Dihydroflavones benzylées et alcaloïdes dérivés de l'isoquinoline de l'écorce de Diclinanona Calycina (Annonaceae) et leurs cytotoxicités

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Résumé: Diclinanona calycina RE Fries populairement connue sous le nom de "enviro", est une espèce de la famille des Annonacées endémique du Brésil. Dans notre recherche continue de composés bioactifs de plantes amazoniennes Annonaceae, l'écorce de D.calycina a été étudiée par des techniques de chromatographie classiques qui ont donné treize composés (alcaloïdes et flavonoïdes) décrits pour la première fois chez D. calycina ainsi que dans le genre Diclinanona. La structure de ces composés isolés a été établie par une analyse approfondie à l'aide de la spectroscopie RMN 1D/2D en combinaison avec la SM. Les alcaloïdes isolés ont été identifiés comme appartenant aux sous-classes : isoquinoléine simple, thali en ligne (1) ; aporphine, anonaïne (2);oxoaporphine, liriodénine (3); benzyltétrahydroisoquinoléines, (S)-( plus )-réticuline(4); déhydro-oxonorréticuline (3,4-dihydro-7-hydroxy-6-méthoxy-1-isoquinolinyl)(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-méthanone)(5 );( plus )-1S,2R-réticuline Ng-oxyde (6); et ( plus )-1N-oxyde de S,2S-réticuline (7); tétrahydro protoberbérine, coreximine (8); et pavine, bisnorargémonine (9). Tandis que leflavonoïdesappartiennent au groupe benzylédihydroflavones, l'isorhamnétine (10), la dichamanétine (11) et un mélange d'uvarinol (12) et d'isouvarinol (13). Le composé 5 est décrit pour la première fois dans la littérature comme un produit naturel. L'activité cytotoxique des principaux composés isolés a été évaluée contre des lignées cellulaires cancéreuses et non cancéreuses. Parmi les composés testés, les résultats les plus prometteurs ont été trouvés pour les dihydroflavones benzylées dichamanétine (10), et le mélange d'uvarinol (12) et d'isouvarinol (13), qui présentaient une activité cytotoxique modérée contre les composés testés.cellule cancéreuselignes(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). La dichamanétine (11) a montré une activité cytotoxique contre HL-60 et HCT116 avec des valeurs IC50 de 15,78 ug·mL-I(33,70 umol·LI) et 18,99 ug∶mL-（40,56 umol. L-）, tandis que le mélange d'uvarinol（12） et d'isouvarinol (13) a démontré une activité cytotoxique contre HL-60, avec une valeur IC5 de 9,74 ugs.mL-1, et HCT116, avec une IC50 valeur de 17,31 ug. mL-I. Ces activités cytotoxiques peuvent être attribuées à la présence d'un ou plusieurs groupements hydroxy benzyle présents dans ces molécules ainsi qu'à la position dans laquelle ces groupements sont liés. Les activités cytotoxiques de la réticuline, de l'anonaïne et de la liriodénine ont été précédemment établies, la liriodénine étant le composé le plus puissant.

Mots clés: Diclinanona calycina; les alcaloïdes et les dihydroflavones benzylées ; activité cytotoxique

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1. Introduction

Les Annonacées sont une grande famille d'arbres et d'arbustes tropicaux et subtropicaux, comprenant environ 112 genres et 2440 espèces [1]. Plusieurs espèces sont connues pour leurs fruits comestibles et leurs propriétés médicinales ]2]. L'investigation phytochimique précédente avec certaines espèces d'Annonacées a conduit à l'isolement et à la caractérisation de différentes classes de métabolites secondaires, tels que les monoterpènes, diterpènes, triterpènes, lignanes,flavonoïdes, des phénylpropanoïdes dérivés de l'asarone, des acétogénines et principalement des alcaloïdes typiques dérivés de l'isoquinoline [3-7]. Certains de ces métabolites secondaires isolés d'espèces d'Annonaceae ont présenté des activités biologiques importantes, telles que des propriétés anti-inflammatoires et inhibitrices d'uréase [8,9], trypanocides [10,11], leishmanicides [11,12], antipaludiques [4,13] , des actions antimicrobiennes [4,14,15], antioxydantes et antirhumatismales [9,15] et, en particulier, une activité cytotoxique contre différentes lignées cellulaires tumorales humaines [4,6,11,16-21].

Bien que la famille des Annonacées soit considérée comme une famille primitive et bien étudiée, peu d'études phytochimiques et/ou pharmacologiques ont été réalisées avec son espèce[3]. Les études phytochimiques et/ou pharmacologiques ont porté principalement sur les espèces des genres Annona, Asimina et Cananga, en raison de leur grande importance économique, et sur certaines espèces des genres Duguetia, Guatteria et Xylopia[5]. Malgré la forte croissance des 20 dernières années par rapport aux études phytochimiques et pharmacologiques, le nombre d'espèces étudiées est encore très faible par rapport à un grand nombre d'espèces reconnues. Actuellement, selon les bases de données scientifiques Web of Science, Scopus et SciFinder, seulement 15 % environ des espèces d'Annonaceae décrites ont une étude phytochimique et/ou pharmacologique correspondante.

Parmi les espèces peu étudiées figurent celles appartenant au genre Diclinanona Diels. Ce genre appartient à la tribu des Annoneae, de la sous-famille des Annonoideae, et n'est présent qu'en Amérique du Sud tropicale (principalement dans la région amazonienne). C'est un genre composé de seulement trois espèces, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas et Diclinanona tessmannii Diels, qui se produisent sous forme d'arbres [22-24].D.calycina (synonyme Xulopia calycina Diels) est un 8 à Arbre de 30 m de haut, communément appelé "envireira" et "enviro", distribué dans tout le bassin amazonien au Brésil, au Pérou et au Venezuela [23]. D.calycina est superficiellement similaire à Xylopia pour ses fleurs aux pétales allongés et étroits, mais il est différent pour ses monocarpes ligneux, indéhiscents, globuleux et à parois épaisses [23,24].

Des études antérieures avec D. calycina ne rapportent que des études pharmacologiques. La première étude décrit l'étude de l'activité antimicrobienne des extraits méthanoliques, chloroformiques et aqueux contre les micro-organismes Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus et Candida albicans en utilisant la méthode de diffusion sur gel [25]. Le second rapporte l'étude de l'activité antimicrobienne d'extraits organiques (dichlorométhane: méthanol 1: 1) et aqueux contre le micro-organisme Enterococcus faecalis en utilisant le test de bouillon de microdilution (MDBA) et le test de diffusion sur disque (DDA) [26]. Ainsi, dans notre recherche continue de nouveaux produits naturels bioactifs d'Annonaceae de la forêt amazonienne, cette étude visait à étudier les propriétés phytochimiques et pharmacologiques de l'écorce de D.calycina. Dans ce rapport, treize composés (neuf alcaloïdes et quatre benzylésdihydroflavones) ont été isolés et identifiés pour la première fois chez D.calycina, ainsi que dans le genre Diclinanona. En outre, la cytotoxicité des principaux composés a été étudiée contre B16-F10, HepG2, K562 et HL{{ 4}} lignées de cellules tumorales en utilisant le test au bleu Alamar.

2. Résultats et discussion

2.1.Élucidation structurale des composés

Ayant découvert la présence de composés azotés dans l'extrait méthanolique à l'aide du réactif de Dragendorff, celui-ci a été soumis à un traitement acido-basique selon la méthodologie de Costa et al. [12] aboutissant à des fractions alcaloïdes et neutres. Une concentration élevée de composés contenant de l'azote a été observée dans la fraction alcaloïde qui a été soumise à l'analyse chromatographique. Les séparations chromatographiques successives, telles que décrites dans la section Extraction et isolement, ont conduit à l'isolement et à l'identification de treize constituants chimiques (1-13, Figure 1), neuf alcaloïdes dérivés de l'isoquinoléine 1-9 et quatre dihydroflavones benzylées 10-13. Les structures de ces composés isolés (Figure 1) ont été établies par une analyse approfondie à l'aide de la spectroscopie RMN 1D et 2D en combinaison avec MS (Données supplémentaires), ainsi que par comparaison avec des données de la littérature.

Le composé 5 a été obtenu sous forme de poudre amorphe brune et testé positif pour le réactif de Dragendorff. Il a montré une molécule protonée à m/z328 [M plus H]' dans le LR-ESI( plus )MS compatible avec la formule moléculaire C18H1NO5. Les spectres 'H et 13C-RMN de 5 (tableau 1) étaient cohérents avec ceux de la réticuline (4) [27, à l'exception de l'absence du groupe méthyle lié à l'azote (CH 3- N) et du signal de le groupe méthine en position 1, qui a été remplacé par un signal à δc 165,1 dans le spectre 13C-RMN typique du groupe imine conjugué à un groupe carbonyle à bc 192,8. Dans le spectre 'H-RMN, trois atomes d'hydrogène descendants à δH 6,88（1H,d, J=8.4 Hz, H-5'）,5H7.57（1H,d, J{{33} }.0Hz, H-2'）et δH 7,60（1H, dd, J=8.4 et 2,0 Hz, H-6'） , a révélé la présence d'un système de couplage ABX. Deux signaux singulet à 6H 6.90(1H,s, H-8) et 6.71(1H, s, H-5) ont indiqué la présence d'un cycle phényle 1,2,4,5-tétrasubstitué. De plus, le spectre H-NMR de 5 a également montré des signaux pour deux groupes méthoxy résonnant à bH 3,93 (3H, s) et 6H 3,95 （3H,s）, et des signaux pour deux groupes méthylène résonnant à δμ 2,79（2H,t, J=7.8 Hz） et 6H 3.89(2H,t,/=7.8 Hz), attribués respectivement à H-4 et H-3 (tableau 1) . Ces données indiquent que l'alcaloïde 5 a un squelette de benzyltétrahydroisoquinoline [28-30].

Ces groupes ont été établis sur la base de la carte de corrélation 'H-13 à deux et trois liaisons de l'expérience HMBC-NMR (Figure 2 et Tableau 1). Cette analyse a révélé que l'hydrogène à δH 3,89 （H-3） montrait une corrélation à trois bandes 'H-13C avec les carbones à 6c130.1（4a） et δc165.{ {42}}（C-1）et corrélation lH-13C à deux liaisons avec le carbone atδc 25,4(C-4), confirmant la présence du groupe imine dans la molécule. D'autre part, les signaux à δH 7,57 （H-2'） et δH 7,60（H-6'）ont montré une corrélation à trois liaisons lH-13C avec les carbones à δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）et δc192.8（C-7）,et5c116.0（C-2'）,6c 151.4 (C-4') et c 192,8(C-7'), respectivement, établissant le groupe carbonyle dans la molécule (Figure 2 et Tableau 1). Par conséquent, sur la base de ces données RMN, le composé 5

a été établi comme l'alcaloïde benzyltétrahydroisoquinoline 34-dihydro-7-hydroxy-6-méthoxy-1-isoquinolinyl)(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-méthanone, qui était nommé déhydro-oxonorréticuline. Cet alcaloïde est décrit pour la première fois dans la littérature comme un produit naturel. Son premier et unique enregistrement a été décrit par Dörnyei et al. en 1982 【31】comme produit d'origine synthétique. Seules les données 'H-NMR sont décrites avec quelques multiplicités indéterminées. Ainsi, les affectations complètes pour tous les déplacements chimiques RMN 1H et 13C ont été établies par des expériences de corrélation RMN H-13C à une liaison (HSOC) et à deux et trois liaisons (HMBC), et ont été décrites dans Tableau 1.

Les composés 6 et 7 ont été identifiés comme les alcaloïdes de benzyltétrahydroisoquinoléine ( plus )-1S,2R-réticuline-N-oxyde et( plus )-1S,2S-réticuline-N-oxyde, respectivement. Les données H-NMR de ces alcaloïdes ont été comparées aux données décrites par Lee et al. [28] en utilisant le même solvant deutéré (CD3OD) et certaines incohérences ont été observées (tableau 1), principalement en ce qui concerne H-1, H-8 et H, C-NO. Il n'y a pas de données 13C-RMN décrites pour ces alcaloïdes dans la littérature. Sur la base des données limitées de RMN 1H et 13C, ainsi que des ambiguïtés observées pour ces molécules, des expériences de RMN 1D et 2D de 'H et 13C ont été réalisées pour déterminer leurs affectations et multiplicités correctes.

La position correcte de l'hydrogène H{{0}} et H-1 des deux isomères 6 et 7 a été établie sur la base de la carte de corrélation à trois liaisons 'H-13C du HMBC -Expérience RMN （Figure 2）. Pour l'isomère 6, l'analyse a révélé que l'hydrogène à δH 5,78（H-8） montrait une corrélation à trois liaisons 'H-13C avec les carbones à 6c 79,8（C-1）,δc120 .6（4a）, et δc 149.4 （C-6）, tandis que l'hydrogène à δH 4,13 （H-1）a montré une corrélation à trois liaisons 'H-13C avec les carbones à c 60.7（C-3）,6c 115.7 （C-8）,δc 120.6（C-4a）, et 131.2 （C-1'）, établissant ainsi le positions correctes des hydrogènes H-8 et H-1 pour l'isomère 6. Cette attribution peut être confirmée par l'analyse de l'hydrogène à δH 6,76（H-5）qui a montré trois liaisons Corrélation H-13C avec les carbones atδc 27,0（C-4）,δc 127,1（C-8a） et δc 145,7 （C-7）（Figure2）. Pour l'isomère7, l'analyse a révélé que l'hydrogène à δH 6,30 （H-8）présentait une corrélation à trois liaisons 'H-13C avec les carbones à δc 79,4（C-1）,δc 122,8（ 4a) et δc 148,9 （C-6）, tandis que l'hydrogène à δH 4,46 （H-1）a montré des corrélations à trois liaisons H-13C avec les carbones à δc 62,9 （C{ {82}}）,5c 115,5（C-8）, bc 122,8（C-4a） et 131,4（C-1'）, établissant ainsi les positions correctes des hydrogènes H -8 et H-1 pour l'isomère 7. Cette attribution a également été confirmée par l'analyse de l'hydrogène à δH 6,71 （H-5) qui a montré trois liaisons lH-13C corrélations avec les carbones à δc26.3（C-4）, δc 126.9（C-8a） et 6c 146.1（C-7）(Figure 2). L'expérience NOESY a également été réalisée pour établir la stéréochimie correcte des isomères 6 et 7. Dans cette expérience, la forte corrélation NOE de H-1（δH 4.13）et H, CN(5 3.15) a indiqué la -orientation de l'oxygène dans l'isomère 6. En revanche, aucune corrélation NOE évidente entre H-1(6H 4.46) et HAC-N(5H 3.20) n'a pu être trouvée dans l'expérience 2D-NOESY pour 7, indiquant l'orientation de l'oxygène dans l'isomère 7 (figure 2). Ces petites différences dans les déplacements chimiques de ces isomères sont clairement observées en raison de la stéréochimie de l'azote affectée par les positions et de l'oxygène. Les comparaisons des données RMN-H et 13C obtenues pour les composés 6 et 7 avec les données de molécules à structures proches telles que l'hexapétaline A et l'hexapétaline B [30] étayent sans ambiguïté les données décrites dans le tableau 1.

Les composés 1-4 et 8-13 ont été identifiés comme thalifoline (1) [32], anonaïne (2) [33]liriodénine (3)[10,34], (S)-( plus )-réticuline ( 4)[27], coreximine (8) [34,35], bisnorargémonine (9)[36], isochamanétine (10) [37], dichamanétine (11) [37] et un mélange d'uvarinol (12) et d'isouvarinol (13) [37] sur la base de leurs profils spectroscopiques et comparaison avec les valeurs de la littérature. Les spectres 1D et 2D-RMN lH et 13C, ainsi que les spectres de masse de tous les composés isolés, sont disponibles en tant que matériaux supplémentaires.

D'un point de vue chimiophénétique (un nouveau terme pour la chimiosystématique des plantes / chimiotaxonomie des plantes), il est important de noter que la présence de flavanones C-benzylées et de dihydrochalcones C-benzylées est un type particulier de flavonoïdes dérivés de la pinocembrine flavanone bien connue. et ont été décrites notamment chez des espèces du genre Uoaria appartenant à la famille des Annonacées [3,38-42]. La présence de ces composés chez D. calycina suggère des relations chimiophénétiques étroites avec Uoaria. D'autre part, d'autres investigations devraient être menées avec d'autres parties de la plante, ainsi que d'autres espèces de Diclinanona pour confirmer cette relation chimiophénétique. Les flavanones et les chalcones sont répandus dans les plantes supérieures, mais l'ajout de groupements benzyles est assez rare et semble limité chez les Annonacées au genre Uoaria [3,39-42]et maintenant au genre Diclinanona. Les groupes benzyle proviennent vraisemblablement d'une voie C6-C1, mais la fonctionnalité o-hydroxy est inhabituelle. L'absence de substituants dans le cycle B de tous ces flavonoïdes de Uoaria et Diclinanona peut être mise en relation avec l'observation précédente concernant les flavonoïdes de Popowia cauliflora [38].

Les alcaloïdes dérivés de l'isoquinoline isolés et décrits dans ce travail ont déjà été enregistrés chez plusieurs espèces d'Annonaceae dans différents genres. Certains d'entre eux, comme la liriodénine et l'anonaïne, sont considérés comme des marqueurs chimiophénétiques, et la présence de ces alcaloïdes chez D.calycina renforce encore la relation de ces marqueurs chimiophénétiques dans la famille des Annonacées [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Il convient de mentionner que, selon Zidorn [44], les études chimiophénétiques sont définies comme des études visant à décrire l'éventail des métabolites secondaires spécialisés dans un taxon donné, comme déjà observé dans plusieurs travaux publiés [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Ainsi, les études chimiophénétiques contribuent à la description phénétique des taxons, à l'instar des approches anatomiques, morphologiques et caryologiques, qui ont déjà été reconnues comme d'une grande importance pour l'établissement des systèmes "naturels", et qui continuent d'être d'une extrême importance pour la description d'organismes classés à l'aide de méthodes moléculaires modernes [44].

2.2. Test cytotoxique

L'activité cytotoxique in vitro des composés isolés (tableau 2), à l'exception des composés 2, 3, 5 et 8 (en raison de leur faible rendement), a été évaluée contrecellule cancéreuselignées HL-60 (leucémie promyélocytaire humaine), MCF-7(adénocarcinome du sein humain), HepG2 (carcinome hépatocellulaire humain), HCT116 (carcinome du côlon humain) et lignée cellulaire non cancéreuse MRC{{5} } (fibroblaste pulmonaire humain) en utilisant le test au bleu Alamar après 72 h d'incubation.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 µg.mL-1). La dichamanétine (11) a montré une activité cytotoxique contre HL-60 et HCT116 avec des valeurs IC50 de 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L-1） et 18,99 ug·mL-1（40,56 umol.L-1）, respectivement. Le mélange d'uvarinol (12) et d'isouvarinol (13) a démontré une activité cytotoxique contre HL-60, avec une valeur ICs0 de 9,74 ug∶mL-1, et HCT116, avec une valeur ICs0 de 17,31 ug∶mL{ {30}}. Parmi les dihydroflavones benzylées, seule l'isorhamnétine (10) a montré une activité cytotoxique contre HepG2 avec une valeur IC50 de 19,79 ugs:mL-1(54,65 umol.L-1). Selon la littérature, les dihydroflavones benzylées sont décrites avec des propriétés cytotoxiques [39-42]. Parmi ceux décrits dans ce travail, l'isorhamnétine (10), la dichamanétine (11) et l'uvarinol (12) sont décrits dans des propriétés cytotoxiques in vitro contre les lignées cellulaires tumorales humaines du carcinome du nasopharynx (KB) et de la leucémie lymphocytaire P -388 (PS) avec des valeurs IC50 de 5,3 et 4,1, 4,8 et 1,8, et 5,9 et 9,7, ug.mL-1, respectivement [39,40]. Ces différentes activités peuvent être attribuées à la présence d'un ou plusieurs groupements hydroxy benzyle présents dans les molécules ainsi qu'à la position dans laquelle ces groupements sont liés. Cependant, une enquête plus approfondie est nécessaire pour confirmer cette observation.

L'activité cytotoxique in vitro des alcaloïdes dérivés de l'isoquinoléine anonaïne (2), liri-adénine (3) et (S)-( plus )-réticuline (4) a été récemment décrite par Menezes et al.[2{{16 }}], Souza et al. [6] et Costa et al. [43] en mettant l'accent sur la liriodénine, qui a démontré une puissante activité cytotoxique contre les lignées cellulaires cancéreuses B{{10}}F10(mélanome de souris), HepG2(carcinome hépatocellulaire humain), HL{{13 }} (leucémie promyélocytaire humaine) et K562 (leucémie myéloïde chronique humaine) avec des valeurs IC5s0 inférieures à 10,0 μmol.L-1【43】. L'anonaïne a montré une activité modérée contre B16-F10, HepG2, HL60 , et K562 avec des valeurs IC50 inférieures à 19,0 μmol.L-1[20]. La (S)-(plus)-réticuline a montré une activité modérée uniquement contre HepG2 avec des valeurs IC50 de 15,35 μmol L-1【 6,20】.

3. Matériels et méthodes

3.1. Procédures expérimentales générales

Les rotations optiques dans le méthanol (MeOH) ont été enregistrées avec un polarimètre P{{0}} (Jasco, Tokyo, Japon) à 589 nm. Des expériences de RMN 1D et 2D ont été acquises dans CDCl. (chloroforme-d) ou CDCl plus goutte de CD, OD (méthanol-du, et CD, COCD3(acétone-d6) à 298 K sur un spectromètre AVANCE I HD RMN (Bruker, Billerica, MA, USA) fonctionnant à 11,75 T (Hand 13C à 500 et 125 MHz, respectivement) et sur un spectromètre RMN Bruker AVANCE I 600 fonctionnant à 14,1 T('H et 13Cat 60{ {63}} et 150 MHz respectivement). les constantes de couplage (D) sont données en Hz. Le spectromètre RMN était équipé d'une sonde de détection inverse multinucléaire 5- mm (expériences RMN 1D et 2D) avec un gradient z. Une liaison (HSQC) et deux et les expériences de corrélation RMN-C à trois liaisons (HMBC)1H-13 ont été optimisées pour la constante de couplage moyenne' JcH et LRJ(cH de 140 et 8 Hz, respectivement. Pour l'analyse par spectrométrie de masse à basse résolution (LC-MS), le des échantillons des composés isolés ont été remis en suspension dans du méthanol (qualité HPLC), créant le stoc k solutions(1 mg·mL-1). Des aliquotes (5 uL) des solutions mères ont été diluées à 5 ug·mL et analysées par infusion directe dans un spectromètre de masse triple quadripôle, modèle TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA), équipé d'une ionisation par électrospray (ESI) ou des sources d'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). Conditions ESI-MS : tension de pulvérisation, 5 kV ; gaz de gaine, 10 unités arbitraires (arb) ; gaz auxiliaire, 5arb ; gaz de balayage, 0arb ; température capillaire, 250 degrés ; tension capillaire, 40 V ; lentille tubulaire, 70 V ; plage de masse, m/z 100 à 1 000.Conditions APCI-MS : courant de décharge, 5 μA ; température du vaporisateur, 350 degrés ; pression de gaz de gaine, 25 unités arbitraires (arb) ; pression de gaz de balayage ionique, 0,0 arb ; pression de gaz aux, 10 arb ; température capillaire, 250 degrés C; décalage de la lentille du tube, 70 V ; décalage du skimmer, 0 V ; gamme de masse, m/z 100 à 1000. L'argon a été utilisé comme gaz de collision, et les spectres MS/MS ont été obtenus en utilisant des énergies de collision allant de 25 à 30 eV. Le gel de silice 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, USA, 70-230 mesh) a été utilisé pour la chromatographie sur colonne (CC), tandis que le gel de silice 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne, 0,25 mm, aluminium) a été utilisé pour l'analyse et la préparation avec la chromatographie sur couche mince (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, verre). Les composés ont été visualisés par exposition sous une lumière UV254/365, par pulvérisation de réactif p-anisaldéhyde suivie d'un chauffage sur une plaque chauffante, et par pulvérisation du réactif de Dragendorff.

3.2.Matériel végétal

Dans la présente enquête, le matériel botanique (écorce) de D.calycina a été collecté le 27 mai 2017 dans la réserve Adolpho Ducke (coordonnées géographiques : 02 degré 53'36.1S et 59 degré 58'28.9"W), Manaus, État d'Amazonas , Brésil, et identifié par le Prof. Dr.Antonio Carlos Webber, un taxonomiste des plantes du Département de Biologie de l'Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM). Un spécimen de référence numéro 10 810 a été déposé à l'Herbier de la DB/UFAM. accès (spécimen) a été enregistré dans le Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) avec le dossier A70EDCD.

3.3. Extraction et isolement

L'écorce de D.calycina a d'abord été séchée à température ambiante pendant 24 h, puis séchée dans un four à circulation d'air pendant 48 h à une température de 40 degrés, puis pulvérisée dans un broyeur à quatre couteaux (Marconi, Piracicaba, SP , Brésil) pour obtenir le matériau en poudre (1340 g). Ensuite, une macération exhaustive avec de l'hexane (8 x 4 L) suivie de MeOH (8 x 4 L) a été réalisée. Les solutions extractives obtenues ont été concentrées dans un évaporateur rotatif à pression réduite (40-50 degré) pour donner les extraits d'hexane (24,85 g) et de MeOH (199,43 g), respectivement.

L'analyse TLC révélée avec le réactif de Dragendorff a indiqué une forte présence d'alcaloïdes dans l'extrait de MeOH. Par conséquent, une aliquote d'extrait de MeOH (188,3 0 g) a été initialement soumise à une extraction acide-base pour donner des fractions alcaloïdes (5,46 g) et neutres (4,47 g). Par la suite, une partie de la fraction alcaloïde (5.0g) a été soumise à une colonne chromatographique sur gel de silice (CC) préalablement traitée avec une solution de NaHCO3 à 10 % [12], éluée avec de l'hexane (100 %), hexane-CHCl, (90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 et 10:90, v/o), CH2Cl2 (100 %), CH2Cl 2-AcOEt(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 et 10:90,0/u), AcOEt (100 %) :80, et 10:90, v/o), et enfin MeOH donnant 250 fractions (30 mL chacune). 85:15 et 80:20 comme système d'éluant (v/o), les échantillons similaires ont été regroupés pour donner 16 fractions (F1 à F16).

La fraction F5 (181,2 mg) du CC initial éluée avec de l'hexane-CH,Cl2 (50:50 à 10:90, v/o) a été soumise à un nouveau gel de silice CC en utilisant la même méthodologie ci-dessus éluée avec de l'hexane (100 %), hexane -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 et 10:90, v/o), CH,Cl ,(100 %), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 et 10:90 ,o/),EtOAc(100 pour cent), EtOAc-MeOH(85:15,70:30,50:50, 30:70 et 15:85, /o),et MeOH (100 pour cent) donnant 118 fractions( 15 ml chacun) qui ont été regroupés en 12 sous-fractions (F5.1 à F5.12), selon l'évaluation de l'analyse TLC en utilisant un mélange de CH2Cl2-MeOH dans les proportions de 95:05 et 90:10. Sous-fraction F5 .1 (28,9 mg) élué avec de l'hexane (100 %) a été soumis à une CCM preparative. respectivement. Sous-fractions F5.4 (21,5 mg) éluée avec de l'hexane-CH,C(80:20,vo), F5.5 (16,7 mg) éluée avec de l'hexane-CH,Cl(80:20,70:30,60;40. et 50:50 ,v/), et F5.6(15,4 mg) élués avec de l'hexane-CHCl2 (50:50, 40:60 et 30:70, v/o) ont été regroupés (53,6 mg) et également soumis à une TLC préparative éluée avec CH,Cl-MeOH (95:05, v/u, deux élutions) donnant 3 (8,9 mg).

Fraction F6(2099,1 mg) du CC initial éluée avec de l'hexane-CHCl(10 :90,v/)), CH2Cl, (100 pour cent), et CH,Cl2-EtOAc (90:10 à 10:90, o/o) a été soumis à un nouveau gel de silice CC en utilisant la même méthodologie ci-dessus éluée avec les mêmes systèmes de solvants donnant 140 fractions (30 mL chacun). Après TLCevaluation en utilisant un mélange de CH2Cl2-MeOH dans les proportions de 95:05, 90:10 et 85:15 comme système éluant (o/o), les échantillons similaires ont été regroupés pour donner 13 sous-fractions (F6 .1 à F6.13). La sous-fraction F6.6 (1541,3 mg) a été soumise à un nouveau gel de silice CC en utilisant la même méthodologie ci-dessus éluée avec les mêmes systèmes de solvants donnant 120 fractions (30 ml chacune) qui ont été analysées par CCM (en utilisant la même méthodologie ci-dessus) fournissant 12 nouveaux sous-fractions (F6.6.1 à F6.6.12). La sous-frac-tion F6.6.2(17,0 mg) éluée avec de l'hexane-CH,Cl,(60:40 et 50:50,v/v) a été soumise à une CCM préparative éluée avec CH2Cl2-MeOH(90:10, v/o, une élution) résultant en 3 (1,4 mg). Sous-fraction F6.6.3 (643,3 mg) éluée avec de l'hexane-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 et 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 %) et CH2Cl2-EtOAc (90 : 10 et 80 : 20, o/o) ont été soumis à une CCM préparative éluée avec CH2Cl2- MeOH (90 :10, vfo, une élution) donnant une nouvelle sous-fraction F6.6.3.1(161,8 mg)qui a été soumise à une nouvelle CCM préparative éluée avec EtOAc-MeOH(90:10, v/o, une élution) donnant 4(148,2 mg). La sous-fraction F6.6.4 (90,2 mg) éluée avec CH2Cl2-EtOAc (70 : 30 et 60 : 40, o/o) a été soumise à une CCM prépara-tive éluée avec CH2Cl-MeOH (90 : 10, v/o, une élution) donnant 1 (1,4 mg) et 4 (50,1 mg), respectivement. La sous-fraction F6.6.5(83,4 mg) éluée avec CH,Cl-EtOAc(60:40 et 50:50, o/o) a également été soumise à une CCM préparative éluée avec CH,Cl2-MeOH(90:10, ufo, une élution) donnant à nouveau 1 (1,5 mg) et 4 (45,5 mg), respectivement. La sous-fraction F6.6.6 (101,4 mg) éluée avec CH,Cl2-EtOAc (50 :50 et 40 :60, v/)) a été soumise à une CCM préparative éluée avec CH,Cl-MeOH (90 : 10, vfo, une élution)donnant 8(3,4 mg) et une autre sous-fraction F6.6.6.1 (48,8 mg).Cette sous-fraction (F6.6.6.1)a été soumise à une préparation TLCeluté initialement avec EtOAc-MeOH (85 :15, vo, une élution) et postérieurement CHCl-MeOH(90:10,v/v,une élution) donnant à nouveau 4(37,4 mg). Pour cette procédure, la plaque chromatographique a été initialement éluée avec la phase mobile EtOAc-MeOH (85:15, v/o, une élution). Après cette élution, la plaque chromatographique a été séchée pour éliminer le solvant puis soumise à une nouvelle élution avec la phase mobile CH,Cl,-MeOH(90:10,vf,one elution) donnant 4.Subfraction F6.6.7 ( 109,0 mg) éluée avec CH,Cl2-EtOAc(40:60,30:70,20:80 et 10:90,vfo) a été soumise à une CCM préparative éluée avec CH,Cl2-MeOH (90:10,vo, une élution) donnant une autre sous-fraction F6.6.7.1 (24,8 mg) qui a été soumise à une nouvelle CCM préparative éluée initialement avec EtOAc-MeOH (85:15, v/o, une élution) et postérieurement CH2Cl2-MeOH (90:10,vfo,une élution) donnant 9 (11,1 mg). La procédure d'isolement utilisée pour 9 était la même que celle décrite précédemment pour 4. La sous-fraction F6.6.10 (92,0 mg) éluée avec EtOAc-MeOH (60:40 et 50:50, v/o) a été soumise à une TLC préparative éluée avec CH, Cl,-MeOH (90:10, v/o, une élution) donnant 5 (1,7 mg) et 6 (7,8 mg), respectivement. La sous-fraction F6.6.11 (326,0 mg) éluée avec EtOAc-MeOH (50 : 50, 40 : 60, 30 : 70, 20 : 80 et 10 : 90, v/o) a été soumise à une CCM preparative éluée avec CHCl- MeOH (90:10, v/o, une élution) contenant 1 (2,4 mg) et 7 (12,5 mg), respectivement.

La fraction F7 (692,4 mg) de la CCelution initiale avec EtOAc (100 %) et CHCl2-EtOAc (95:05,90:10,85:15 et 75:25,ofo) a été soumise à un nouveau gel de silice CCen utilisant la même méthodologie que celle décrite pour le CC initial avec les mêmes systèmes de solvants offrant 110 fractions (30 ml chacune).Après CCMévaluation en utilisant un mélange de CH2Cl2-MeOH dans les proportions de 95:05, 90:10 et 85 :15 comme système d'éluant (o/o), les échantillons similaires ont été regroupés pour donner 12 sous-fractions (F7.1 à F7.12).F7.8(147,4 mg) éluées avec CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 et 30:70, v/o pour cent) a été soumis à une TLC préparative éluée avec CHCl-MeOH (95:05, vfo, une élution) donnant 10(5,4 mg) et 11( 120,6 mg), respectivement. F7.9(144,2 mg) élué avec CHCl2-EtOAc (30 : 70, 20 : 80 et 10 : 90, v/o pour cent) a également été soumis à une CCM preparative éluée avec CH, Cl, -MeOH( 95:05, vo, une élution) donnant 11 (91,2 mg) et un mélange de 12 et 13 (39,4 mg), respectivement.

Thalifoline (1): poudre brune amorphe;' H-NMR et 13C-NMR conformément à la littérature [32] ; LR-ESI( plus )-MS [M plus H]* plus m/z 208.

Anonaïne (2) : Poudre brune amorphe ; 1H-NMR et 13C-NMR conformément à la littérature [33] ; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 266.

Liriodénine (3) : Cristaux jaunes (CH,Cl-MeOH 3:1) ; RMN 1H et RMN 13C conformément à la littérature [10,34] ; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 276.

(S)-( plus )-Reticuline(4) : Poudre brune amorphe ; [ ]p25 plus 71,60(c 0,05 g/100 mL, MeOH); 1H-NMR et 13C-NMR conformément à la littérature [27 ; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 30.

3,4-Dihydro-7-hydroxy-6-méthoxy-1-isoquinolinyl)(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-méthanone (déhydro-oxonorréticuline)(5 ) : Poudre amorphe brune ; 'H et 13C-NMR data, voir tableau 1 ; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.

( plus ){{0}}N-oxyde de S,2R-réticuline(6) : poudre amorphe brune ; [pl25 plus 136,4 (environ 0,146 g/100 ml, MeOH); 1Hand 13C-NMR data,see Table1;LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/2346

( plus ){{0}}N.-oxyde de S,2S-réticuline (7) : poudre amorphe brune ; [ ]p25 plus 394,5 (c 0,03 g/100 mL, MeOH) ;'H et 13C-NMR data, voir tableau 1 ;LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/z346.

Coreximine (8) : Poudre amorphe jaune clair ;[ ]p25 plus 201.1(c 0.08g/100mL, MeOH)'H-NMR et 13C-NMR conformément à la littérature[34,35] ;LR- ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.

Bisnorargémonine (9) : Poudre brune amorphe ; 1H-NMR et 13C-NMR conformément à la littérature [36] ; LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.

Isochamanetin (10) :Poudre amorphe jaune clair ; [ p25-12.4(c 0,5 g/100 mL, MeOH)'H-NMRet 13C-NMR conformément à la littérature[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanétine (11) :Poudre amorphe jaune ;[ ]D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH);1H-NMR et 13C-NMR conformément à la littérature [37] ; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Un mélange d'uvarinol(12) et d'isouvinol(13) : Poudre amorphe jaune ; H-NMR et 13C-NMR conformément à la littérature [37] ; LR-ESI(-)-MS [MH]- m/z 573.

3.4.Test cytotoxique in vitro

3.4.1.Cellules

HL-60 (leucémie promyélocytaire humaine), MCF-7 (adénocarcinome du sein humain), HepG2 (carcinome hépatocellulaire humain), HCT116 (carcinome du côlon humain) et MRC-5 (fibroblaste pulmonaire humain) les lignées cellulaires ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, États-Unis) et ont été cultivées conformément aux recommandations du guide de culture de cellules animales de l'ATCC. Toutes les lignées cellulaires ont été testées pour les mycoplasmes à l'aide d'un kit de coloration des mycoplasmes (Sigma-Aldrich) pour valider l'utilisation de cellules exemptes de contamination.

3.4.2. Test de cytotoxicité

Pour le test de cytotoxicité, la viabilité cellulaire a été quantifiée par la méthode du bleu Alamar, comme décrit précédemment [{{0}}]. Pour toutes les expériences, les cellules ont été étalées dans des plaques 96-puits. Les constituants chimiques ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brésil) et ajoutés à chaque puits et incubés pendant 72 h. La doxorubicine (chlorhydrate de doxorubicine, pureté supérieure ou égale à 95 %, Laboratoire IMA SAIC, Buenos Aires, Argentine) a été utilisée comme contrôle positif. À la fin du traitement, 20 μL d'une solution mère (0,312 mg/mL) de résazurine (Sigma-Aldrich Co.) a été ajoutée à chaque puits. Les absorbances à 570 nm et 600 nm ont été mesurées à l'aide d'un lecteur de microplaques SpectraMax190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). La concentration semi-inhibitrice (CI50) a été obtenue par régression non linéaire. avec des intervalles de confiance à 95 % (IC95 %) en utilisant le logiciel GraphPad Prism (Intuitive Software for Science ; San Diego, CA, USA).

4. Conclusions

L'étude phytochimique de l'écorce de D.calycina a conduit à l'isolement et à l'identification de treize composés(1-13) ; neuf alcaloïdes dérivés de l'isoquinoline (1-9) et quatreflavonoïdes(10-13). Les alcaloïdes appartiennent aux sous-classes suivantes : isoquinoléine simple, thali en ligne(1) ; aporphine, anonaïne (2) ; oxoaporphine, liriodénine (3); benzyl-tétrahydroisoquinolines, ( plus )-réticuline(4), déhydro-oxonorréticuline(3,4-dihydro-7-hydroxy-6-méthoxy-1-isoquinolinyl)({{13} }hydroxy-4-méthoxyphényl)-méthanone)(5), 1S,2R-réticuline Ng-oxyde(6) et 1S,2S-réticuline N.-oxyde (7); tétrahydro protoberbérine, coreximine (8); et pavine, bisnorargémonine (9). Alors que les flavonoïdes appartiennent aux dihydroflavones benzylées, l'isorhamnétine (10), la dichamanétine (11) et un mélange d'uvarinol (12) et d'isouvarinol (13). Les composés isolés sont décrits pour la première fois chez D.calycina ainsi que dans le genre Diclinanona.

L'activité cytotoxique des composés isolés (à l'exception de l'anonaïne, de la liriodénine, de la 1,2-dihydro-oxonorréticuline et de la coreximine) a été évaluée contre le cancer (HL-60, MCF-7, HepG2 et HCT116) et lignées cellulaires non cancéreuses (MRC-5). Parmi eux, les résultats les plus prometteurs ont été observés pour les dihydroflavones benzylées dichamanétine (10), et

le mélange d'uvarinol (12) et d'isouvarinol (13) qui a montré une activité cytotoxique modérée contre les lignées cellulaires cancéreuses testées （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). La dichamanétine (11) a montré une activité cytotoxique contre HL-60 et HCT116 avec des valeurs IC50 de 15,78 ug·mL-1 （33,70 μmol-L-1）et 18,99 ug·mL-I（40,56 μmol .L-1）, tandis que le mélange d'uvarinol （12） et d'isouvarinol (13) a démontré une activité cytotoxique contre HL-60, avec une valeur IC50 de 9,74 ug∶mL-I, et HCT116, avec IC50 valeur de 17,31 ug·mL-1. Ces résultats sur les lignées cellulaires tumorales sont également décrits pour la première fois pour les dihydroflavones benzylées. Les activités cytotoxiques de la réticuline, de l'anonaïne et de la liriodénine ont été précédemment établies, dans lesquelles la liriodénine est le composé le plus puissant.

Les résultats obtenus dans ce travail indiquent que les espèces de la famille des Annonacées sont une source prometteuse de composés biologiquement actifs aux propriétés cytotoxiques, et suggèrent la poursuite de leur investigation dans d'autres modèles d'essais biologiques.

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