n=16). Les souris destinées à la récolte de tissus constituaient différentes cohortes utilisées pour des tests d'apprentissage et de mémoire. Dans la deuxième expérience, des souris âgées ont été assignées au hasard à (1) le groupe Trans-Old Control+Sur et (2) le groupe Trans-Old Exe+Sur. Ces souris ont été soumises à une intervention chirurgicale 14 jours après une transplantation fécale comme décrit dans le deuxième expérience sur de jeunes souris adultes. L'apprentissage et la mémoire ont été évalués à partir de 4 jours après l'intervention chirurgicale (n =10).

Dans la troisième expérience, des souris âgées ont été assignées au hasard au groupe (1) chirurgie plus NS ; (2) groupe exercice plus NS plus chirurgie ; et (3) exercice plus acide valérique plus groupe de chirurgie. Ces souris ont reçu un conditionnement physique et de l'acide valérique comme décrit dans la sixième expérience sur de jeunes souris adultes. Les résultats comportementaux ont été testés à partir de 4 jours après la chirurgie (n=11). Les tailles d'échantillon (n) décrites ci-dessus représentaient le nombre d'animaux randomisés dans chaque groupe/condition. Ce nombre d'animaux était la somme d'au moins 3 répétitions de chaque expérience. Les animaux ont été répartis au hasard en groupes sur la base de tableaux de randomisation générés par ordinateur dans chaque expérience.

Détermination de la capacité d'exercice maximale et entraînement physique

Avant l'opération, des souris âgées de {{0}}semaines et 18-mois ont été exposées à un exercice aérobique de 4-semaines sur tapis roulant après une détermination de la capacité d'exercice maximale de chaque souris. Cette détermination a été réalisée d'une manière similaire à celles décrites précédemment [47, 48]. En bref, les souris ont été acclimatées au tapis roulant le premier jour avec les réglages initiaux de la grille de choc à 25 V, 0,3 mA et 2 Hz ainsi que la vitesse et l'inclinaison à zéro pendant 10 min. La vitesse du tapis roulant a ensuite été augmentée à 10 cm/s avec une inclinaison réglée à 50 pendant 10 min. Ensuite, la vitesse et l'inclinaison du tapis roulant ont été augmentées à 15 cm/sable 100 pendant 5 min.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50% du temps sur la grille ; et/ou (3) le manque de motivation pour l'incitation manuelle. La souris a été immédiatement retirée de la piste respective une fois qu'un ou plusieurs de ces critères étaient remplis. Le lendemain, les souris ont couru sur le même tapis roulant à la moitié de la vitesse maximale moyenne (35 cm/s chez les jeunes souris ou 30 cm/s chez les vieilles souris) et 100 d'inclinaison jusqu'à atteindre à nouveau l'un des critères d'épuisement, et la durée de l'exercice continu a été enregistré comme la capacité d'exercice maximale de chaque souris. Après ces deux protocoles, les souris ont été hébergées séparément pendant 30 minutes pour éviter un comportement agressif visible après l'exercice.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >3% du temps total sur 3 jours consécutifs serait exclu.

Les groupes sans exercice participant au même ensemble d'expériences que les groupes d'exercice ont été placés quotidiennement sur un tapis roulant immobile pendant environ 30 à 40 minutes. Ils ont reçu 10 chocs pour un total de 5 s, soit la quantité moyenne de chocs que les souris d'un groupe d'exercice recevaient chaque jour, pendant leur séjour sur un tapis roulant immobile. Si un ensemble d'expériences ne comportait pas de groupe d'exercices, aucune souris de l'ensemble d'expériences ne recevait de chocs.

Traitement antibiotique

Pour faciliter la colonisation du microbiote transplanté, les souris receveuses ont reçu un traitement antibiotique une fois par jour pendant 7 jours consécutifs pour éliminer leur microbiote intestinal d'origine comme décrit par nous et d'autres [11, 36]. En bref, après purgation avec 10 % de sulfate de magnésium (200 ul/10 g, deux fois à 3 h d'intervalle) par gavage gastrique le premier jour, les souris C57BL/6 J ont reçu de l'amoxicilline/acide clavulanique (200 mg/kg), du métronidazole ( 200 mg/kg) et céfazoline (2 g/kg) par gavage gastrique et lavement (dans 300 ul pour gavage gastrique et 400 ul NS pour lavement) le matin 1 fois par jour pendant 7 jours consécutifs, et amoxicilline/acide clavulanique (20 mg/kg ), métronidazole (20 mg/kg) et céfazoline (300 mg/kg) dans 200 ul NS quotidiennement par injection intrapéritonéale pendant les mêmes 7 jours (de 16h à 17h). Pour éviter la contamination bactérienne croisée, la manipulation des souris et le changement quotidien de la cage et des bouteilles d'eau ont été effectués par des techniciens portant une blouse propre et des gants dans une cagoule ventilée. Les matières fécales de ces souris ont été récoltées 24 h après le dernier traitement pour des analyses 16 S afin de déterminer l'effet.

Transplantation fécale

Les pellets fécaux frais collectés dans les 30 minutes suivant la selle des souris témoins, des souris immédiatement après la fin de l'exercice de 4- semaine, ou des souris 2 à 8 jours après la chirurgie ont été dilués avec 100 mg/ml de solution saline stérile. Tous les pellets fécaux de 7 –10 donneurs avec chaque condition expérimentale ont été mélangés et remis en suspension ensemble dans une solution saline. En bref, les matières fécales ont été mélangées au vortex pendant 5 minutes, puis passées à travers un tamis cellulaire en nylon de 70 µm pour éliminer les aliments non digérés et les particules. Les souris receveuses ont reçu 500 ul de solution fécale correspondante par gavage gastrique le matin et 600 ul par lavement l'après-midi à partir de 24 h après la dernière dose d'antibiotiques pendant 7 jours consécutifs. Les souris transplantées ont été maintenues pendant 2 semaines après la transplantation fécale avant d'être soumises à une collecte fécale pour des analyses 16 S et une intervention chirurgicale.

Anesthésie et chirurgie

L'intervention chirurgicale a été laissée à l'artère carotide comme nous l'avons décrit précédemment [6]. En bref, les souris ont été anesthésiées avec 2 % d'isoflurane et ont maintenu une respiration spontanée avec un masque facial alimenté à 100 % d'oxygène pendant la procédure. La température rectale a été surveillée et maintenue à 37 degrés à l’aide d’une couverture chauffante. Une incision médiane du cou de 2- cm et une dissection des tissus mous avec une exposition de l'artère commune de 1- cm de long ont été réalisées sans aucun dommage au nerf vague après que la souris ait été anesthésiée à l'isoflurane pendant au moins 20 minutes. La plaie a ensuite été irriguée et refermée à l'aide d'une suture chirurgicale 4-0. L'intervention chirurgicale a été réalisée dans des conditions stériles et a duré environ 15 minutes chez les jeunes souris et 12 minutes chez les souris âgées. La durée totale de l'anesthésie générale était de 2 heures. Après l'opération, tous les animaux ont reçu une injection sous-cutanée de 3 mg/kg de bupivacaïne. Aucune réponse au pincement des orteils n’a été observée pendant l’anesthésie.

Injections intracérébroventriculaires

Comme décrit ci-dessus, certains groupes de souris ont reçu une injection intracérébroventriculaire. En bref, ces souris ont été placées dans un cadre stéréotaxique en position couchée. Le site d'injection était situé à : 1,00 mm médiolatéral, −0,3 mm antéropostérieur de Bregma et −2,5 mm de profondeur dorsoventrale. Les souris en chirurgie plus le groupe GDNF ont reçu une injection intracérébroventriculaire de 1{{ 20}} ug/kg de GDNF de souris recombinant dans 3 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme décrit dans des études précédentes [6, 26], et des souris en chirurgie et dans un groupe de GDNF inactivé par la chaleur ont reçu une injection de solution dénaturée par la chaleur (5 min à 1000 °C). )Solution GDNF. Les souris chirurgicales ainsi que le groupe antagoniste C3ar ont reçu 10 µg/kg de SB290157 dans 3 ul de PBS contenant 5 % de DMSO à 0 h, 24 h, 48 h et 72 h après la chirurgie. Les souris du groupe exercice plus agoniste C3ar et chirurgie ont reçu 1 ug/kg d'agoniste C3ar dans 3 ul de PBS contenant 5 % de DMSO en même temps que pour le SB290157. Les souris du groupe acide valérique de la sixième expérience ont reçu 4 mg/kg d'acide valérique dans 4 µl pendant 4 jours consécutifs.

Tests comportementaux

L'apprentissage et la mémoire ont été évalués par la reconnaissance d'objets nouveaux et le test du labyrinthe de Barnes. Tous les tests comportementaux ont été effectués à 10 h : 00 - 17 h : 00 h dans une pièce insonorisée. Les souris utilisées dans les tests d'apprentissage et de mémoire n'ont été utilisées pour aucune étude de biochimie afin d'éviter les effets de ces tests.

Nouveau test de reconnaissance d'objets

Comme nous et d'autres l'avons décrit précédemment [20, 49, 50], les souris ont été placées dans une chambre à ciel ouvert pendant 5 minutes pour une habituation 4 jours après la chirurgie. Le test a été effectué de la manière suivante. Deux des mêmes objets ont été placés à des angles adjacents de la chambre le jour de l'apprentissage. Les souris ont été placées dans la chambre, le dos tourné vers les objets, et autorisées à explorer librement la chambre pendant 5 minutes. L'animal était éliminé si le temps total d'exploration sur deux objets était<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

Labyrinthe de Barnes

Sept jours après l'opération, les animaux ont été soumis au labyrinthe de Barnes pour tester leur apprentissage spatial et leur mémoire comme nous l'avons décrit précédemment [6, 49]. Le labyrinthe de Barnes est une plate-forme circulaire avec 20 trous équidistants (SDInstruments, San Diego, Californie). L’un des trous était relié à une chambre noire appelée boîte cible. Le test a commencé en plaçant des animaux au milieu du labyrinthe de Barnes. Un bruit aversif (85 dB) et une lumière vive (200 W) projetée sur la plateforme ont été utilisés pour encourager les souris à trouver cette boîte. Après un entraînement de 4 jours, leur mémoire de référence a été testée le jour 5 et le jour 12. Aucun test n'a été effectué pendant la période. du jour 5 au jour 12. La latence pour entrer dans la zone cible au cours de chaque essai a été enregistrée par un système de suivi vidéo ANYMaze (SD Instruments).

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