Le bêta-glucane a amélioré la réponse immunitaire au vaccin contre la maladie de Newcastle et a modifié l'expression de l'ARNm de la rate chez les poulets

ABSTRAIT

La présente étude a été réalisée pour étudier l'effet de l'administration orale de b-glucane (G70), un produit obtenu à partir de la paroi cellulaire de levure, sur les titres d'inhibition de l'hémagglutination (HI) spécifiques du virus de la maladie de Newcastle (NDV), la prolifération des lymphocytes et le rôle des sous-populations de lymphocytes T chez les poulets traités avec le vaccin vivant contre le NDV. De plus, l’influence du b-glucane sur l’expression des gènes spléniques a été étudiée par séquençage du transcriptome. Les résultats ont révélé que la supplémentation en b-glucane augmentait le titre sérique de NDV HI, augmentait l'indice de stimulation NDV des lymphocytes dans le sang périphérique et le tractus intestinal et favorisait la différenciation des lymphocytes T en cellules T CD4+. L'analyse de séquençage de l'ARN (RNA-seq) a démontré que le G70 régulait positivement les expressions d'ARNm liées au récepteur couplé à la protéine G et au polypeptide du CMH de classe I, et régulait négativement les expressions d'ARNm liées à la cathélicidine et à la bêtadéfensine. L’effet immunomodulateur du G70 pourrait fonctionner via la voie de signalisation de la protéine kinase activée par un mitogène. En résumé, le G70 pourrait renforcer l’efficacité immunologique du vaccin vivant contre le NDV chez les poulets et pourrait être utilisé comme candidat adjuvant potentiel dans l’industrie avicole.

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Mots clés : vaccin contre la maladie de Newcastle, bêta-glucane, adjuvant, poulet à os noirs, ARN-seq

INTRODUCTION

Les polysaccharides de la paroi cellulaire de la levure sont directement issus de la paroi cellulaire de Saccharomyces cerevisiae et sont largement utilisés comme promoteurs de croissance, agents antimicrobiens ou immunomodulateurs chez la volaille pour améliorer la production et la santé (Schiavone et al., 2017 ; Hasted et al., 2021). Auparavant, il a été démontré qu'un produit appelé PW220, qui contient des polysaccharides de la paroi cellulaire de levure, renforce la réponse immunitaire provoquée par le virus de la maladie de Newcastle (NDV) et modifie la communauté microbienne du caecum des poulets par administration orale (Bi et al., 2020). ). Les polysaccharides de la paroi cellulaire de la levure sont principalement constitués de b-glucane et de mannan-oligosaccharides (Wang et al., 2018). Dans la présente étude, le b-glucane a été étudié pour son effet sur la réponse immunitaire au vaccin NDV chez les poulets. La rate est un organe essentiel pour initier la réponse immunitaire. Une étude récente a indiqué que le PW220, qui est un produit de la paroi cellulaire de levure, régulait positivement l'expression de l'ARNm de TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 et T-bet dans la rate des poulets ( Bi et coll., 2022). Cependant, le mécanisme spécifique doit être élucidé. Le séquençage de l'ARN (RNA-seq) est l'une des technologies à haut débit qui peuvent être appliquées pour tester l'expression quantitative des gènes et fournir une analyse de différents profils d'expression au niveau de l'ensemble du transcriptome (Zhao et al., 2018). Grâce aux avantages d'une sensibilité élevée et d'un faible coût, le séquençage d'ARN a été largement utilisé dans les études sur le bétail et la volaille (Teixeira et al., 2019 ; Yuan et al., 2020). Ainsi, dans cette étude, l’effet de l’administration du b-glucane sur les titres d’inhibition de l’hémagglutination (HI) spécifiques du NDV, la prolifération des lymphocytes et les sous-populations de lymphocytes T chez les poulets vaccinés par voie orale avec le vaccin NDV ont été évalués. De plus, l’analyse du transcriptome a été utilisée pour évaluer l’effet du b-glucane sur l’expression des gènes et les voies sous-jacentes de transduction du signal dans la rate des poulets.

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Animaux

Des poulets commerciaux à os noirs (mâles) d'un jour ont été acquis auprès de Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anshun, Chine). Les poulets étaient répartis dans des cages grillagées permettant un libre accès à la nourriture et à l'eau. Au cours des 7 premiers jours, la température ambiante a été maintenue entre 33 °C et 35 °C, puis a progressivement diminué de 1 °C tous les 2 jours jusqu'à 27 °C. Tous les poulets ont été traités selon les normes établies par la Southwest University Animal Care et Comité d'utilisation (Numéro de certificat d'éthique : IAC-2021-0057). Tous les oiseaux expérimentaux ont été euthanasiés au CO2 à la fin de l’étude.

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Vaccin

Le vaccin vivant contre le NDV (souche La Sota) a été fourni par Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, Chine).

Réactifs 

Le produit de paroi cellulaire de levure (YP) G70 a été obtenu à partir de la paroi de cellules de levure (Saccharomyces cerevisiae), qui contient du b-glucane (supérieur ou égal à 70 %) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, Chine). Les sérums d'antigène et de contrôle positif pour mesurer les titres HI spécifiques du NDV ont été achetés auprès du Qingdao Regen Diagnostics Development Center (Qingdao, Chine). CD anti-poulet3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) et CD8- PE (L{{14 }}TH49T) chez le rat ont été proposés par Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Chine).

Conception expérimentale

Quarante-huit poulets à os noirs âgés de 5 jours ont été répartis au hasard en 3 groupes (tableau 1) et ont reçu soit le régime de base (tableau 2), soit le régime de base avec 0,1 % de G7{{10}. } (b-glucane, 0,7 g/kg) supplémentation pour la durée de la présente recherche. Les groupes H (vaccin G70 +) et C (vaccin) ont été immunisés par voie orale avec le vaccin NDV à 14 et 28 jours, respectivement. Le groupe S (Sailne) a été traité avec un volume égal de solution saline. Des échantillons de sang ont été prélevés par ponction veineuse sur l'aile à l'âge de 5, 7, 14, 21, 28, 35 et 42 jours pour tester le titre HI. Sept jours après la vaccination de rappel, 8 poulets dans chaque colonne ont été choisis au hasard et sacrifiés par asphyxie au CO2. Les lymphocytes ont été séparés du sang périphérique et du jéjunum pour effectuer une analyse de prolifération lymphocytaire et de cytométrie en flux. Dans le cas du prélèvement jéjunal, le ligament suspenseur duodénal était le point de départ du jéjunum et une section de 5 cm de long a été prélevée à partir du point de départ du jéjunum. La rate a été rapidement congelée dans de l'azote liquide, puis stockée à -80 degrés pour la RT-qPCR et le profilage de séquence.

Tableau 1. Plan expérimental

Tableau 2. 1 Composition et teneur en éléments nutritifs des régimes de base expérimentaux pour poulets de chair.

Étude HI

Le test des titres HI spécifiques du NDV dans le sérum a été réalisé conformément à la description précédente (Ball et al., 2019). En bref, le sérum a été dilué avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 1:2 à 1:1 024 dans la plaque de microtitration à fond en V 96-puits. Ensuite, 25 ml de dilution de NDV ont été ajoutés par puits et incubés à 37 degrés pendant 30 min. Après cela, 25 ml de suspension d’érythrocytes de coq à 1 % ont été ajoutés à chaque puits et incubés à 37 degrés pendant 30 min. Tous les échantillons ont été testés deux fois et des contrôles positifs et négatifs ont été inclus sur chaque plaque. Les titres HI étaient basés sur la plus grande dilution entraînant une inhibition complète de l'hémagglutination. Le titre HI moyen et l’erreur type (SE) ont été mesurés par groupe.

Isolement des lymphocytes du sang périphérique

Les lymphocytes ont été isolés et collectés à partir de lymphocytes du sang périphérique à l'aide du kit de milieu de séparation des lymphocytes (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, Chine). Ensuite, les lymphocytes ont été stockés en suspension avec du milieu RPMI 1640 (Solarbio, Pékin, Chine) comprenant 5 % de sérum de veau fœtal et 25 mM d'HEPES (pH 7,0).

Isolement des lymphocytes du jéjunum

Le processus d'affectation a été réalisé conformément à la description précédente, et avec de légères modifications (Yuan et al., 2020). En bref, utilisez un filtre cellulaire de 70 mm pour diviser l’intestin en 4 ml de PBS froid. Ensuite, la suspension d’échantillons cellulaires a été centrifugée à 4 500 tr/min pendant 12 min avec élimination du surnageant. Ensuite, remettez en suspension les cellules intestinales sur un milieu complet (Solarbio Co., Pékin, Chine) composé de 5 % de sérum bovin fœtal (FBS) dans du RPMI 1640 (Sijiqing Co., Hangzhou, Chine). En fin de compte, le kit d'isolement des lymphocytes de poulet (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) pour séparer les lymphocytes. le tissu intestinal a été divisé en 4 ml de PBS froid à l'aide d'un filtre cellulaire de 70 mm. Ensuite, la suspension d'échantillons de cellules a été centrifugée à 4 500 tr/min pendant 12 min et le surnageant a été jeté. Après cela, les cellules intestinales ont été remises en suspension dans du RPMI 1640 (Solarbio Co.) contenant 5 % de FBS (Sijiqing Co.). Enfin, les lymphocytes ont été séparés à l'aide du kit d'isolement des lymphocytes de poulet (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Prolifération des lymphocytes 

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96-puits (5 £ 105 par puits), stimulées par l'antigène du NDV inactivé pour 4 unités d'hémagglutination ou un volume égal de solution saline. Chaque échantillon a été testé en 3 répétitions. Les cellules et l'antigène ont été incubés pendant 44 h à 37 degrés dans 5 % de CO2, puis 50 ml de méthylthiazolyl tétrazolium (MTT) (2 mg/mL) ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 4 h supplémentaires. Les échantillons ont été centrifugés à 1 200 £ g pendant 8 min à température intérieure. Ensuite, le surnageant a été soigneusement retiré et 100 ml de DMSO ont été ajoutés à chaque puits. Les plaques ont été secouées pendant 8 minutes pour solubiliser complètement les cristaux. Enfin, la densité optique (DO) moyenne a été enregistrée à 570 nm. L'indice de stimulation (SI) a été obtenu à l'aide de l'équation : les valeurs OD des puits stimulés/valeurs OD des puits non stimulés (Cui et al., 2020).

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Analyse par cytométrie en flux des sous-populations de lymphocytes T

Les suspensions de cellules lymphoïdes ont été isolées et lavées deux fois avec du PBS. La concentration cellulaire a été modifiée à 106/mL puis maintenue sur la glace. Chaque échantillon a été coloré avec 2 ml de CD anti-poulet de rat 3-APC, CD4- FITC et CD anti-poulet de rat8-PE dans des conditions à l'abri de la lumière pendant 30 min, suivi par 2 lavages au PBS. Les cellules ont été analysées par analyse par cytométrie en flux sur un cytomètre en flux (BD Bioscience, San Jose, CA).

Analyse RT-qPCR

L'ARN total a été dérivé de la rate à l'aide du réactif TRIzol (Takara, Shiga, Japon) conformément aux directives du fabricant, puis converti en ADNc à l'aide du PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, Chine) sur un thermocycleur T100 (Bio-Rad, Hercule, Californie). La bêta-actine du poulet a été utilisée comme gène de contrôle interne. La RT-qPCR de gènes sélectionnés a été réalisée sur un système de PCR multiple en temps réel (AB, Carlsbad, CA) avec le SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). La méthode quantitative relative (244CT) a été réalisée pour évaluer la variation quantitative (Bi et al., 2022). Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau 3.

Extraction d'ARN

Chacun des 3 échantillons de rate du groupe H (G70 +Vaccin) et du groupe C (Vaccin) a été utilisé pour la séquence d'ARN avec le réactif TRIzol (Takara). Après cela, l'ARN a été testé pour la contamination et la dégradation avec un gel d'agarose à 1% et la pureté de l'ARN a été analysée à l'aide d'un spectrophotomètre NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA). La concentration d'ARN a été déterminée à l'aide du kit de test Qubit RNA dans Qubit 2. 0 Fluoromètre (Life Technologies, Carlsbad, CA). L'intégrité de l'ARN a été mesurée à l'aide du kit de test RNA Nano 6000 du système Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, Californie). Les résultats ont démontré que l’ARN était complet et sans contamination par l’ADN.

Analyse du transcriptome

Le séquençage du transcriptome, l'assemblage de séquences et l'analyse des données ont été fournis par Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Beijing, Chine). Les principales procédures de transcriptome ont été répertoriées comme suit : 1) La purification de l'ARNm à partir de l'ARN total a été réalisée à l'aide de billes magnétiques poly-T oligo-attachées. La fragmentation a été réalisée avec des cations divalents dans le tampon de réaction de synthèse NEB Next First Strand (5X) à haute température. 2) L'ADNc du premier brin a été synthétisé à l'aide d'une amorce hexamère aléatoire et de l'inverse du virus de la leucémie murine Moloney (M-MuLV). La synthèse de l'ADNc du deuxième brin a ensuite été synthétisée à l'aide de l'ADN polymérase I et de la RNase H. 3) Les surplombs restants ont été transformés en extrémités franches grâce aux activités exonucléase/polymérase. Une structure en boucle en épingle à cheveux NEB Next Adapter a ensuite été ligaturée pour préparer l'hybridation après adénylation de l'extrémité 3' des fragments d'ADN. 4) Des fragments d'ADNc d'environ 250 à 300 pb ont été obtenus et la bibliothèque a été purifiée à l'aide du système AMPure XP de Beckman Coulter (Beckman Coulter, Beverly, MA). Ensuite, 3 ml d'enzyme NEBU SER (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) ont été appliqués avec un ADNc de taille sélectionnée et ligaturé par un adaptateur à 37 degrés C pendant 15 minutes, puis 5 minutes à 95 degrés. L'amplification PCR a été réalisée avec l'ADN polymérase Phusion High-Fidelity. Finalement, les produits de PCR ont été purifiés (système AMPure XP) et la qualité de la bibliothèque a été estimée à l'aide du système Agilent Bioanalyzer 2100. Le regroupement des échantillons codés par index a été effectué sur TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA). Ensuite, le séquençage a été effectué sur une plate-forme Illumina Novaseq et des lectures appariées de 150 pb ont été générées. Les fichiers d'annotation du génome de référence et du modèle génétique ont été téléchargés à partir du site Web du génome (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ et ftp://ftp. ensembl.org/pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Un index du génome de référence a été établi à l'aide de HISAT2 (v2.0.5) et les lectures propres aux extrémités appariées ont été alignées sur le génome de référence. Le nombre de lectures mappées sur chaque gène et les fragments par kilobase par million (FPKM) pour chaque gène en fonction de la longueur du gène et le nombre de lectures mappées sur le gène ont été calculés à l'aide de Feature Counts v1.5.{{38} }p3. L'expression différentielle entre le groupe H (vaccin G70 +) et le groupe C (vaccin) a été dérivée à l'aide du package DESeq2 R (1.16.1). Gènes avec P < 0,05 et |log2 (fold change)| > 1 ont été définis comme des gènes d'expression différentielle (DEG).

Tableau 3. Séquences d'amorces pour RT-qPCR.

Validation PCR quantitative en temps réel 

Deux DEG régulés positivement et 4 DEG régulés négativement dans la comparaison du groupe H (G70 + Vaccin) par rapport au groupe C (Vaccin) ont été choisis pour confirmer les résultats du séquençage du transcriptome par RT-qPCR. L'ARN a été converti en ADNc en utilisant PrimeScript RT Master Mix (Takara) sur le thermocycleur T100 (Bio-Rad). Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau 3. La b-actine de poulet a été utilisée comme gène de contrôle interne. La RT-qPCR de gènes sélectionnés a été réalisée sur un système de PCR multiple en temps réel (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) avec le SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Une méthode quantitative relative (244CT) a été appliquée pour évaluer la variation de quantification. Tous les échantillons ont été réalisés en triple pour analyse.

Analyses statistiques

L'ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Duncan a été utilisée pour des comparaisons multiples entre groupes à l'aide du logiciel SPSS (version 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Les données sont exprimées sous forme de moyenne § SE. Une valeur de P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

RÉSULTATS Effet du b-glucane sur les titres d'anticorps sériques

Comme le montre la figure 1, les titres HI spécifiques au NDV ont diminué dans tous les groupes avant la vaccination et ont augmenté dans les groupes H (G70+Vaccin) et C (Vaccin) après la vaccination. Fait intéressant, des titres HI plus élevés ont été observés dans le groupe H (G70+Vaccin) à 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) et 42 (P > 0,05) jours que dans le groupe C (Vaccin).

Effet du b-glucane sur la prolifération lymphocytaire

L'effet du G70 sur la prolifération des lymphocytes du sang périphérique est représenté sur la figure 2A. L'IS dans les lymphocytes sanguins a été amélioré chez les oiseaux supplémentés avec G70 (vaccin G70 +) à 7 jours (P < 0,05) de la vaccination de rappel, par rapport au groupe vacciné. De plus, l’IS dans les lymphocytes jéjunaux était significativement augmenté 7 jours (P < 0,05) après l’immunisation de rappel par rapport au groupe Vaccin (Figure 2B).

Effet du b-glucane sur le rapport des cellules T CD4 + / CD8 + dans le sang périphérique 

Les figures 3A et 3B indiquaient le déclenchement des lymphocytes et des cellules CD3 + et les figures 3C à 3E montraient le rapport des lymphocytes T CD4 +/CD8 + dans le G70, groupes vaccin et solution saline, respectivement. Comme le montre la figure 3F, il n'y avait pas de différence remarquable entre le groupe Vaccin et le groupe Solution Saline après une vaccination de rappel (P > 0,05), alors que la proportion de CD4 +/CD{{12} } Les lymphocytes T étaient évidemment plus élevés dans le groupe G70 (G70 + Vaccin) que dans le groupe Vaccin (P < 0,05).

Figure 1. Effet de l'administration orale de b-glucane sur les titres d'anticorps sériques contre le vaccin NDV. Les données sont exprimées en moyenne § SE.

Expression génétique associée

Comme l'illustre la figure 4, augmentation significative de l'expression de l'ARNm du TGF-b (P < 0.05), de l'IL-6 (P < 0.{{13} }5), et TLR5 (P < 0.05) a été détecté dans la rate des poulets traités avec le G70 (vaccin G70 +), par rapport au groupe vaccin. Aucune différence significative n'a été trouvée dans l'expression de l'ARNm de l'IFN-g (P > 0,05), du TLR4 (P > 0,05) et du TLR3 (P > 0,05) dans la rate entre le G70 (vaccin G70 +) et le vaccin. groupes.

Analyse des données de séquençage d'ARN 

Le séquençage de l'ARN de 8 bibliothèques de rate a donné 24,1 G de données brutes, comme présenté dans le tableau S1 du matériel supplémentaire. CN signifie vaccin du groupe et HN signifie vaccin du groupe G70 +. Les bibliothèques C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 et H4 comprennent respectivement 45 591 492, 47 424 782, 46 193 492, 54 403 376, 47 118 476, 45 899 262, 45 841 884 et 45 504,43. 8 lectures originales. Après l'aptamère, les séquences ambiguës et les séquences de mauvaise qualité ont été supprimées, laissant 44 050 198, 45 449 884, 44 261 112, 52 097 846, 45 542 404, 44 566 290, 44 113 172 et 44 026 960 lectures propres. Plus de 96 % des lectures propres figuraient parmi les lectures originales, et 8 bibliothèques ont été comparées à l'aide de HISAT2 pour le séquençage des lectures par rapport à une base de données de référence constituée du génome de Gallus. De plus, les lectures propres ont été mappées sur cette base de données dans plus de 95 % des cas. Les bibliothèques spécifiques aux bibliothèques C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 et H4 étaient 40 921 384 (92,9 %), 41 302 100 (90,87 %), 40 771 075 (92,11 %), 46 905 784 (90,03 %), 42 444 112 (93,2 %). %), 40 213 444 (90,23 %), 40 922 895 (92,77 %) et 40 971 972 (93,06 %) lectures ont été attribuées uniquement à la base de données de référence, respectivement.

Gènes exprimés différemment

Comme l'indique la figure 5A, un total de 198 gènes exprimés de manière différentielle, dont 47 gènes régulés positivement et 151 gènes régulés négativement, ont été identifiés. Les DEG ont été décrits en détail dans le tableau supplémentaire S2. La figure 5B indique que les DEG ont une bonne reproductibilité des traitements.

Analyse de la classification de l'ontologie des gènes et de l'Encyclopédie de Kyoto sur l'enrichissement des gènes et des génomes

Les gènes qui sont des gènes différentiellement exprimés ont été classés en 3 catégories fonctionnelles principales basées sur le système de classification Gene Ontology (GO) : processus biologique, composant cellulaire et fonction moléculaire. Les 10 principaux termes GO dans les 3 catégories sont présentés dans la figure 6. Il y avait une prédominance de gènes impliqués dans la « réponse immunitaire humorale », « réponse aux chimiokines », « réponse humorale aux antimicrobiens », « réponse de défense contre la bactérie, " "réponse immunitaire à l'humeur antimicrobienne médiée par des peptides antimicrobiens", "réponse de défense contre les bactéries Gram-négatives" et "réponse de défense contre les bactéries Gram-positives" dans la catégorie des processus biologiques. De plus, dans la catégorie des fonctions moléculaires, un rapport remarquable des gènes était lié à la « liaison au récepteur de chimiokine à motif CC (CCR), à la « liaison au récepteur de chimiokine » et à la « liaison aux lipopolysaccharides ». En outre, « complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale », « complexe NADH déshydrogénase » et « chaîne respiratoire » étaient les termes enrichis les plus dominants dans la catégorie des composants cellulaires. Une analyse des voies de l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes a également été réalisée sur les gènes exprimés différentiellement. Les résultats suggèrent que les gènes étaient principalement regroupés en 7 voies, notamment « Interaction ligand-récepteur neuroactif », « Jonction Gap », « Voie de signalisation de la protéine kinase activée par le mitogène (MAPK), « Transporteurs ABC », « Biosynthèse des acides aminés » « Métabolisme des médicaments » et « Exportation des protéines ».

Figure 2. Effet de l'administration orale de b-glucane sur l'indice de stimulation lymphocytaire (IS). (A) Lymphocytes du sang périphérique ; (B) lymphocytes intestinaux. Les données sont exprimées en moyenne § SE.

Figure 3. Effet de l'administration orale de b-glucane sur le rapport cellulaire CD4+/CD8+ du sang périphérique. (A) Porte sur les lymphocytes ; (B) porte sur les cellules T CD3+ ; (C) fréquences des lymphocytes T CD3+ CD4 + CD8 + dans le groupe vaccin G70+ ; (D) fréquences des cellules T CD3+ CD4 + CD8 + dans le groupe Vaccin ; (E) fréquences des cellules T CD3+ CD4 + CD8 + dans le groupe Saline ; (F) diagramme à barres représentant le rapport CD4+/CD8+. Les données sont exprimées en moyenne § SE.

Figure 4. Effet de l'administration orale de b-glucane sur l'expression de l'ARNm dans la rate de poulet. Les données sont exprimées en moyenne § SE.

Figure 5. Résumé des données RNA-Seq. (A) Liste des gènes différentiellement exprimés, (B) carte de regroupement des DEG.

Vérification des gènes exprimés différentiellement par RT-qPCR

Les 6 DEG régulés à la hausse ou à la baisse ont été confirmés par PCR quantitative en temps réel. Le résultat suggère que les données RT-qPCR étaient généralement conformes aux données RNA-seq en général, indiquant un résultat de séquençage fiable (Figure 7). Expression de l'ARNm des gènes associés à la voie MAPK Comme le montre la figure 8, une diminution significative de l'expression de l'ARNm du FAS (P < 0.05) et de CACNA2 (P < 0.05) a été observée. détecté dans la rate des poulets du groupe G70 (G70 + Vaccin) par rapport au groupe Vaccin. De plus, une expression numériquement accrue de l'ARNm de DUSP5 et DUSP4 et une diminution numérique de l'expression de l'ARNm de p38, JNK et ERK ont été détectées dans le groupe G70 (vaccin G70 +) par rapport au groupe vacciné (P > 0,05). .

DISCUSSION

Le vaccin vivant contre la ND est largement inoculé dans les élevages de poulets, mais il existe encore des foyers sporadiques de maladie de Newcastle dans les troupeaux de volailles immunisés (Zhang et al., 2022). Les vaccins optimaux sont définis pour stimuler l’immunité cellulaire et muqueuse ainsi qu’une immunité humorale efficace (Shan et al., 2019). Par conséquent, une attention croissante a été accordée aux adjuvants susceptibles de conférer des réponses immunitaires muqueuses et cellulaires (Chen et al., 2014 ; Yu et al., 2015). Par rapport à la voie injectable, l’administration orale est une approche plus simple qui réduit les coûts et induit moins de stress pour les poulets de chair (Boyaka et al., 2003 ; Zhang et al., 2008). Les résultats de cette étude ont montré qu'un régime supplémenté en b-glucane augmentait remarquablement le niveau de titres HI spécifiques au NDV dans le sérum des poulets, ce qui concorde avec les rapports précédents (Horst et al., 2019). Les anticorps spécifiques du NDV sont essentiels au développement d’une réponse immunitaire humorale afin de protéger les poulets de l’infection par le NDV (Martinez et al., 2018 ; Li et al., 2020). Les lymphocytes B produisent des anticorps et les lymphocytes T se développent en réponse au mitogène (Bohacova et al., 2021). Dans la présente étude, l'indice de stimulation des lymphocytes du sang périphérique de poulet au NDV du groupe G70 était évidemment supérieur à celui du groupe vacciné, indiquant que davantage de lymphocytes T étaient activés. Les sous-populations prédominantes de lymphocytes T sont les lymphocytes T CD4 + et CD8 + (Cui et al., 2020). Les lymphocytes T CD4 + produisent principalement des cytokines et favorisent la maturation des lymphocytes B, tandis que les lymphocytes T CD8 + sont associés à la destruction des cellules cibles (Zhang et al., 2021b). Dans cette recherche, le ratio de lymphocytes T CD4 +/CD8 + détectés dans le groupe G70 augmentait clairement, ce qui suggère que le G70 pourrait activer davantage de lymphocytes T CD4 + du sang périphérique. De plus, nous avons observé un indice de stimulation des lymphocytes intestinaux significativement plus élevé dans le groupe G70 que celui du groupe Vaccin, ce qui a confirmé que le b-glucane pouvait également stimuler les lymphocytes intestinaux. Nos expériences précédentes ont confirmé que l’extrait de paroi cellulaire de levure PW220 augmentait significativement les cellules sIgA et IgA+ spécifiques de l’intestin (Bi et al., 2020). C’est-à-dire que le b-glucane G70 et le PW220 sont tous deux efficaces pour promouvoir l’immunité de la muqueuse intestinale.

Avantages du cistanche pour les hommes : renforcer le système immunitaire

Une amélioration de l’immunité des animaux grâce à l’administration de b-glucane a déjà été rapportée. Guo et coll. (2003) ont confirmé que l'administration de b-glucane améliorait l'indice de bourse et d'anticorps spécifiques du NDV chez les poulets. Levine et coll. (2018) ont suggéré que la supplémentation en b-glucane peut réguler positivement le CMH intestinal Ⅱ et augmenter le nombre de cellules CD45 + pour atténuer les lésions intestinales.

Li et coll. (2005) ont révélé que le b-glucane alimentaire pourrait réguler positivement les niveaux d'expression de l'ARNm de l'IL-8 et du TGF-b dans le tractus intestinal des porcs. Le mécanisme de l’effet immunomodulateur du b-glucane n’est pas clair. Kim et coll. (2010) ont montré que le b-glucane favorisait la maturation des cellules dendritiques en régulant positivement l'expression de CD40, CD80 et CD86. De plus, Lee et Kim (2014) et Su et al. (2020) ont rapporté que le b-glucane activait des récepteurs de reconnaissance de formes tels que le récepteur Dectin-1, le récepteur Toll-like et le CR3 (Baert et al., 2015). La rate est un organe essentiel pour initier la réponse immunitaire et joue un rôle essentiel dans l’immunité innée et acquise (Bronte et Pittet, 2013). Cependant, il existe peu de recherches basées sur l’analyse ARN-seq de l’expression de l’ARNm dans la rate après administration orale de polysaccharides de levure. Dans la présente étude, l'analyse des voies de l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes a suggéré que ces gènes étaient principalement regroupés en 2 voies, notamment « l'interaction neuroactive ligand-récepteur » et la « voie de signalisation MAPK ». Les récepteurs de reconnaissance de formes ciblant le b-glucane ont été enrichis à la surface des cellules immunitaires (Goodridge et al., 2009). Suite à la reconnaissance du b-glucane, la tyrosine kinase et le facteur nucléaire kappaB (NF-kappaB) ont été stimulés par ces récepteurs, entraînant l'induction de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et l'activation de réponses immunitaires (Kankkunen et al., 2010 ; Masuda et al. ., 2012 ; Xu et al., 2016 ; Bode et al., 2019). Le MAPK, en tant que famille de protéines kinases sérine-thréonine, joue un rôle crucial dans l'inflammation et la production de cytokines chez les poulets. Byun et coll. (2016) ont démontré que le b-glucane augmentait la production d'interféron-g et d'interleukine -2 et déclenchait des niveaux significativement plus élevés de phosphorylation de MAPK p38 dans les macrophages péritonéaux. Wang et coll. (2014) ont rapporté que le b-glucane atténue les réponses inflammatoires dans les cellules THP-1 en inhibant l'activation de p38 MAPK. Dans cette étude, 13 DEG, dont DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB et EGFR, ont été identifiés dans la voie de signalisation MAPK, ce qui suggère que le b-glucane pourrait réguler la réponse immunitaire. de la rate via MAPK chez les poulets. Le MAPK est une classe conservée de kinases Ser/Thr dans les cellules qui sont principalement impliquées dans les réponses cellulaires telles que la réponse immunitaire, l'apoptose et la prolifération. La famille MAPK comprend au moins 3 sous-familles : la kinase N-terminale c-Jun (JNK), la MAPK p38 et la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) (Hong et al., 2020 ; Zhang et al., 2021a). DUSP4 et DUSP5 sont des phosphatases à double spécificité qui inhibent spécifiquement l'activité des membres de la famille MAPK tels que p38, JNK et ERK, jouant un rôle régulateur important dans la prévention d'une réaction inflammatoire excessive et favorisant la régression de l'inflammation dans le corps (Imasato et al. ., 2002 ; Talreja et al., 2021). De plus, il a été rapporté qu'un petit ARN non codant nommé gga-miR-200a-3p supprime l'expression de facteurs pro-inflammatoires et régule ainsi la réponse auto-immune de l'hôte en régulant négativement la voie MAPK. et ses molécules de signalisation en aval (Pham et al., 2017). Dans la présente étude, l’analyse RT-qPCR a montré que l’expression de l’ARNm de P38, JNK et ERK diminuait et que l’expression de l’ARNm de DUSP4 et DUSP5 augmentait chez les poulets nourris au b-glucane (G70). Ces résultats suggèrent que l'effet immunostimulant du b-glucane (G70) sur le vaccin contre la maladie de Newcastle pourrait être lié à la régulation par rétroaction négative des facteurs pro-inflammatoires médiée par MAPK. De plus, le SAF est une substance essentielle qui médie l’apoptose et est vitale pour l’homéostasie immunitaire (Krueger et al., 2003 ; Guegan et Legembre, 2018). Pendant ce temps, CACNA2 est une sous-unité de canal calcique tension-dépendante, qui a un effet promotionnel sur la prolifération, la migration et l’invasion cellulaire (Sun et al., 2020). Dans cette étude, le FAS et le CACNA2 étaient significativement diminués chez les poulets supplémentés en b-glucane (G70), ce qui indique que le b-glucane (G70) exerce des effets de renforcement du système immunitaire principalement en inhibant l'apoptose des cellules immunitaires et en équilibrant l'auto-immunité. Ces résultats fournissent une référence théorique pour l’utilisation du b-glucane (G70) comme stimulateur immunitaire en milieu clinique. Cependant, le mécanisme par lequel le b-glucane améliore la réponse immunitaire par l’effet de rétroaction négative de la voie MAPK nécessite des preuves supplémentaires. Il est intéressant de noter que les gènes codant pour la cathélicidine comprenant CATH3, CATH1, CATH2 et les gènes codant pour la b-défensine, notamment AvBD6, AvBD7, AvBD1 et AvBD4, ont été nettement régulés négativement dans la comparaison H (vaccin du groupe G 70 +) vs contrôle (vaccin de groupe). Les peptides de défense de l'hôte (HDP) sont des molécules effectrices qui jouent un rôle crucial dans le système immunitaire inné (Cuperus et al., 2013). Ces peptides ont été découverts chez diverses espèces animales, des mammifères aux oiseaux. Il existe 4 cathélicidines chez les poussins, composées de CATH1, CATH2, CATH3 et CATHB1, qui tuent efficacement diverses bactéries (Hamad et al., 2017). Les bêta-défensines aviaires (AvBD), également appelées gallinacés, sont de petits peptides cationiques avec 3 liaisons disulfure de cystéine entre leurs résidus cystéine et jouent un rôle important dans le système immunitaire inné (Yoshimura, 2015). La réduction de l'expression des cathélicidines et de la bêta-défensine s'explique peut-être par une régulation par rétroaction, où les populations bactériennes et parabactériennes ont été réduites par les polysaccharides de la paroi cellulaire de levure (Bi et al., 2020). Des résultats similaires ont été révélés dans d’autres études. Shao et coll. (2016) ont montré que la supplémentation en b-glucane de levure chez le poulet à griller supprimait l'infection à Salmonella et diminuait l'expression des HDP via une analyse PCR quantitative en temps réel. Dans cette étude, un produit G70 principalement composé de b-glucane a augmenté le taux d'anticorps spécifiques du NDV dans le sérum, a augmenté l'indice de stimulation du NDV des lymphocytes du sang périphérique et des lymphocytes intestinaux et a favorisé la différenciation des lymphocytes T du sang périphérique en CD{{ 123}} Cellules T. De plus, l’analyse RNA-seq a montré que le G70 régulait positivement les expressions d’ARNm liées au récepteur de sérotonine couplé à la protéine G et au polypeptide du CMH de classe I et régulait négativement les expressions d’ARNm liées à la cathélicidine et à la bêta-défensine. Compte tenu de l'effet accru du G70 sur le vaccin ND chez le poulet, l'effet du G70 sur d'autres vaccins pour volailles, tels que le vaccin contre la grippe aviaire, peut être étudié plus en détail.

Figure 6. Analyse de la voie KEGG.

Figure 7. Confirmation RT-qPCR des candidats DEG sélectionnés. Les données sont exprimées en moyenne § SE.

Figure 8. Expression relative de l’ARNm dans la rate. L'ARN total a été extrait de la rate. La b-actine du poulet a servi de gène de contrôle interne. Les données sont exprimées en moyenne § SE.

LES RÉFÉRENCES

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt et E. Cox. 2015. Différences spécifiques au type de cellule dans la reconnaissance et la signalisation du b-glucane dans les cellules immunitaires innées porcines. Dév. Comp. Immunol. 48 : 192-203.

Ball, C., A. Forrester, A. Herrmann, S. Lemiere et K. Ganapathy. 2019. Immunité protectrice comparative fournie par les vaccins vivants du virus de la maladie de Newcastle ou du métapneumovirus aviaire lorsqu'ils sont co-administrés aux côtés de souches classiques et variantes du virus de la bronchite infectieuse chez des poussins de chair d'un jour. Vaccin. 37 : 7566-7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He et J. Ni. 2020. Le produit de paroi cellulaire de levure a amélioré la réponse intestinale des IgA et modifié les espèces de microflore du caecum après la vaccination orale chez les poulets. Poule. Sci. 99 : 6576-6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li et L. Cao. 2022. La paroi cellulaire de levure a régulé positivement les réponses immunitaires à médiation cellulaire au vaccin contre le virus de la maladie de Newcastle. Poule. Sci. 101 : 101712-101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd et PH Krammer. 2019. La liaison de la dectine-1 aux annexines sur les cellules apoptotiques induit une tolérance immunitaire périphérique via la NADPH oxydase-2. Cellule. Rep. 29 : 4435-4446.

Bohacova, P., J. Kossl, M. Hajkova, B. Hermankova, V. Holan et E. Javorkova. 2021. Différence entre les cellules B et T stimulées par les mitogènes dans la liaison non spécifique des anticorps conjugués à la R-phycoérythrine. J. Immunol. Méthodes. 493 : 113013-113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo et JR McGhee. 2003. Manipulation thérapeutique du système immunitaire : renforcement de l'immunité muqueuse innée et adaptative. Curr. Pharma. Conception. 9 : 1965-1972.

Bronte, V. et MJ Pittet. 2013. La rate dans la régulation locale et systémique de l'immunité. Immunité. 39 : 806-818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung et E. Byun. 2016. Le b-glucane irradié aux rayons gamma induit une immunomodulation et une activité anticancéreuse via les voies MAPK et NF-kB. J. Sci. Nourriture. Agr. 96 : 695-702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z Gao, R. Hou et X. Li. 2014. Effets du liquide oral de flavone de polysaccharide d'épimedium-propolis sur l'immunité muqueuse chez les poulets. Int. J. Biol. Macromol. 64 : 6-10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu et S. Hu. 2020. Réponses immunitaires améliorées grâce à l’analyse protéomique sérique du mouton hu au vaccin contre la fièvre aphteuse émulsionné dans un adjuvant d’huile végétale. Vaccins. 8 : 180-197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk et HP Haagsman. 2013. Peptides de défense de l'hôte aviaire. Dév. Comp. Immunol. 41 : 352-369.

Goodridge, HS, AJ Wolf et DM Underhill. 2009. Reconnaissance du bêta-glucane par le système immunitaire inné. Immunol. Apocalypse 230 : 38-50.

Guégan, J. et P. Legembre. 2018. Fonctions non apoptotiques de Fas/CD95 dans la réponse immunitaire. FEBS J 285 : 809-827.

Guo, Y., RA Ali et MA Qureshi. 2003. L'influence du bêta-glucane sur les réponses immunitaires chez les poussins de chair. Immunopharm. Immunol. 25 : 461-472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong et RA Dalloul. 2017. Expression comparative des peptides de défense de l'hôte chez les dindonneaux. Poule. Sci. 96 : 2083-2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin et MS Diarra. 2021. Le potentiel immunostimulateur des fruits et de leurs extraits chez la volaille. Devant. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj et YH Hong. 2020. La b-défensine 8 aviaire de poulet module la réponse immunitaire via les voies de signalisation de la protéine kinase activée par un mitogène dans une lignée cellulaire de macrophages de poulet. Poule. Sci. 99 : 4174-4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick et C. Hofacre. 2019. Effets du bêta- 1,3-glucane (AletaTM) sur la réponse vaccinale chez les poulets de chair. Poule. Sci. 98 : 1643-1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira et J. Li. 2002. L'inhibition de p38 MAPK par les glucocorticoïdes via l'induction de la MAPK phosphatase -1 améliore l'expression induite par l'influence d'Haemophilus non typable du récepteur Toll-like 2. J. Biol. Chimique. 277 : 47444-47450.

Kankkunen, P., L. Teiriläa, J. Rintahaka, H. Alenius, H. Wolff et S. Matikainen. 2010. Les (1,3)-bêta-glucanes activent à la fois la dectine-1 et l'inflammasome NLRP3 dans les macrophages humains. J. Immunol. 184 : 6335-6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim et S. Han. 2010. Activation des cellules dendritiques par le glucane isolé de l'ombilicaria esculenta. Immunitaire. Réseau. 10 : 188-197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann et PH Krammer. 2003. Le rôle du CD95 dans la régulation de l'apoptose périphérique des lymphocytes T. Immunol. Apocalypse 193 : 58-69.