Effets bénéfiques de la fraction totale de phényléthanoïde glycoside isolée de Cistanche Deserticola sur la microstructure osseuse chez les rats ovariectomisés

1. Introduction

L'ostéoporose postménopausique, dont souffrira 1 femme sur 3 de plus de 50 ans, est en train de devenir un risque majeur pour la santé touchant plus de 200 millions de femmes dans le monde [1]. À la ménopause, la forte baisse du taux d'œstrogènes entraîne généralement une résorption osseuse excessive provoquée par une ostéoclastogenèse accrue ; alors, l’équilibre entre la formation osseuse induite par les ostéoblastes et la résorption osseuse induite par les ostéoblastes est perturbé, et la résorption osseuse induite par les ostéoblastes est perturbée.la résorption osseuseont finalement provoqué de l'ostéoporose et même des fractures de la hanche ou de la colonne vertébrale [2]. On pensait que la différenciation de l'ostéoclaste était déclenchée lorsque l'activateur du récepteur du facteur nucléaire kappa B (RANK) se liait au RANKL, le ligand du RANK. Cependant, la combinaison de RANK à RANKL ne peut être activée que si le facteur 6 associé au récepteur du facteur de nécrose tumorale (TRAF6) y est associé [3], suivi de la stimulation des voies de signalisation en aval, notamment PI3K/AKT et NF-κB. Enfin, les expressions du facteur nucléaire des cellules T activées c2 (NFAT2) et c-Fos ont été régulées [4] pour moduler la différenciation de l'ostéoclaste ainsi que la résorption osseuse. Ainsi, les facteurs et régulateurs directement ou indirectement liés à l’activation et à la différenciation des ostéoclastes étaient considérés comme des cibles cruciales pour prévenir la perte osseuse. Il existe en effet certains médicaments d’hormonothérapie substitutive clinique et synthétique, comme le valérate d’estradiol, qui sont efficaces dans le traitement de l’ostéoporose postménopausique. Malheureusement, certains d’entre eux augmentent le risque de cancers graves, notamment les cancers du sein et de l’endomètre [5], ce qui limite leurs applications cliniques. Par conséquent, il est nécessaire de sélectionner d’autres alternatives présentant à la fois une efficacité et des effets secondaires minimes. Les médecines traditionnelles chinoises (MTC), ainsi que les composés et fractions bioactifs isolés [6–9], se sont révélés efficaces dans diverses affections, notamment l'ostéoporose postménopausique. Parmi ces composants et fractions bioactifs, les composés phényléthanoïdes glycosides (PhG) potentiellement efficaces étaient considérés comme des agents prometteurs pour le traitement de l'ostéoporose (10-12). Les structures des PhG sont constituées d'aglycone d'acide cinnamique, un groupe hydroxyle phényléthyle qui est combiné avec -glucopyranose, apiose, galactose, rhamnose ou xylose via une liaison glycosidique. Ils existent largement chez les espèces médicinales du genre Cistanche [13]. Cistanche deserticola YC Ma est un MTC officiel enregistré dans la pharmacopée chinoise, et en plus d'être un MTC important [14], C.deserticola est également une plante tonique anti-âge avec peu d'effets secondaires qui a été développée en liqueur médicinale et liquide nutritionnel approuvé par l'Administration nationale des aliments et des médicaments. D'après les archives de la pharmacopée chinoise, C. deserticola était traditionnellement utilisée par les autochtones pour traiter les problèmes de carence en essence rénale tels que la débilité musculaire et la faiblesse lombaire, ainsi que les composés de glycosides phényléthanoïdes, notammentéchinacosideet l'actéoside sont les principaux constituants bioactifs de cette plante. Selon la théorie MTC du « rein-gouvernement-os », le système osseux est régi par l’essence rénale [15], et les troubles liés aux os comme l’ostéoporose pourraient être guéris par des herbes ou des composés possédant l’activité de nourrir l’essence rénale. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que la fraction totale de glycosides phényléthanoïdes isolée de C. deserticola, au moins en partie, était bénéfique dans le traitement de l’ostéoporose. L'expérience actuelle a donc été conçue pour valider notre hypothèse en utilisant un modèle de rat ovariectomisé (OVX) ; outre les marqueurs de résorption et de formation osseuses qui doivent être estimés, l'indice d'antioxydation ainsi que les voies de signalisation PI3K/AKT et NF-κB induites par RANKL/RANK/TRAF6- ont également été utilisés pour étudier les principaux mécanismes de la bioactivité antiostéoporotique. .

2. Matériels et méthode

2.1. Matériel végétal et préparation.

Un total de 30 kg de tiges de Cistanche deserticola YC Ma ont été collectés dans le comté de Yongning le 2015 septembre avec les coordonnées 106.026597 et 38.262816, Province du Ningxia, Chine. L'herbe a été identifiée par le Dr Lin Dong (Département de Pharmacognosie, Université Médicale de Ningxia) et un spécimen correspondant (#20150901) a été conservé dans le Département de Analyse pharmaceutique. Tout d'abord, 30,0 kg de C. deserticola en poudre ont été extraits en utilisant la méthode de reflux avec 70 % d'éthanol comme solvant ; le rapport matériau/solvant a été fixé à 1 : 10 et le temps de reflux était de 2 h 3 fois. Ensuite, tous les filtrats ont été combinés et condensés sous pression réduite à 60 degrés C. Deuxièmement, des colonnes de résine macroporeuse AB-8 ont été utilisées pour la séparation préliminaire, et différents ratios d'éthanol dans l'eau (0 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % et 60 %, chacun 60 L) ont été utilisés pour l'élution. Troisièmement, les éluants à 40 % et 50 % ont été combinés et purifiés davantage en utilisant des colonnes répétées de résine macroporeuse AB-8 avec les éluants de 0 %, 20 %, 30 %, 40 % et 50 % d'éthanol dans l'eau, et chaque éluant était de 12 L. Enfin, la fraction à 40 % a été collectée et condensée sous pression réduite pour obtenir 150 g de fraction glycoside phényléthanoïde de sédiment jaune pâle de C. deserticola (CDP, le rendement était de 0,5 %). Pour les expériences in vivo, un solvant CMC-Na à 0, 5% a été utilisé pour dissoudre le CDP; L'administration orale aux animaux a été fixée à 1 ml/100 g de poids corporel ; pour l'analyse par Western blot in vitro, le CDP a été dissous avec du DMSO puis dilué avec du DMEM pour obtenir les concentrations finales de 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL et 0,001 mg/mL. 

Extrait NATUREL DE CISTANCHE POUR LA CROISSANCE OSSEUSEPHENYLETHANOIDE GLYCOSIDES 75% ECHINACOSIDE 30% ACTEOSIDE 12%

2.2. Produits chimiques et solvants.

Le valérate d'estradiol (EV) provenait de Delpharm Lille SAS, France ; kits ELISA de réticulation de phosphatase alcaline (ALP), de protéine gla osseuse (BGP), de phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et de désoxypyridinoline (DPD) de Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Chine, 201605 ; kits de réactifs malondialdéhyde (MDA, 20181221), super oxyde dismutase (SOD, 20121218) et glutathion (GSH, 20181221) de l'Institut de génie biologique de Nanjing Jiancheng, Nanjing, Chine ; Kits ELISA de réticulation parathormone intacte (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonine (2L9ISN7AIU) et récepteur alpha lié aux œstrogènes (ERR, Y3AY8QEWB3) d'Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Chine ; kit de réactifs cathepsine K ELISA de BioVision, Amérique, 1l300141; anticorps primaires de RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 kinase p85 alpha (AC09021266) , AKT 1 (AF05173234), -actine (17AV0411) et anticorps secondaires d'IgG de chèvre anti-lapin conjuguées à la peroxydase de raifort de ZSGB-BIO, Chine, 136080 ; le kit de dosage des protéines BCA totales et le kit commercial pour la détection de la formation d'ostéoclastes et du sérum fœtal bovin et du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) de HyClone, Logan, UT, USA ; membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) de Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA ; pénicilline et streptomycine de Gibco, Rockville, MD, États-Unis. Tous les autres agents chimiques utilisés étaient de qualité AR.

2.3. Quantification HPLC du CDP.

Un instrument HPLC Agilent 1220 a été utilisé pour identifier et quantifier la composition du CDP. Les conditions de chromatographie étaient les suivantes : colonne C18 (TSK-GEL, 4,6.id × 250 mm, 5 µm) ; l'élution par gradient contenait les solvants A (acétonitrile) et B (eau contenant 0,5 % d'acide acétique) (0-10 min : 17-20 % A ; 10-30 min : 20-25 % A ; et 30-40 minutes : 25-30 % A ); la longueur d'onde de détection était de 333 nm ; température ambiante; le débit était de 1,0 ml/min ; le volume d’injection de l’échantillon était de 5 μL. Huit composés PhG, à savoir le cistanoside F, l'échinacoside, le 6′-acétylactéoside, le cistanoside C, le cistanoside A, l'acteoside, le 2′-acétylactéoside et l'isoacteoside, ont été identifiés ; en utilisant les substances de référence correspondantes et une méthode standard externe, le contenu des 8 PhG ci-dessus a été quantifié par analyse HPLC (Figure 1).

Figure 1 : Empreinte digitale HPLC du CDP. Huit composés glycosides phényléthanoïdes ont été trouvés dans cette fraction et la teneur totale a été quantifiée à 5 0,7 %. Les composés et leur contenu étaient les suivants : (1) acteoside F (3,6 %), (2) échinacoside (8,8 %), (3) cistanoside A (5,0 %), (4) acteoside (13,3 %), (5) isoacteoside (3,3 %), (6) acteoside C (3,6 %), (7) 2′-acétylactéoside (9,9 %) et (8) 6′-acétylactéoside (3,2 %).

2.4. Protocole expérimental sur les animaux.

Un total de 6 0 rats Sprague-Dawley adultes femelles âgés de 3 mois ont été sélectionnés par le centre d'expérimentation animale de l'Université médicale de Ningxia, avec un poids corporel initial moyen d'environ 234 ± 25 g. Les rats ont été hébergés dans un environnement spécifique standard exempt d’agents pathogènes pour s’acclimater pendant 1 semaine. Ensuite, tous les rats ont été anesthésiés (hydrate de chloral, 100 mg/kg, ip) uniquement ou ovariectomisés de manière simulée (SHAM), ou deux ovaires ont été retirés puis divisés au hasard en 5 sous-groupes : traités par voie orale avec un véhicule (0,5 % de CMC- Na) a été défini comme groupe modèle (OVX), le valérate d'estradiol (1 mg/kg/jour) comme groupe positif (EV) et 60, 120 et 240 mg/kg/jour de CDP comme faible (CDPL), groupes de dosage modéré (CDPM) et élevé (CDPH), respectivement. Tous les rats ont reçu une administration orale quotidienne pendant 3 mois, la posologie étant ajustée toutes les 2 semaines en fonction de l'évolution du poids corporel total. Le dernier jour de l'expérimentation animale, 24-heures d'urine ont été obtenues en utilisant des cages métaboliques ; le sérum a été collecté dans l'artère fémorale de rats anesthésiés ; le fémur droit, le tibia et tous les organes ont été disséqués et conservés à -80 degré C pour une analyse plus approfondie. Les expériences sur les animaux que nous avons menées ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'université médicale de Ningxia.

2.5. Détermination de la densité minérale osseuse et analyse micro-CT.

Tout d’abord, un appareil d’absorptiométrie à rayons X à double énergie (Lunar, USA) a été utilisé pour estimer la densité minérale osseuse totale du fémur droit de chaque rat ; Deuxièmement, le même fémur a été utilisé pour estimer l'image 3D de la microarchitecture de l'os trabéculaire en utilisant un appareil de scanner micro-CT (GE, America). La résolution isotrope a été fixée à 14 µm pour obtenir une image 3D idéale ; la région d'intérêt (ROI) a été choisie en définissant les mêmes coordonnées dans le cartilage de croissance du fémur de chaque échantillon ; et les paramètres morphométriques osseux, notamment la séparation trabéculaire (Tb.Sp), le nombre trabéculaire (Tb.N), l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th), la teneur en minéraux osseux (BMC), la densité minérale tissulaire (TMD) et la teneur en minéraux tissulaires (TMC). ) ont été obtenus en analysant le ROI.

Figure 2 : Effets de l'OVX et de 12 semaines de traitement par CDP ou EV sur la densité minérale osseuse totale dans le fémur droit de rats qui sont évalués à l'aide d'absorptiométrie à rayons X à double énergie (n=10/groupe). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart-type ; ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 et ∗∗∗p < 0 001 par rapport au groupe OVX ; ###p < 0 001 contre le groupe SHAM.

Figure 3 : Images micro-CT scan de la microarchitecture du fémur droit de rats traités au CDP ; les photographies présentées étaient représentatives de 4 rats différents dans chaque groupe : (A) groupe OVX ; (B) groupe SHAM ; (C) groupe VÉ ; (D) Groupe CDPH ; (E) Groupe CDPM ; (F) Groupe CDPL. Les paramètres mesurés comprennentteneur en minéraux osseux(BMC), la teneur en minéraux tissulaires (TMC), la densité minérale tissulaire (TMD), la séparation trabéculaire (Tb.Sp), le nombre trabéculaire (Tb.N) et l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th). Les rats OVX ont exprimé une réduction notable de la zone de microarchitecture et du nombre trabéculaire. Les rats traités au CDP et les rats traités à l'EV ont partiellement inversé les résultats mentionnés ci-dessus au même degré après 12 semaines de traitement. Toutes les valeurs ont été présentées sous forme de moyenne ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 et ∗∗∗p < 0 001 par rapport au groupe OVX ; ###p < 0 001 contre le groupe SHAM.

Figure 4 : Effets de l'OVX et de 12 semaines de traitement par CDP ou EV sur l'urine et le sérum Ca et P ainsi que la PTH et la calcitonine des rats (n=10/groupe). Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 et ∗∗∗p < 0 001 par rapport au groupe OVX ; # p < 0 05, ##p < 0 01 et ###p < 0 001 par rapport au groupe SHAM.

2.6. Dosage biochimique du sérum et de l'urine.

Les activités de la cathepsine K sérique, du TRAP, de la SOD et du GSH, ainsi que les teneurs en PTH sérique, calcitonine, ERR, MDA, BGP et DPD urinaire, ont été déterminées en utilisant des kits de réactifs correspondants conformément aux instructions du fabricant, et le le niveau de phosphatase alcaline (ALP) et les teneurs en calcium (Ca) et en phosphore (P) sériques et urinaires ont été estimés à l'aide d'un appareil automatique (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA).

2.7. Analyse par Western Blot.

Les ostéoclastes ont été induits en utilisant des cellules RAW 264.7 additionnées de facteur de stimulation des colonies de macrophages (MCSF) et de RANKL. En bref, 1 × 107 cellules RAW 264,7 ont été cultivées dans une plaque à 6-puits en présence de 30 ng/mL de MCSF et 25 ng/mL de RANKL. Après 6 jours d'induction, les cellules d'ostéoclastes matures ont été identifiées en utilisant la méthode de coloration TRAP avec le kit correspondant, puis traitées avec du CDP (0,1, 0,01 et 0,001 mg/mL. , respectivement) pendant 24 h ; ensuite, les cellules ont été lysées avec un tampon de lyse contenant 0,5 mmol de fluorure de phénylméthylsulfonyle, des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Le lysat a ensuite été séparé en utilisant 10 % de SDS-PAGE et transféré sur une membrane PVDF, qui a été sondée avec AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos et -actine ( 1 : 400) après blocage avec du lait écrémé à 5% pendant 2 h. Les mêmes membranes ont été retirées et sondées à nouveau avec les 9 anticorps correspondants ci-dessus, respectivement, puis ont été détectées par le logiciel Image Lab à la fin. Les expériences ont été répétées trois fois.

2.8. Analyses statistiques.

Toutes les données obtenues à partir d'expériences in vivo et in vitro, décrites comme moyenne ± écart-type, ont été analysées en utilisant une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett (logiciel SPSS 22.0, SPSS, USA) ; p < 0 05 était statistiquement significatif.

3. Résultats

3.1. Composition chimique du CDP.

En utilisant la méthode HPLC, huitcomposés glycosides phényléthanoïdesont été trouvés dans cette fraction, comme le montre la figure 1. En utilisant des références standards et une méthode standard externe, les composés et leur contenu ont été identifiés et quantifiés comme suit : (1) acteoside F (3,6 %), (2) échinacoside (8,8 %), (3)CistanosideA (5.0%), (4) acteoside (13,3%), (5) isoacteoside (3,3%), (6) acteoside C (3,6%), (7) 2′-acétylactéoside (9,9% ), et (8) 6′-acétylactéoside (3,2 %). La teneur totale de ces huit composants a été quantifiée à 50,7 %.

EXTRAIT NATUREL DE CISTANCHE EN TUBEPOUR LA CROISSANCE OSSEUSEPHENYLETHANOIDE GLYCOSIDES 75% ECHINACOSIDE 30% ACTEOSIDE 12%

3.2. Effets du CDP sur la densité minérale osseuse et la microarchitecture des trabécules.

La densité minérale osseuse totale des rats dans différents sous-groupes est présentée à la figure 2. Une tendance à la baisse de la teneur en densité minérale osseuse a été observée chez les rats du modèle OVX par rapport aux rats du groupe SHAM (p < {{ 1}}). Tous les rats traités au CDP présentaient une densité minérale osseuse significativement accrue de 11,2 %, 12,0 % et 10,7 % (p < 0 01), respectivement, par rapport aux rats du groupe modèle OVX. En outre, conformément aux données de densité minérale osseuse totale, la reconstruction par micro-CT, ainsi que la détermination histomorphométrique du fémur, ont montré que les rats du groupe OVX présentaient une détérioration évidente de l'architecture trabéculaire, comme en témoigne la diminution notable du nombre et de la surface des trabécules. ainsi qu'une Tb.Sp nettement augmentée par rapport aux rats du groupe SHAM. Le traitement par CDP a empêché la détérioration de l'architecture trabéculaire induite par l'OVX ; comme le montre la figure 3, les valeurs de BMC, TMC et Tb.N ont été significativement augmentées et la surface de Tb.Sp a été considérablement réduite, tandis que les valeurs de TMD et de Tb.Th ne semblaient pas affectées de manière significative par l'opération OVX et notre Intervention du CDP.

Figure 5 : Effets de l'OVX et d'un traitement de 12- semaines avec CDP ou EV sur les activités sériques TRAP, cathepsine K, DPD, ALP et BGP des rats OVX (n=10/groupe). Toutes les valeurs ont été présentées sous forme de moyenne ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 et ∗∗∗p < 0 001 par rapport au groupe OVX ; # p < 0 05, ##p < 0 01 et ###p < 0 001 par rapport au groupe SHAM.

3.3. Effets du CDP sur les paramètres biochimiques de l'urine et du sérum.

Comme le montre la figure 4, des tendances à la baisse significatives du taux urinaire de P et de la teneur sérique en calcitonine chez les rats du groupe modèle OVX ont été détectées, ce qui était de près de 30 % et 60 % inférieur à celui des rats SHAM (p < 0 001. ), respectivement, alors qu'aucune tendance évidente à la hausse ou à la baisse des taux urinaires de Ca et de Ca sérique ainsi que de P sérique et de PTH sérique n'a été observée entre les groupes OVX et SHAM. Le traitement par CDP a empêché de manière significative la perte de P et de Ca sériques chez les rats OVX, comme en témoignent les taux sériques de P et de Ca particulièrement régulés positivement (p < 0 05) par rapport aux rats du groupe modèle OVX. De plus, des tendances accrues mais non statistiquement significatives de la calcitonine ont été observées dans les groupes à faible et à forte dose de CDP par rapport au groupe modèle OVX.

Figure 6 : Effets de l'OVX et du traitement de 12- semaines avec CDP ou EV sur l'expression de l'ERR, le poids corporel et le poids utérin et vaginal des rats (n=10/groupe). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 et ∗∗∗p < 0 001 par rapport au groupe OVX ; ###p < 0 001 contre le groupe SHAM.

3.4. Effets du CDP sur les marqueurs de formation osseuse et de résorption osseuse.

Les effets bénéfiques du CDP sur l'indice de formation osseuse ainsi que les influences d'inhibition surla résorption osseuseLes marqueurs ont été décrits dans la figure 5. Concernant les marqueurs de formation osseuse, les niveaux de BGP sérique n'ont presque pas été influencés par la chirurgie ovariectomisée, comme en témoignent les changements non significatifs observés dans tous les groupes traités, alors que des améliorations statistiquement significatives de l'ALP sérique ont été obtenues à la fois dans les basses (6 0 mg/kg) et modérées (120 mg/kg) des groupes d'intervention CDP par rapport aux rats du groupe SHAM (p < 0 01). Concernant l'indice de résorption osseuse, les taux sériques de cathepsine K et DPD, ainsi que de TRAP chez les rats du groupe modèle OVX, ont été significativement augmentés d'environ 75,0 %, 41,4 % et 21,0 %, respectivement, par rapport aux rats SHAM. , et lorsqu'ils sont traités avec du CDP, en particulier à la faible dose de 60 mg/kg, les propriétés de la cathepsine K et de la DPD ainsi que du TRAP dans le groupe modèle OVX ont été notamment inhibées de 67,3 %, 41,4 % et 25,9 %, respectivement, comme par rapport aux rats du groupe modèle OVX.

TUBE NATUREL CISTANCHE POUR LA CROISSANCE OSSEUSEPHENYLETHANOIDE GLYCOSIDES 75% ECHINACOSIDE 30% ACTEOSIDE 12%

3.5. Effets du CDP sur le vagin et l'utérus ainsi que sur le poids corporel entier.

Des différences non significatives dans le poids corporel total initial des rats ont été observées avant le traitement dans six groupes (Figure 6). Cependant, l'opération d'ovariectomisation a entraîné une augmentation significative du poids corporel final des rats du groupe modèle OVX, qui est de près de 36,0 %, alors que les poids humides de l'utérus et du vagin ont considérablement diminué de près de 9{{4}. },0 % et 60,0 %, respectivement, par rapport aux rats SHAM (p < 0 001). Bien que le contenu de l'ERR ne présente aucune différence significative entre les groupes OVX et SHAM, tous les groupes de traitement, y compris CDP et EV, ont augmenté de manière significative le niveau de l'ERR. De plus, lorsqu'ils sont traités avec EV, la prise de poids corporel entier ci-dessus ainsi que la perte de poids vaginal et utérin des rats OVX ont été partiellement inversées (p < 0 001) ​​mais n'ont pas été affectées par l'intervention du CDP.

3.6. Effets du CDP sur les niveaux sériques de MDA, SOD et GSH.

Il n'y avait pas de différence statistiquement significative dans les propriétés de la SOD et du GSH sériques entre les groupes modèles SHAM et OVX ; comme le montre la figure 7, une tendance à la hausse du GSH peut être observée entre les deux groupes ci-dessus. De plus, le niveau de MDA sérique a été fortement augmenté de près de 50 % chez les rats du groupe modèle OVX par rapport aux rats SHAM. L'activité de la SOD n'a pas été influencée par le traitement au CDP, alors que la propriété du GSH a été significativement améliorée par l'intervention du CDP, et le CDP a notamment diminué le niveau de MDA de 33,9 % et 42,4 % aux doses de 60 et 240 mg/kg, respectivement ( p < 0 001).

3.7. Effets du CDP sur les niveaux d'expression des protéines.

Nos données, présentées dans la figure 8, suggèrent que le traitement par CDP diminuait de manière significative les niveaux de protéines de TRAF6, RANK et RANKL par rapport au contrôle. Les voies de signal en aval, y compris NF-κB, ont été supprimées et PI3K/AKT a été stimulée par l'intervention du CDP, comme en témoigne l'expression de la régulation négative de NF-κB-p65, alors que PI3K p85 et AKT1 ont été régulées positivement. Par conséquent, l'expression de NFAT2 a été significativement diminuée et c Fos a augmenté après un traitement avec du CDP à une concentration de 0,001-0,1 mg/mL. Un mécanisme suggéré est décrit dans la figure 9, où le CDP a régulé négativement les niveaux de RANKL et RANK, réduisant ainsi les quantités de liaison de ce ligand avec son récepteur. La connexion de RANKL avec RANK a encore été diminuée par la régulation négative de TRAF6, suivie de la suppression des voies en aval, y compris la voie NF-κB. En revanche, la voie du signal PI3K/AKT a été stimulée, ce qui a finalement conduit à une diminution de l’expression de NFAT2 et à une augmentation du niveau de c-Fos.

4. Discussion

Glycosides phényléthanoïdessont des composants naturels solubles dans l’eau qui existent largement dans le règne des plantes médicinales [11]. Jusqu’à présent, les composés des glycosides phényléthanoïdes ont attiré de plus en plus de chercheurs en raison de leur rôle évident dans le traitement de diverses affections et anomalies humaines [13]. De nombreuses fractions et composés bioactifs antiostéoporotiques, notamment des polyphénols et des glycosides phényléthanoïdes, ont été identifiés et isolés à partir de dizaines d'herbes médicinales naturelles [5, 10, 12, 16, 17].

Figure 8 : Effets de différentes concentrations de CDP sur les expressions protéiques de TRAF6 (a), RANKL (b), RANK (c), PI3K (d), AKT (e), NF- κBIA (f), NFAT2 (g), et c-Fos (h) (n=3/groupe) ; l'expression de la protéine a été normalisée en -actine et les données quantitatives de chaque protéine signal ont été présentées sous forme de pourcentages de la valeur du contrôle. Les données ont été décrites comme la moyenne ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 et ∗∗∗p < 0 001 par rapport au groupe témoin.

C. deserticola est bien connu sous le nom de « ginseng du désert », ce qui implique le profil de sécurité de ce MTC comestible [18, 19]. En tant qu'herbe tonique générale et aliment de santé naturel utilisé depuis longtemps dans les pays asiatiques, C. deserticola a montré une fonction bénéfique pour l'amélioration de la force rénale. Il a été constaté que la MTC, traditionnellement utilisée pour revigorer et conserver l'essence des reins, était généralement utilisée pour traiter l'ostéoporose. Des données publiées in vitro et in vivo ont prouvé l'activité antiostéoporotique de C. deserticola [20–23], et les constituants glycosides phényléthanoïdes, dont l'échinacoside et l'actéoside, sont les principaux composants bioactifs qui existent dans cette plante médicinale comestible ; tout cela suggère que non seulement l'échinacoside et l'actéoside eux-mêmes, mais également d'autres composants glycosides phényléthanoïdes contenus dans C. deserticola, étaient considérés comme responsables des propriétés antiostéoporotiques de cette plante. Dans notre présente étude, une résine macroporeuse de sécurité favorable a été utilisée pour isoler et enrichir la fraction glycoside phényléthanoïde de C. deserticola, et en utilisant la méthode HPLC, huit principaux composants glycosides phényléthanoïdes, à savoir l'acteoside F, l'échinacoside, le cistanoside A, l'actéoside, l'isoacteoside, l'actéoside C, le 2′-acétylactéoside et le 6′-acétylactéoside ont été trouvés dans la fraction isolée de glycoside phényléthanoïde et leurs teneurs étaient de 3,6 %, 8,8 %, 5,0 %, 13,3 %, 3,3 %, 3,6 %, 9,9% et 3,2% respectivement. L'échinacoside, l'un des principaux composés actifs enregistrés chez C. deserticola [14], s'est avéré posséder une activité antiostéoporotique ; cependant, la dose de 270 mg/kg était si élevée qu'elle limitait son application clinique ultérieure [24]. Dans les expériences actuelles, la fraction totale de glycosides phényléthanoïdes avec une dose plus faible de 60-240 mg/kg de poids corporel/jour a été utilisée sur des rats OVX, et le contenu des constituants identifiés était pur à près de 50 % dans cette fraction en utilisant la méthode HPLC.

Il était bien connu qu'OVX pouvait provoquer l'ostéoporose, et un rat OVX était considéré comme un modèle classique et approprié pour simuler l'ostéoporose postménopausique humaine. Dans le même temps, une diminution significative de la densité minérale osseuse, de la microarchitecture osseuse trabéculaire, du poids humide de l'utérus et du vagin et du taux d'œstrogènes, ainsi qu'une amélioration évidente de la résorption osseuse et du poids corporel, ont été observées après une ovariectomie, dont en partie due à la perte d’œstrogènes [25]. Jusqu'à présent, nos données ont clairement démontré qu'OVX induisait effectivement l'ostéoporose postménopausique et s'accompagnait toujours d'une forte baisse de la qualité osseuse, de la microarchitecture osseuse et du poids humide de l'utérus et du vagin. Comme l'EV est un agent hormonal substitutif général qui a été utilisé dans la pratique clinique, il a été utilisé comme contrôle positif dans notre expérience in vivo, et le gain de poids corporel et le poids de l'utérus atrophié ainsi que la détérioration de la densité minérale osseuse et de la microarchitecture osseuse trabéculaire ont été devrait être inversé par la supplémentation en EV. Contrairement au contrôle positif, la diminution du poids du vagin et de l'utérus, ainsi que le gain de poids corporel total des rats du groupe modèle OVX, n'ont pas été affectés par le traitement au CDP, ce qui impliquait que le CDP pouvait améliorer la formation osseuse sans induire d'effets secondaires. sur le corps et les tissus organiques utérins. Bien que les niveaux d’ERR aient été significativement augmentés par le traitement au CDP, c’est comme pour un effet phytoestrogène qu’aucun effet secondaire sur les tissus organiques utérins et vaginaux n’a été observé. De plus, le traitement du CDP a significativement renforcé la qualité des os chez les rats OVX qui avaient été détériorés par la chirurgie d'ovariectomie.

De plus, les niveaux de P et de Ca dans l'urine et le sérum des rats OVX ont également été utilisés pour refléter l'effet antiostéoporotique, et les concentrations de Ca et de P inorganique dépendaient généralement des niveaux de calcitonine et de PTH (26). Dans la présente étude, bien qu'il n'y ait pas de baisse significative ni de tendance à la hausse du niveau d'excrétion urinaire de Ca,

Figure 9 : Mécanisme moléculaire hypothétique : le CDP pourrait prévenir la perte osseuse chez le rat OVX grâce à l'inactivation induite par RANKL/RANK/TRAF6-de NF-κB et à l'activation des voies PI3K/AKT ainsi qu'à la stimulation de c-Fos et à la suppression de NFAT2. , qui sont mis en évidence par la régulation négative des niveaux d'expression de TRAF6, RANKL, RANK, NF-κBIA et NFAT2, alors que c-Fos, AKT et PI3K étaient significativement régulés positivement par le traitement au CDP par rapport au groupe témoin.

Le P sérique, le Ca sérique et la PTH chez les rats du groupe modèle OVX ont été obtenus et des taux urinaires significatifs de P et de calcitonine (p < 0 001) ont été observés. Conformément aux données publiées selon lesquelles une carence en œstrogènes provoquée par une ovariectomie entraînait toujours une diminution du taux de calcitonine dans le sang, cette diminution de la calcitonine sérique conduisait finalement à une augmentation du taux de PTH, le Ca étant considéré comme le principal régulateur de la sécrétion de PTH. Étant donné que la concentration de PTH ne présentait aucune différence significative entre les groupes OVX et SHAM dans la présente étude, le taux de Ca dans le sérum et l'urine ne présentait également aucun changement évident entre les deux groupes ci-dessus. Cependant, une tendance significativement diminuée du niveau de calcitonine entre les groupes OVX et SHAM a été obtenue et, par conséquent, la teneur en P dans l'urine d'OVX a été fortement diminuée. Nous pensons que les données ci-dessus peuvent expliquer le phénomène contradictoire selon lequel l'excrétion urinaire du niveau de Ca chez les rats OVX n'a ​​montré aucun changement évident par rapport aux rats SHAM, et ce phénomène peut également être lié à l'augmentation du taux de remodelage osseux [27]. . Après le traitement par CDP, les niveaux de P et de Ca dans le sérum ont été considérablement augmentés et la teneur en P dans l'urine a été régulée à la baisse chez les rats OVX, ce qui reflète que le CDP pouvait non seulement empêcher l'excrétion d'éléments minéraux osseux, mais également améliorer la teneur sérique de ces rats. éléments, supprimant ainsi indirectement la perte osseuse.

En outre, les marqueurs de formation et de résorption osseuses ainsi que les enzymes antioxydantes, notamment la SOD et le GSH, ont également été utilisés pour expliquer les mécanismes antiostéoporotiques sous-jacents du CDP. Semblable aux données publiées, le niveau d'ALP chez les rats du groupe modèle OVX a présenté une tendance à la hausse non statistiquement significative, ce qui indique un taux accéléré de renouvellement osseux dans l'ostéoporose postménopausique [10]. Cependant, après traitement avec le CDP (60, 120 et 240 mg/kg/jour), la propriété de l'ALP a été significativement améliorée. Il était bien connu que l'OVX provoquait une forte baisse des taux d'œstrogènes, ce qui entraînait généralement une résorption osseuse et un stress oxydatif excessifs [28], comme en témoignent les taux de TRAP, de cathepsine K et de DPD ainsi que de MDA, notamment régulés positivement chez les rats de l'époque. Groupe modèle OVX. Toutefois, ces détériorations ont été en partie améliorées par l’intervention du CDP. De plus, le traitement des rats OVX avec du CDP (60 et 240 mg/kg) a démontré une augmentation significative de l'activité du GSH (p < 0 05). Les résultats ci-dessus impliquaient que le CDP présentait un effet thérapeutique sur l'ostéoporose induite par l'OVX, et ces effets consistaient à la fois en améliorant la formation osseuse et en supprimant la résorption osseuse, ainsi qu'en améliorant le système antioxydant osseux.

L'activation de RANK par son ligand RANKL a stimulé les expressions de NFAT2 et c-Fos via la signalisation PI3K/AKT et NF-κB (29). NF-κB s'est avéré essentiel pour l'ostéoclastogenèse, car la perturbation de NF-κB pourrait conduire à une différenciation altérée des ostéoclastes avec un phénotype ostéoporotique, et NF-κB a régulé positivement c-Fos et a régulé négativement les expressions de NFAT2 au cours de l'ostéoclastogenèse induite par RANKL/RANK/TRAF. Pour estimer l'influence bénéfique du CDP sur l'ostéoclastogenèse médiée par NFAT2 et c-Fos, les niveaux d'expression de RANKL et RANK ont été analysés. Comme prévu, le CDP a inhibé de manière significative NFAT2 et stimulé les niveaux de c-Fos en régulant à la baisse les expressions de RANKL et RANK. Pendant ce temps, RANK lui-même manquait de propriété kinase intrinsèque à moins qu'il ne soit rejoint par TRAF6 pour déclencher la signalisation en aval [3]. Le CDP a également régulé négativement l’expression de TRAF6, ce qui a entraîné une réduction significative des quantités de liaison de RANKL et RANK. Un mécanisme antiostéoporotique hypothétique du CDP chez les rats OVX couvrait les voies de signalisation ci-dessus, et les régulateurs ont été décrits dans la figure 9. De manière concise, le CDP a diminué les niveaux de TRAF6, RANKL et RANK, supprimant ainsi les voies de signalisation en aval, notamment PI3K/AKT et NF-κB qui sont déclenchés par RANKL/RANK, et ont finalement réduit les expressions et les activités des protéines ostéoclastogènes clés NFAT2 et c-Fos. Par conséquent, plusieurs indices de données impliquaient l'effet bénéfique du CDP sur le métabolisme osseux des rats OVX, principalement via les voies PI3K/AKT et NF-κB médiées par RANKL/RANK/TRAF6-.

5. Conclusion

En résumé, les glycosides phényléthanoïdes totaux, isolés de C. deserticola, ont présenté des effets bénéfiques significatifs sur l'ostéoporose postménopausique des rats OVX, et le potentiel thérapeutique pour supprimer la perte osseuse résidait principalement dans la stimulation de la formation osseuse et l'inhibition de la résorption osseuse ainsi que l'amélioration de l'antioxydant osseux. système; les mécanismes peuvent être liés à l'activation de NF-κB induite par RANKL/RANK/TRAF6- et à l'inactivation de PI3K/AKT ainsi qu'à la stimulation de c-Fos et à la suppression de NFAT2, et enfin, la différenciation des ostéoclastes a été inhibée.

TUBE NATUREL CISTANCHE POUR LA CROISSANCE OSSEUSEPHENYLETHANOIDE GLYCOSIDES 75% ECHINACOSIDE 30% ACTEOSIDE 12%