L'acide aristolochique induit une fibrose rénale et une sénescence chez la souris
Mar 23, 2022
Résumé:Le rein est l'un des organes les plus sensibles aux déficiences liées à l'âge. Généralement, le vieillissement rénal s'accompagne d'une fibrose rénale, qui est la dernière voie commune de la maladie chronique.maladies rénales. L'acide aristolochique (AA), un agent néphrotoxique, provoque une néphropathie AA (AAN), caractérisée par une fibrose rénale progressive et un déclin fonctionnel. Bien que la fibrose rénale soit associée au vieillissement rénal, on ne sait pas si l'AA induit le vieillissement rénal. Le but de la présente étude est d'étudier l'utilisation potentielle de l'AAN comme modèle de vieillissement rénal. Ici, nous avons examiné les facteurs liés à la sénescence dans les modèles AAN en administrant de manière chronique des AA à des souris C57BL/6. Comparativement aux témoins, le groupe AA a démontré un vieillissementun reinphénotypes, tels que l'atrophie rénale, le déclin fonctionnel rénal et la fibrose tubulo-interstitielle. De plus, les AA ont favorisé la sénescence cellulaire spécifiquement dans lereinset augmentation de l'expression rénale de l'ARNm de p16 et de l'activité de la -galactosidase associée à la sénescence. En outre, les souris traitées à l'AA présentaient des anomalies mitochondriales tubulaires proximales, ainsi qu'une accumulation d'espèces réactives de l'oxygène. Klotho, un gène anti-âge, a également été significativement diminué dans lereinsde souris traitées aux AA. Collectivement, les résultats de la présente étude indiquent que l'AA modifie les facteurs liés à la sénescence et que la fibrose rénale est étroitement liée au vieillissement rénal.
Mots clés:maladie rénale chronique; fibrose rénale; l'acide aristolochique; vieillissement; sénescence cellulaire
CISTANCHE AMÉLIORERA LES MALADIES RÉNALES/RÉNALES
IntroductionAvec l'allongement continu de la durée de vie des humains, de plus en plus de personnes souffrent de déficiences liées à l'âge.Reinssont généralement affectés par des lésions tissulaires liées à l'âge et l'incidence demaladie du reinaugmente avec l'âge [1]. Le vieillissement rénal accélère le vieillissement global, ce qui se traduit par une durée de vie plus courte. Par conséquent, la recherche sur le vieillissement rénal est nécessaire, bien que des modèles animaux appropriés n'aient pas été entièrement développés. Le vieillissement rénal s'accompagne de diverses modifications pathologiques, dont l'atrophie rénale, la glomérulosclérose et la fibrose tubulo-interstitielle [2]. La fibrose tubulo-interstitielle rénale est la dernière voie commune dans la plupart des formes d'insuffisance rénale progressive, ce qui suggère que la fibrose rénale est étroitement associée aux personnes âgées.un rein. Dans la recherche sur le vieillissement, les souris sont un outil fiable en raison de leur proximité génétique avec les humains, de leur capacité à manipuler génétiquement leur génome et du fait qu'elles présentent des phénotypes liés au vieillissement similaires à ceux des humains au cours de leur vie [3]. Les observations longitudinales utilisant des souris consanguines sont idéales comme modèle de vieillissement, bien qu'il soit long de suivre les souris pendant toute leur durée de vie. De plus, il existe plusieurs modèles de vieillissement de souris génétiquement modifiées. La souris déficiente en klotho est un modèle de vieillissement prématuré utilisé dans la recherche sur le vieillissement. Cependant, dans ce modèle, la fonction rénale n'est pas affectée et plusieurs organes autres que les reins sont altérés [4]. Ainsi, ce modèle de souris peut être inapproprié pour la recherche sur le vieillissement rénal.L'administration d'acide aristolochique (AA) provoque un type spécifique de lésion rénale connue sous le nom de néphropathie AA (AAN), qui se caractérise par une fibrose interstitielle étendue [5,6]. L'AA est toxique pour l'épithélium tubulaire rénal car il favorise la formation d'adduits à l'ADN dans les tissus rénaux [7]. Il est peu probable que l'AA affecte les organes autres que le système urinaire et peut être utile pour l'évaluation deun rein-modifications spécifiques. Par conséquent, l'AA est couramment utilisé pour établir des modèles de fibrose rénale chez la souris [8,9]. Cependant, il n'est pas clair si les altérations induites par les AA sont liées au vieillissement de la population.reins. Dans cette étude, nous avons examiné les phénotypes liés à l'âge et les facteurs moléculaires de l'AAN chez la souris
Résultats 2.1. L'administration d'AA a induit une perte de poids importante, une atrophie rénale et un déclin de la fonction rénaleLe poids corporel (BW) et la tension artérielle systolique (BP) de base étaient identiques entre les groupes véhicule-témoin et AA. Le poids corporel dans le groupe de contrôle du véhicule a augmenté de manière constante sur 8 semaines. Cependant, le gain de poids a été inhibé par l'administration d'AA, et le groupe AA avait un poids corporel significativement inférieur à 4 et 8 semaines après le début de l'administration d'AA (figure 1A). Il n'y avait pas de différence significative dans la pression artérielle systolique ou la fréquence cardiaque entre les groupes véhicule-témoin et AA (Figure 1B, C). Le rapport poids du cœur/PC n'a montré aucune différence entre les groupes à 8 semaines après le début de l'administration de l'AA (Figure 1D), alors que leun reinLe rapport poids/PC était significativement plus faible dans le groupe AA 8 semaines après le début de l'administration des AA (Figure 1E). Nous avons ensuite examiné la fonction rénale dans les groupes véhicule-témoin et AA. Les concentrations plasmatiques de créatinine et d'azote uréique (UN) étaient significativement plus élevées dans le groupe AA que dans le groupe témoin véhicule 8 semaines après le début de l'administration d'AA. De plus, le traitement aux AA a réduit de manière significative la clairance de la créatinine par rapport au groupe témoin du véhicule 8 semaines après le début de l'administration des AA (Figure 1F – H).
2.2. L'administration d'AA a induit une fibrose tubulo-interstitielle manifeste et une régulation à la hausse significative de l'expression des gènes liés à la fibrose dans les reinsL'examen histologique à l'aide d'une coloration périodique à l'acide Schiff (PAS) a révélé que la zone glomérulaire était significativement réduite dans le groupe AA par rapport au groupe témoin du véhicule (figure 2A). Une fibrose tubulo-interstitielle étendue, évaluée à l'aide de la coloration au trichrome de Masson (MT), a été observée dans le groupe AA (figure 2B), ainsi qu'une régulation à la hausse des niveaux d'ARNm des gènes liés à la fibrose rénale, des collagènes I et III et du facteur de croissance transformant ( TGF)- (Figure 2C–E).
2.3.L'administration d'AA a accéléré la sénescence cellulaire, le dysfonctionnement mitochondrial et l'accumulation d'espèces de réaction Oxy/gen (ROS) dans les reinsPour évaluer la sénescence cellulaire, nous avons examiné l'expression rénale de l'ARNm de p53, p21, p16 et de la glutaminase (GLS). Le groupe AA a démontré des niveaux d'ARNm significativement plus élevés de ces gènes liés à la sénescence dans lereins(Figure 3A-D). De plus, l'intensité de la coloration à la -galactosidase (SA- -}gal) associée à la sénescence dans lereinsa été augmentée dans le groupe AA et presque absente dans le groupe témoin véhicule (Figure 3E). Dans le groupe AA, la microscopie électronique a révélé la disparition des crêtes mitochondriales, la fragmentation mitochondriale, la vacuolisation cytoplasmique et les autolysosomes dans les cellules tubulaires proximales, concomitantes à la régulation à la baisse de BCL2/adenovirus E1B 19-kDa interagissant avec la protéine 3(Bnip3), un gène lié aux mitochondries (Figure 3FG). Expression rénale de l'ARNm de Nox2. un composant de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase, a été significativement augmenté dans le groupe AA par rapport au groupe témoin véhicule (figure 3H). De plus, l'analyse par Western blot a révélé que le niveau rénal 4-hydroxy-2-nominal(4-HNE) était significativement augmenté dans le groupe AA (Figure 3I). Ces résultats ont indiqué que l'administration d'AA induisait une sénescence cellulaire, un dysfonctionnement mitochondrial et une accumulation de ROS dans lereins.
2.4. AA réduit l'expression de la protéine Klotho rénaleNous avons examiné l'expression rénale des protéines anti-âge dans les groupes véhicule-contrôle et AA. L'expression de Klotho a été significativement réduite dans le groupe AA par rapport au groupe témoin véhicule (Figure 4A), alors que les expressions rénales de la nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT) et de la sirtuine1 (SIRT1) étaient similaires entre les groupes (Figure 4B,C).
3. DébatÀ notre connaissance, la présente étude est la première à se concentrer sur l'évaluation des altérations de l'AAN associées au vieillissement rénal à l'aide de marqueurs de sénescence, tels que l'activité p16 et SA- -gal. Le traitement aux AA a favorisé l'atrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et le déclin de la fonction rénale, qui s'accompagnaient d'une régulation à la hausse de l'ARNm p16 rénal et de la coloration SA- -gal-positive. En outre, le groupe AA a démontré des caractéristiques des mécanismes liés au vieillissement rénal, telles que des anomalies mitochondriales, un stress oxydatif accru et une régulation négative du gène anti-âge, Klotho. Ensemble, nos observations suggèrent que l'administration chronique d'AA imite partiellement le vieillissement rénal.
La sénescence cellulaire est l'arrêt permanent de la prolifération cellulaire en réponse à divers facteurs de stress, tels que les dommages à l'ADN, et contribue au vieillissement et aux maladies liées au vieillissement. L'expression de p16, un inhibiteur de la kinase cycline-dépendante, est corrélée au vieillissement dans divers organes, dont les reins. La restriction calorique augmente la durée de vie en inhibant l'expression de pl6 [10]. De plus, l'élimination des cellules sénescentes exprimant p16- chez les souris INK-ATTAC via l'injection d'AP20187, un dimérisant de la protéine de liaison FK506- [11], provoque une atténuation des phénotypes du vieillissement rénal, tels que la sclérose glomérulaire et l'insuffisance rénale. déclin fonctionnel. Par conséquent, p16 est l'un des facteurs les plus importants liés au vieillissement. Les cellules sénescentes peuvent être détectées à l'aide de la coloration SA- -gal, qui démontre une activité accrue de -galactosidase à pH 6,0 [12], et est un biomarqueur largement utilisé des cellules sénescentes et âgées. L'expression rénale de l'ARNm de pl16 augmente chez le rat âgéreinset s'accompagne d'une augmentation de l'activité SA- -gal dans l'épithélium rénal [13I. Dans la présente étude, nous avons démontré une augmentation de l'expression rénale de l'ARNm p16 et de la coloration SA- -gal, indiquant que l'AA induit la sénescence rénale. Il a récemment été rapporté que le GLS était essentiel à la survie des cellules sénescentes via une glutaminolyse améliorée et une neutralisation du pH intracellulaire [14]. Il a été démontré que l'inhibition de la glutaminolyse dépendante du GLS chez les souris âgées élimine les cellules sénescentes et améliore le dysfonctionnement des organes liés à l'âge. Dans la présente étude, la régulation à la hausse de l'ARNm du GLS rénal a indiqué une accumulation rénale de cellules sénescentes dans le groupe. Ainsi, l'administration chronique d'AA a provoqué une sénescence cellulaire dans les reins.
CISTANCHE AMÉLIORE LA FONCTION RÉNALE/RÉNALE
En plus de la sénescence cellulaire, le dysfonctionnement mitochondrial est un mécanisme essentiel sous-jacent aux lésions tissulaires liées à l'âge et s'accompagne d'une accumulation de ROS [15,16. Le dysfonctionnement mitochondrial entraîne et maintient la sénescence cellulaire [17]alors que la sénescence cellulaire contribue directement au dysfonctionnement mitochondrial [18]. Bnip3, situé principalement dans la membrane mitochondriale externe, peut jouer un rôle dans la régulation de la mitophagie dans les cellules tubulaires proximales rénales en culture en réponse au stress oxydatif et à l'hypoxie. Chez les souris âgées, la restriction calorique augmente l'autophagie dans les cellules tubulaires, via une régulation positive de Bnip3, et améliore la dégénérescence de la fonction rénale induite par l'âge [19]. Dans la présente étude, la microscopie électronique a révélé les caractéristiques des anomalies mitochondriales qui peuvent être affectées par une expression rénale réduite de Bnip3 ou une sénescence cellulaire. Les mitochondries sont la principale source intracellulaire de ROS. Pour évaluer les effets des anomalies mitochondriales sur les ROS rénaux, nous avons examiné l'accumulation rénale de 4-HINE et démontré l'accumulation de ROS induite par les AA dans lereins.Les NADPH oxydases sont une source majeure de ROS. Au cours de la phase aiguë de l'AAN chez la souris, l'expression rénale de l'ARNm de Nox2 était élevée et la disponibilité de l'oxyde nitrique était réduite, ce qui a entraîné une hypoxie et une ischémie prolongées [20. Chez le rat âgéreins, l'accumulation de ROS s'accompagne d'une expression accrue de Nox2 [21]. Ces résultats suggèrent que l'AA peut induire des phénotypes liés à l'âge via l'accumulation de ROS causée par un dysfonctionnement mitochondrial et une régulation positive des NADPH oxydases.
L'expression du gène rénal Klotho était diminuée dans le groupe AA, alors que l'expression de NAMPT et de SIRTl était similaire entre les groupes. Klotho est un gène anti-âge qui code pour une protéine transmembranaire à passage unique qui agit comme un suppresseur du vieillissement. Le processus de vieillissement chez les souris déficientes en klotho ressemblait à celui des humains, notamment une durée de vie plus courte, l'infertilité, l'artériosclérose, l'atrophie cutanée, l'ostéoporose et l'emphysème [22]. Les souris Klotho mutantes hypomorphes présentaient également un phénotype de vieillissement accéléré, qui a été restauré par ablation de p16 [23]. Étant donné que Klotho est un facteur important du vieillissement, les souris modifiées par le gène Klotho ont été largement utilisées dans la recherche sur le vieillissement. Cependant, les souris modifiées par le gène Klotho peuvent être inappropriées pour la recherche sur le vieillissement rénal en raison des déficiences systémiques associées au vieillissement de ces souris et du fait que la fonction rénale n'est pas attestée (c'est-à-dire les niveaux de créatinine). En revanche, le modèle de souris AAN peut être utilisé comme modèle de vieillissement rénal induit par les médicaments à des fins de recherche, car il présente plusieurs avantages, tels que la facilité relative de mise en œuvre et la capacité d'estimer les effets des interventions sur le déclin fonctionnel rénal. .
La présente étude présentait certaines limites. Nous avons évalué le vieillissement rénal, en nous concentrant principalement sur la sénescence cellulaire, la morphologie mitochondriale et l'expression des gènes liés au vieillissement. Cependant, les mécanismes du vieillissement sont complexes et restent mal compris. De plus, bien que l'expression du gène Klotho ait diminué en réponse à l'AA, nous n'avons pas pu démontrer de relation causale avec les modifications pathologiques de l'AAN. D'autres études sont nécessaires pour déterminer les rôles des différentes molécules impliquées dans le développement de l'AAN. Néanmoins, la présente étude fournit de nouvelles informations sur l'utilisation d'Avan comme modèle de vieillissement rénal. Il est important de noter que les changements phénotypiquesun reinsont fortement associés à la durée de vie. Bien que leun reinest facilement affecté par les changements associés au vieillissement, l'inhibition du vieillissement rénal peut allonger la durée de vie globale. Par conséquent, d'autres recherches sur le vieillissement rénal à l'aide de modèles d'AAN pourraient conduire à une longévité accrue à l'avenir.
4. Matériels et méthodes4.1. AnimauxCette étude a été menée conformément aux directives des National Institutes of Health pour l'utilisation d'animaux de laboratoire. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité d'études animales de l'université de la ville de Yokohama (numéro d'approbation : FA20-027) et ont été menées conformément aux directives ARRIVE. Des efforts ont été faits pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et leurs souffrances. Les souris étaient hébergées dans un environnement contrôlé sous un cycle 12-h de lumière/12-h d'obscurité à une température de 25 °C. Les souris avaient libre accès à la nourriture et à l'eau.
CISTANCHE AMÉLIORE L'INFECTION RÉNALE/RÉNALE
Des souris mâles C57BL/6 âgées de huit semaines ont été achetées auprès des Charles River Laboratories (Wilmington, MA, États-Unis) et assignées au véhicule-témoin ou aux groupes AA après 1 semaine d'acclimatation, les souris ont reçu par voie intrapéritonéale du véhicule ou de l'AA (Sigma -Aldrich, St.Louis, MO, USA), qui a été dissous dans une petite quantité de diméthylsulfoxyde. Avant la présente étude, nous avons mené une étude préliminaire en utilisant plusieurs protocoles. Le premier protocole comprenait l'administration d'AA (3 mg/kg) à des souris C57BL/6 par voie intrapéritonéale deux fois par semaine pendant 4 semaines sans temps de remodelage ; dans ce protocole, l'AA a provoqué des lésions rénales aiguës manifestes, telles que des tubules proximaux dilatés avec perte de bordure en brosse (Figure supplémentaire S1). Dans le second protocole, des souris C57BL/6 ont reçu de l'AA (2,5 mg/kg) par voie intrapéritonéale une fois par semaine pendant 4 semaines suivi d'un temps de remodelage pendant 4 semaines ; la créatinine plasmatique chez ces souris était 0.19 ± {{20}}.080 mg/dL contre 0,18 ± 0,010 mg/dL (véhicule témoin contre AA, respectivement ; moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM), p=0.86, test t de Student non apparié, n=4 par groupe) et le plasma UN était de 31,3 ± 5,95 mg/dL contre 30,4 ± 3,87 mg/dL (véhicule-témoin versus AA, respectivement ; moyenne ± SEM, p=0.90, test t de Student non apparié, n=4 par groupe). Par conséquent, nous avons déterminé que ce protocole n'était pas adapté à un modèle de lésion rénale car l'AA n'induisait pas de déclin fonctionnel rénal significatif. Dans le troisième protocole, des souris C57BL/6 ont reçu de l'AA (3 mg/kg) par voie intrapéritonéale deux fois par semaine pendant 10 semaines sans temps de remodelage ; chez ces souris, le taux de mortalité dans le groupe AA était de 83 % (n=6), alors qu'aucune des souris du groupe témoin-véhicule n'est décédée (n=4). Dans ce protocole, nous n'avons pas pu évaluer statistiquement le phénotype rénal induit par l'AA en raison de la mortalité élevée. Dans le quatrième protocole, des souris C57BL/6 ont reçu de l'AA (3 mg/kg) par voie intrapéritonéale deux fois par semaine pendant 4 semaines, suivi d'un temps de remodelage pendant 4 semaines ; des lésions rénales chroniques, telles que la fibrose tubulo-interstitielle, et un déclin de la fonction rénale ont été observés chez ces souris [9]. Par conséquent, sur la base des résultats de ces enquêtes préliminaires, nous avons adopté le quatrième protocole pour réaliser les expériences de la présente étude.
4.2.Mesure de la PALa pression artérielle systolique et la fréquence cardiaque ont été mesurées à l'aide de la méthode du brassard de queue décrite précédemment (BP-Monitor MK-2000 ; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Japon) [24,25]. Toutes les mesures ont été effectuées entre 9 :00 et 14 :00. Au moins 10 mesures ont été effectuées sur chaque souris et la valeur moyenne a été utilisée pour l'analyse.
4.3. Analyse PCR de transcription inverse quantitative en temps réel L'ARN total a été extrait des tissus rénaux à l'aide d'ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japon) et l'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé à l'aide du système SuperScript IⅢFirst-Strand (Invitrogen, Waltham, MA, États-Unis). L'analyse quantitative en temps réel par PCR de transcription inverse a été réalisée à l'aide du système de détection PCR en temps réel CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), et les produits de transcription inverse ont été incubés avec TaqMan PCR Master Mix et un TaqMan personnalisé. sonde (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), comme décrit précédemment [26]. Des sondes TaqMan contre les gènes suivants ont été utilisées : collagène I(Mm00801666_g1), collagène II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) et Nox2 (Mm00627011_m1).Les niveaux d'ARNm ont été normalisés à ceux de ARN ribosomique 18S.
4.4. Analyse Western Blot L'expression des protéines a été analysée par analyse Western blot des homogénats de tissus en utilisant une méthode décrite précédemment [27, 28]. Des extraits protéiques totaux ont été préparés à partir des tissus en utilisant un tampon d'échantillon contenant du dodécylsulfate de sodium. La concentration en protéines de chaque échantillon a été mesurée à l'aide du kit d'analyse de protéines compatible avec les détergents (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, États-Unis) et du NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis), avec de l'albumine de sérum bovin comme la norme. Des quantités égales d'extraits de protéines des échantillons de tissus ont été fractionnées sur des gels de polyacrylamide 5-20 % (ATTO Corp., Tokyo, Japon). Les protéines séparées ont ensuite été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène à l'aide du système de transfert semi-sec (ATTO Corp., Tokyo, Japon). Les membranes ont été bloquées pendant 1 h à température ambiante avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 5 % de poudre de lait écrémé. Les membranes ont été incubées avec des anticorps primaires contre Klotho (ab181373 1 :1000 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), NAMPT(sc-67020 1 :5000 ; Abcam), SIRT1(07-131 1 :1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, États-Unis), 4-HINE(MHN-100P 1:1000 ; JaICA, Fukuroi, Japon) et la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (2118, 1:2000 ; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, États-Unis). Les membranes ont été lavées et incubées avec des anticorps secondaires pendant 60 min à température ambiante. Les sites de réactions anticorps-antigène ont été visualisés à l'aide d'un substrat de chimiluminescence amélioré (Merck, Kenilworth, NJ, USA). GAPDH a été utilisé comme contrôle de chargement. Les images ont été analysées quantitativement à l'aide du ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
4.5. Analyse histologique a été réalisée comme décrit précédemment [29]. Des tissus rénaux de souris ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %, puis inclus dans de la paraffine. Des coupes (4 um d'épaisseur) ont été colorées avec des colorants PAS et MT. Pour évaluer la zone glomérulaire, 50 glomérules par souris ont été mesurés et moyennés. Toutes les images ont été acquises à l'aide du microscope BZ-9000 (Keyence Corp., Osaka, Japon).
CISTANCHE AMÉLIORERA LA DIALYSE RÉNALE/RÉNALE
4.6. Coloration SA- -ale Les tissus rénaux de souris ont été rapidement congelés et montés dans un composé à température de coupe optimale (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokyo, Japon). Des sections (4 μm d'épaisseur) ont été préparées à l'aide d'un cryostat (HM550-VPD ; Thermo Fisher Scientific) et montées sur des lames de verre. L'activité SA- -gal a été mesurée à l'aide d'un kit de détection de sénescence (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA) selon les protocoles du fabricant. Les échantillons ont été visualisés sous fond clair à un grossissement ×100 à l'aide du microscope BZ-9000(Keyence Corp.. 4.7.Electron MicroscopyL'analyse par microscopie électronique a été effectuée comme décrit précédemment [30]. Les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane et perfusées à travers l'arc aortique droit avec du sérum physiologique hépariné (5 U/mL) et du glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon phosphate à 0,1 mol/L à pH 7,4. Les échantillons pour la microscopie électronique à transmission ont été immergés dans du tétroxyde d'osmium à 1 % pendant 2 h, déshydratés en série dans de l'éthanol et incorporés dans un mélange Epon. Les coupes UlItrathin ont été colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb et examinées à l'aide du microscope électronique à transmission Hitachi H-7500 fonctionnant à 80 kV (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japon). Les sections ont été observées à un grossissement × 5000 et photographiées à l'aide d'un appareil photo à couplage de charge.
4.8.Analyse biochimiqueDes échantillons de sang ont été prélevés par ponction cardiaque à l'état nourri. Les échantillons de sang total ont été centrifugés à 3 000 tr/min (MR-150 ; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Japon) pendant 10 minutes à 4 degrés pour séparer le plasma. Les échantillons de plasma résultants ont été stockés à -80 degré . Les niveaux de créatinine plasmatique, UN et urinaire ont été mesurés à l'aide de l'autoanalyseur Hitachi 7180 (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japon).
4.9. Analyses statistiques Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Le test f de Student non apparié a été utilisé pour comparer les différences entre les groupes véhicule-témoin et AA.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. ConclusionsL'administration d'AA provoqueun reinsénescence, accompagnée de fibrose tubulo-interstitielle et d'atrophie rénale. Les résultats suggèrent que la fibrose rénale est étroitement liée au vieillissement rénal et que l'AAN peut être utile commeun rein- modèle de vieillissement spécifique.