Essai biologique pour surveiller l'effet anti-âge du traitement du sang de cordon

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Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Département de biotechnologie, Collège des sciences de la vie, Université CHA, Gyeonggi-do 13488, République de Corée

2. Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02114, États-Unis

3. Département de biologie des systèmes, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, États-Unis *Ces auteurs ont contribué à parts égales.

Auteur correspondant : Hakho Lee, PhD. Centre de biologie des systèmes, Hôpital général du Massachusetts, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, États-Unis. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, PhD. Département de biotechnologie, Collège des sciences de la vie, Université CHA, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, République de Corée. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

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Reçu : 2018.10.04 ; Accepté : 2018. 11. 18 ; Publié : 2019.01.01

Cistanche a un effet anti-âge

Résumé

Arrière plan: Le traitement d'animaux âgés avec du plasma à un stade de développement précoce (par exemple, du plasma de cordon ombilical) a montré un potentiel impressionnant pour ralentir la dégradation des fonctions neuronales et cognitives associée à l'âge. Traduire ces résultats en réalités cliniques nécessite cependant des moyens efficaces d'évaluer l'efficacité du traitement; les méthodes idéales doivent être peu invasives, se prêter à des tests en série, rentables et quantitatives.

Méthodes: Nous avons développé une nouvelle approche de biocapteur pour surveilleranti-âgethérapie. Nous avons avancé deux composants clés du capteur : i) un métabolite à diffusion hématogène a été identifié comme un marqueur de vieillissement de substitution ; et ii) un système d'analyse compact et rentable a été développé pour des applications sur site. Nous avons traité des souris âgées soit avec du plasma de cordon ombilical humain, soit avec une solution saline ; le profilage impartial des métabolites sur le plasma de souris a révélé que l'acide arachidonique (AA) était un indicateur puissant associé à laanti-âgeeffet. Nous avons ensuite implémenté un capteur magnéto-électrochimique compétitif (cMES) optimisé pour la détection AA directement à partir du plasma. La plate-forme développée pouvait détecter l'AA directement à partir de petits volumes de plasma (00,5 µL) en 1,5 heure.

Résultats : les tests cMES ont confirmé une forte corrélation entre les niveaux d'AA eteffet anti-âge: Les niveaux d'AA, tout en diminuant avec le vieillissement, ont augmenté chez les souris âgées traitées au plasma qui ont également montré une amélioration des performances d'apprentissage et de mémoire.

Conclusions : La plate-forme cMES permettra à la fois aux patients pré- et cliniquesanti-âgela recherche en permettant une surveillance longitudinale peu invasive du traitement ; ces capacités accéléreront le développement deanti-âgethérapies, améliorant la qualité de vie des individus.

Mots clés : Anti-âge, Acide arachidonique, Profilage métabolite, Capteur magnéto-électrochimique, Biocapteur

Introduction

Le vieillissement est de plus en plus reconnu comme un facteur de risque clinique de dégénérescence cognitive (p. ex., neurodégénérescence, démence) et d'autres maladies chroniques (p. ex., cancer, maladies cardiovasculaires, dégénérescence musculaire) [1]. Avec l'allongement de la durée de vie humaine et l'augmentation de la population âgée, des efforts importants sont en cours pour élucider les mécanismes du vieillissement [1–3] et pour trouver des stratégies thérapeutiques pour ralentir ou même inverser les processus de vieillissement [4]. En effet, des résultats prometteurs d'études animales ont été rapportés; des souris adultes ayant reçu une transfusion de plasma de jeunes souris ont retrouvé leurs fonctions cognitives, leur plasticité synaptique et leur activité neuronale [5]. Développement rapide dansanti-âgedes traitements et leur traduction en essais humains sont anticipés [6]. Les paramètres actuels pour surveiller les effets du traitement ont cependant une utilité limitée, car les méthodes sont souvent difficiles à appliquer avec les humains (par exemple, imagerie cérébrale invasive, observation du comportement contrôlé) et subjectives (par exemple, questionnaires sur les expériences des patients). Une condition essentielle pour progresseranti-âgethérapeutiques réside donc dans le développement de tests quantitatifs mini-invasifs pour le suivi des traitements.

Nous avons estimé que les métabolites seraient une source puissante deanti-âgebiomarqueurs. Les métabolites sont un phénotype essentiel dans un organisme et sont étudiés comme biomarqueurs diagnostiques pour d'autres maladies [7]. En particulier, le vieillissement est généralement associé à des changements ou à un dysfonctionnement métaboliques, qui affectent les profils globaux de métabolites dans les organismes. En tant que tel, il est concevable que le traçage de la composition et/ou des niveaux de métabolites éclaire l'efficacité deanti-âgetraitement. De plus, les dosages de métabolites, notamment sous forme de tests sanguins, pourraient être quantitatifs et peu invasifs ; ces mérites faciliteraient l'information de différents schémas thérapeutiques ou groupes de patients, et la surveillance de la dynamique (anti-)vieillissante par le biais d'échantillonnages en série.

Nous décrivons ici une nouvelle stratégie de biocapteur pour la surveillanceanti-âgetraitement. Deux éléments clés ont été avancés : i) un métabolite à diffusion hématogène a été identifié comme marqueur de vieillissement de substitution ; et ii) un système de test rapide et rentable a été développé pour des applications dans des contextes cliniques de routine. Plus précisément, nous avons traité une cohorte de souris âgées (environ 2 ans) avec du plasma de sang de cordon humain. Des analyses métabolomiques complètes sur le sang de souris ont révélé que l'acide arachidonique (AA), dont le niveau diminuait significativement avec l'âge, augmentait à l'inverse dans le groupe traité. Cette observation nous a conduit à concevoir un capteur magnéto-électrochimique pour de petites cibles moléculaires : nous avons optimisé une réaction électrochimique compétitive dans laquelle l'AA était capturé sur des billes magnétiques et concentré pour une plus grande sensibilité. La plate-forme développée pourrait détecter l'AA directement à partir de petits volumes de plasma (00,5 µL) en 1,5 heure. En utilisant cette plate-forme, nous avons pu établir une corrélation positive entre les taux sanguins d'AA et les meilleures performances des animaux dans la tâche motrice.

Résultats

Traitement des souris adultes avec du plasma de sang de cordon La figure 1a montre le schéma d'expérience global.

En tant qu'agent, nous avons utilisé du plasma dérivé d'échantillons de sang de cordon ombilical humain. Des études antérieures ont montré que des souris âgées ayant reçu une injection de plasma de jeune souris récupéraient la fonction de mémoire spatiale et que l'administration systémique de plasma de sang de cordon humain améliorait la cognition dépendante de l'hippocampe chez les souris âgées [5, 8]. L'injection de plasma, qui est dépourvu de composants cellulaires, a minimisé le risque de rejet immunitaire provenant d'une incompatibilité d'espèces. Des souris âgées (âge de départ, 18 mois) ont été randomisées et ont reçu du plasma (un groupe de traitement) ou un tampon salin (un groupe fictif) via une injection dans la queue (130 µL ; voir Fig. S1 pour plus de détails). Comme témoin positif, de jeunes souris (âgées de 3 mois) ont été utilisées. Le plasma dérivé du sang du cordon ombilical n'a pas été regroupé et chaque souris a été perfusée à plusieurs reprises avec du plasma du même donneur (Fig. S1). Après un traitement de 4- semaines, les souris ont été soumises à un test de comportement (c'est-à-dire rotarod) et du sang a été prélevé pour analyses.

Figure 1. Conception expérimentale. Du plasma de sang de cordon humain a été administré aux groupes jeunes (3- mois), âgés (20- et 23- mois) et traités au plasma (20- et 23- mois). Les trois groupes ont été soumis à des 2-tests Rotarod d'essai pour mesurer la coordination motrice et l'apprentissage. Le profilage non ciblé des métabolites a été réalisé sur le sang des trois groupes, et le plusanti-âge-la voie pertinente a été déterminée par une approche bioinformatique. Le biocapteur a été développé pour détecter le métabolite le plus important de la voie.

Figure 2. Détermination des biomarqueurs de métabolites associés au traitement au plasma de sang de cordon humain. (A) Profil global de la perturbation des métabolites. Les lignes correspondent aux caractéristiques (une combinaison unique de valeur m/z et de temps de rétention) de LC/MS et les colonnes aux échantillons. Les lignes sont regroupées hiérarchiquement. (B) Score plot de PCA pour la réduction dimensionnelle. Les échantillons ont été tracés par rapport à la composante principale (PC) 1 et 2. Les valeurs entre parenthèses des légendes des axes sont les proportions de variance expliquées par ces composantes. PC1 explique très probablement les effets anti-âge, étant donné que le groupe traité au plasma était beaucoup plus proche du groupe jeune que du groupe fictif. (C) Analyse d'enrichissement de la voie. Les métabolites ont été identifiés en faisant correspondre les valeurs m/z mesurées aux informations de masse moléculaire. Chaque cercle représente une voie spécifique trouvée. Pour une voie donnée, l'emplacement x ou la taille du cercle correspond à la centralité relative entre les métabolites (une mesure de l'impact de la voie), et l'emplacement ou la couleur y (valeurs p inférieures pour le rouge et supérieures pour le bleu) dans la mesure où quels métabolites sont surreprésentés. Les voies dominantes ont des valeurs x et y plus élevées. Ainsi, le métabolisme de l'acide arachidonique (AA) a été identifié comme la voie la plus probable pour expliquer laeffets anti-âgedu plasma sanguin de cordon.

Analyses métaboliques sur des échantillons de sang de souris

Nous avons d'abord effectué un profilage impartial des métabolites de petites molécules dans le plasma de souris. Des échantillons de sang des trois groupes de souris ont été soumis à des analyses par chromatographie liquide et spectrométrie de masse (LC/MS). Nous avons traité les données m/z par MAIT (boîte à outils d'identification automatique des métabolites) et identifié des caractéristiques statistiquement significatives via ANOVA (8572 combinaisons uniques de m/z et de temps de rétention) (Fig. 2a). L'analyse de clustering hiérarchique (HCA) des métabolites a révélé deux modèles clés : i) les profils des métabolites étaient distinctement différents entre les souris âgées (non traitées) et les jeunes souris ; et ii) le profil des souris âgées traitées au plasma était plus proche de celui des jeunes souris.

L'analyse en composantes principales (ACP) a révélé les structures inhérentes des données métabolomiques (Fig. 2b). Environ 50 % des variations totales étaient explicables par la première (PC1) et la deuxième composante principale (PC2). Les trois cohortes (c'est-à-dire les groupes jeunes, traités au plasma et fictifs) se sont installées à des positions discrètes, ce qui indique que des caractéristiques biologiquement pertinentes pour différencier les classes de groupe ont été identifiées. Fait intéressant, le groupe âgé traité au plasma s'est éloigné de l'imposture vers le groupe jeune. Pour quantifier la séparation des groupes, nous avons calculé le regroupement hiérarchique sur les deux composantes principales. Dans le dendrogramme, les groupes jeunes et traités au plasma étaient regroupés à un niveau de dissimilarité inférieur (ou à un niveau de similarité supérieur, 1120,9) que le groupe non traité (3162,5) (Fig. S2). Ces résultats indiquent que certaines caractéristiques (variables ou lignes de la Fig. 2a) peuvent être utilisées pour déduire un biomarqueur de métabolite pertinent pour le vieillissement etanti-âge. Nous avons annoté les caractéristiques avec des métabolites connus en utilisant une base de données dans le domaine public [9].

Nous avons en outre évalué les fonctions et l'interconnectivité des métabolites identifiés, en appliquant la cartographie KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [10]. Pour une voie donnée, nous avons mesuré i) la surreprésentation d'un métabolite candidat et ii) son importance (c'est-à-dire la centralité intermédiaire) [11] en tant que nœud intermédiaire clé entre les paires d'autres métabolites (voir Méthodes pour plus de détails). Nous avons constaté que le métabolisme de l'acide arachidonique (AA) était la voie la plus surreprésentée (la valeur y la plus élevée sur la figure 2c) et que les métabolites de cette voie avaient tendance à se localiser sur les voies de communication (valeurs x plus élevées sur la figure 2c) et régissent les flux d'informations. Parmi les nombreux métabolites du métabolisme de l'AA, nous avons sélectionné l'AA lui-même comme biomarqueur ; en tant qu'entrée de départ dans la voie, l'AA seul peut être un représentant d'autres métabolites perturbés.

Capteur magnéto-électrochimique compétitif (cMES) pour la détection d'AA dans le plasma

Nous avons ensuite entrepris de faire progresser un système de test rapide sur site pour la détection des AA. Nous avons choisi d'utiliser la technologie de détection magnéto-électrochimique [12-17]. Il combine l'enrichissement et la détection des cibles en une seule plate-forme : les billes magnétiques (MB) sont utilisées pour capturer et marquer les cibles moléculaires, et les cibles liées aux billes sont détectées par détection électrochimique. Cette approche présente de nombreux avantages pratiques : i) les échantillons natifs (plasma ou sang) peuvent être directement utilisés sans qu'il soit nécessaire de les purifier ; ii) le test atteint une sensibilité de détection élevée grâce à l'enrichissement magnétique et à l'amplification du signal enzymatique ; iii) sur la base du schéma de détection électrique, les capteurs peuvent être facilement miniaturisés en tant qu'appareil portable (Fig. 3a).

Cependant, la détection de l'AA par la détection magnéto-électrochimique a posé un défi technique ; l'AA étant une petite molécule (~304,5 Da), les dosages immunologiques utilisant une paire d'anticorps anti-AA étaient difficiles à appliquer. Nous avons donc exploré un format de test compétitif (cMES ; capteur magnéto-électrochimique compétitif) qui ne nécessitait qu'un seul anticorps AA (Fig. 3b). Pour la capture de cible, nous avons recouvert les MB d'anticorps AA (MBAb). Nous avons également préparé un agent concurrent (AA-HRP) en conjuguant AA avec une enzyme oxydante (peroxydase de raifort, HRP). Plus précisément, nous avons utilisé une forme haptène ; AA conjugué sur de l'albumine sérique bovine (BSA) et HRP conjugué en outre au support BSA (Fig. S3). Pour le test cMES, les échantillons de sang ont été mélangés avec MBAb et AA-HRP. La quantité d'AA-HRP était suffisante pour saturer les sites de liaison à l'AA dans MBAb (Méthodes). Cela conduirait à une charge HRP différentielle sur les MB, en fonction des quantités endogènes d'AA dans les échantillons. L'ajout séquentiel d'un médiateur d'électrons chromogène (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine, TMB) a généré un courant électrique qui a été lu par une électrode plane. Le temps de réaction pour la capture AA et l'incubation TMB a été optimisé pour maximiser le niveau de signal (Fig. S4).

Figure 3. Capteur magnéto-électrochimique compétitif (cMES) pour le dosage AA. (A) Schéma de l'appareil. Le dispositif cMES a un faible encombrement et offre

opérations sur place. (B) Nous avons conçu un test électrochimique compétitif pour la détection des AA. Des billes magnétiques (MBAb) ont été conjuguées avec des anticorps anti-AA.

Les échantillons témoins ne contenaient que de l'AA-HRP et ont été mélangés avec des billes magnétiques. Les échantillons de test ont été mélangés avec des billes magnétiques et de l'AA-HRP. (C) Courants électriques

mesurée par le lecteur cMES portable. Dans le test cMES, l'amplitude du courant diminue avec l'augmentation de la concentration en AA [AA]. Le signal de la commande

l'échantillon définit la ligne de base pour [AA]=0 ng/mL. La différence de courant (∆I) entre le contrôle et les échantillons de plasma ciblés a été utilisée comme mesure analytique. (RÉ)

Des quantités connues d'AA ont été dopées dans le sérum et mesurées par le cMES. La limite de détection était d'environ 126 ng/mL. (E) cMES et ELISA ont été comparés pour

concordance. Les résultats des deux modalités ont montré un bon accord (R2=0.959). Les données sont affichées sous forme de moyenne ± SEM à partir de mesures en triple.

Figure 4. Mesures AA dans des échantillons de plasma. (A) Analyse de l'évolution temporelle du niveau d'AA de la souris après l'injection de plasma. Nous avons injecté 13{{10}} μL de plasma (concentration en AA=7.2 µg/mL) à des souris (n=6) et collecté du sang de souris après 3, 7 et 14 journées. Les taux d'AA dans le sang des souris ont ensuite été surveillés. Les niveaux d'AA ont augmenté de manière significative au jour 3 et sont revenus au niveau normal après 7 jours. *p < 0.05 ;="" **p="">< 0.01 ;="" ***p="">< 0.001.="" (b)="" des="" échantillons="" de="" plasma="" de="" souris="" ont="" été="" analysés.="" dans="" le="" groupe="" témoin="" (n="5)," les="" jeunes="" souris="" (âgées="" de="" 5="" et="" 8="" mois)="" avaient="" des="" taux="" d'aa="" plus="" élevés="" que="" les="" souris="" âgées="" traitées="" de="" manière="" fictive="" (âgées="" de="" 20="" et="" 23="" mois ;="" n="8)." pour="" le="" groupe="" traité="" au="" plasma="" (n="5)," une="" augmentation="" soutenue="" de="" l'aa="" a="" été="" observée.="" *p="">< 0,05 ;="" **p="">< 0,01 ;="" ***p="">< 0,001.="" (c)="" des="" échantillons="" de="" plasma="" provenant="" des="" mêmes="" cohortes="" qu'en="" (b)="" ont="" été="" analysés="" par="" spectrométrie="" de="" masse.="" les="" niveaux="" d'aa="" ont="" montré="" une="" tendance="" similaire="" telle="" que="" mesurée="" par="" cmes.="" *p="">< 0,05 ;="" **p="">< 0,01 ;="" ***p="">< 0,001.="" les="" données="" sont="" affichées="" sous="" forme="" de="" moyenne="" ±="">

À la suite d'un dosage compétitif, l'amplitude du courant électrique a diminué avec des concentrations plasmatiques plus élevées d'AA ([AA]). Nous avons donc préparé un échantillon témoin en incubant MBAb avec AA-HRP uniquement. L'échantillon de contrôle a été utilisé pour définir la ligne de base supérieure (c'est-à-dire [AA]=0 ng/mL) pour calculer les différences de signal ; les courants électriques du contrôle et de l'échantillon de plasma ont été mesurés, et la différence nette |∆I |=|Icontrôle - Iplasma|a été obtenu (Fig. 3c). Tel

les mesures différentielles compensent également le signal de fond commun.

L'expérience de titrage (Fig. 3d) utilisant des échantillons dopés avec des quantités variables d'AA a révélé la limite de détection (LOD) à environ 125,9 ng/mL. La limite de détection du dosage était ~300- fois inférieure à la concentration typique d'AA (38 µg/ml) dans le plasma de jeunes souris (5 mois, n=2). Sur la base de ces résultats, nous avons dilué les échantillons de plasma initiaux (100- fois) en ajoutant une solution tampon (voir Méthodes). Le signal de la liaison non spécifique était proche d'un niveau de fond intrinsèque (~ 43 nA), bénéficiant potentiellement du facteur de dilution élevé. Nous avons également confirmé que les résultats du test correspondaient à ceux de l'ELISA conventionnel (R2=0.961, Fig. 3e). Le test cMES, cependant, était plus rapide (1 heure) que ELISA (4 heures), principalement en raison de la cinétique de liaison rapide ; dans le cMES, les MB capturent l'AA dans tout le volume de l'échantillon (3-diffusion dimensionnelle), tandis que la capture de l'AA repose sur la 1-diffusion dimensionnelle dans l'ELISA sur plaque.

Surveillance des AA chez les souris traitées au plasma

Nous avons appliqué le cMES pour analyser les niveaux d'AA chez les souris après un seul traitement au plasma. Étant donné que l'AA est naturellement présent dans le sang de cordon humain, l'injection de plasma augmenterait de manière additive les niveaux d'AA chez la souris. La concentration moyenne en AA de six plasmas de sang de cordon humain différents était de 7,2 ± 0,5 µg/mL (moyenne ± SEM). Nous avons injecté 130 µL de plasma de sang de cordon humain à des souris (n=6) et surveillé leurs niveaux d'AA (Fig. 4a). L'injection de plasma a immédiatement augmenté les taux sanguins d'AA (jour 3 ; p < 0,01,="" par="" rapport="" à="" tous="" les="" autres="" points="" dans="" le="" temps),="" mais="" l'effet="" a="" été="" temporaire ;="" les="" niveaux="" d'aa="" sont="" revenus="" à="" la="" normale="" 7 jours="" après="" le="" traitement="" (p="0.34," par="" rapport="" au="" moment="" précédant="" l'injection="" de="">

Nous surveillons ensuite les taux plasmatiques d'AA après le programme de traitement complet (Fig. S1). Trois cohortes de souris différentes ont été utilisées : un groupe d'âge traité au plasma (n=8) et un groupe d'âge factice (n=8) (20-23 mois), et un groupe témoin jeune (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Traitement au plasma conduisant à une amélioration cognitive et comportementale chez les souris âgées

Nous avons en outre évalué les phénotypes comportementaux de cohortes d'animaux, en évaluant en particulier leurs fonctions d'apprentissage moteur et de mémoire. Nous avons effectué des {{0}}tests rotatifs d'essai 1 et 4 mois après le traitement au plasma ou fictif (Fig. 5a) ; la latence (temps de course) d'une souris avant de tomber sur une tige rotative a été utilisée pour évaluer les performances motrices de l'animal. À 1 mois après le traitement (20-mois), la latence des groupes simulés et traités au plasma était significativement plus faible (p < 0,0001) que="" celle="" des="" jeunes="" (5-mois="" )="" groupe="" (fig.="" 5b).="" le="" groupe="" traité="" au="" plasma,="" cependant,="" a="" montré="" une="" amélioration="" progressive="" de="" l'apprentissage="" moteur="" et="" de="" la="" mémoire,="" alors="" que="" la="" même="" faculté="" a="" diminué="" dans="" le="" groupe="" fictif.="" les="" changements="" dans="" les="" niveaux="" d'aa="" ont="" suivi="" des="" changements="" de="" comportement,="" qui="" pourraient="" servir="" d'indicateur="" précoce="">anti-âgeeffet du traitement (Fig. 5c).

Les analyses des tissus cérébraux (Figs. 5d, 5e) ont montré que les souris âgées (le groupe fictif) avaient une plus petite surface de cellules DCX-positives dans la zone sous-ventriculaire que les jeunes souris. Inversement, la surface des cellules DCX-positives a augmenté chez l'animal traité au plasma et est restée inchangée (p=0.04) indiquant que le plasma de sang de cordon injecté a stimulé la neurogenèse du vieux cerveau. Les résultats suggèrent le bénéfice potentiel du traitement au plasma sur la neurogenèse soutenue qui a entraîné une amélioration de la fonction motrice dans le groupe traité.

Discussion

Les progrès des thérapies de rajeunissement augmentent simultanément le besoin d'une mesure objective et quantitative pour lire l'efficacité du traitement. Nous avons donc conçu notre étude pour identifier les biomarqueurs moléculaires qui peuvent mieux expliquer les caractéristiques phénotypiques du vieillissement etanti-âgetraitement. Nos expérimentations animales ont conduit aux observations suivantes : i) les profils de métabolites des cohortes de souris jeunes et adultes sont évidemment différents ; et ii) l'injection de plasma de cordon humain à des souris âgées modifie leurs modèles de métabolites plus près de ceux des jeunes souris. Fait intéressant, nous avons découvert que l'acide arachidonique (AA) était le biomarqueur de substitution le plus efficace pouranti-âgetraitement; Le métabolisme des AA était hautement non régulé chez les souris jeunes et traitées au plasma, et il s'est avéré qu'il jouait un rôle clé dans l'interaction avec d'autres voies métaboliques telles que le métabolisme de l'acide linoléique [10, 18].

Nous avons ensuite développé un système de capteur rapide et portable (cMES) pour faciliter la détection des AA dans les recherches de routine et les environnements cliniques. Nous avons spécifiquement intégré un schéma de test compétitif avec enrichissement immunomagnétique dans le but de détecter de petites cibles moléculaires (c'est-à-dire des métabolites) directement à partir d'échantillons de plasma. Cette combinaison apporte les avantages suivants. (i) Le test bénéficie d'une cinétique de liaison rapide, puisque les billes magnétiques capturent l'AA dans tout le volume de l'échantillon (3-diffusion dimensionnelle). (ii) Les processus de dosage (par exemple, les étapes de lavage) sont simplifiés avec des aimants externes utilisés pour la collecte des billes. (iii) En concentrant magnétiquement les billes liées à l'AA près de l'électrode de détection, le signal analytique global peut être amélioré (~ 72 %) [12]. En effet, nous avons montré que le test cMES utilise<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Figure 5. Essais comportementaux et moléculaires. (A) 2-Des tests Rotarod d'essai ont été effectués 1 et 4 mois après l'injection de plasma. (B) Le groupe traité au plasma

a montré une amélioration progressive de la coordination motrice; la performance était proche de celle du groupe jeune au final (deuxième essai à 3 mois). Le temps de course du groupe fictif a diminué avec l'âge. *p < 0.05 ;="" **p="">< 0.01.="" (c)="" pour="" le="" groupe="" traité="" au="" plasma,="" l'augmentation="" des="" niveaux="" d'aa="" a="" précédé="" l'amélioration="" de="" la="" fonction="" motrice.="" *p="">< 0.05 ;="" **p="">< 0,01 ;="" ***p="">< 0,001.="" (d)="" les="" cellules="" cérébrales="" de="" la="" zone="" sous-ventriculaire="" ont="" été="" immunocolorées="" pour="" un="" marqueur="" de="" neurogenèse,="" la="" doublecortine="">

La barre d'échelle est de 50 µm. Notez que le groupe fictif avait une surface significativement plus petite de cellules DCX-positives dans la zone sous-ventriculaire que les jeunes souris, alors que la surface a augmenté chez l'animal traité au plasma et est restée inchangée. (E) La zone des cellules DCX-positives dans l'image (D) a été mesurée. *p < 0.05 ;="" ***p=""><>

Il a été démontré que les AA favorisent la croissance musculaire et le développement du cerveau [19, 20]. D'autres rapports ont également souligné les avantages potentiels des AA dansanti-âge[21, 22]. La présente étude va dans le sens de ces résultats, mais sa portée s'est limitée à établir une relation corrélative entre les niveaux d'AA etanti-âgephénotypes. La surveillance en série de l'AA, cependant, a indiqué que les augmentations d'AA chez les souris traitées au plasma provenaient probablement de sources endogènes, et non de plasma transfusé. De plus, soutenuanti-âgedes effets ont été observés chez les souris receveuses même 4 mois après la fin du traitement au plasma. L'apprentissage moteur et les fonctions de mémoire se sont améliorés ; et le nombre de cellules précurseurs neuronales a augmenté dans le cerveau. Ces observations suggèrent fortement des changements physiologiques chez les souris traitées au plasma ; le mécanisme exact n'a pas encore été élucidé.

Plusieurs autres limites de cette étude devraient être abordées dans des recherches futures. Tout d'abord, le test cMES doit être affiné pour une plus grande précision. En particulier, en l'absence d'échantillons véritablement négatifs (c'est-à-dire d'échantillons sanguins sans aucun AA endogène), il était difficile de tenir compte des signaux provenant d'une liaison non spécifique. En théorie, l'effet des matrices sanguines peut être négligeable car nous avons dilué les échantillons par 100- fois. Une telle hypothèse, cependant, doit être validée en utilisant des échantillons de plasma délétés en AA qui pourraient être préparés à partir d'un modèle murin déficient en AA [23] ou par immunodéplétion des AA. Deuxièmement, nous nous sommes concentrés sur la détection d'un seul métabolite dans le métabolisme des AA pour plus de simplicité, mais cette approche peut ignorer le contexte biologique tel que les interactions entre les métabolites dans une voie donnée. L'inclusion d'un panel de métabolites permettrait de mieux saisir les perturbations métaboliques et d'augmenter également la précision du diagnostic. cMES peut être facilement mis à l'échelle pour détecter divers marqueurs tout en consommant de petites quantités d'échantillons. Troisièmement, l'interpolation des découvertes actuelles aux humains serait difficile. Bien que les souris et les humains partagent des voies métaboliques similaires, les souris ont un taux métabolique 7- fois plus élevé que les humains [24]. Des essais sur l'homme sont nécessaires pour déterminer les doses plasmatiques optimales pour la perfusion et pour établir des valeurs de référence pour les biomarqueurs ; informés par des études animales, nous prévoyons de telles études humaines. Ces efforts accéléreront le développement deanti-âgethérapeutiques, améliorant la qualité de vie des individus et réduisant les charges sociétales.

Méthodes

Conception expérimentale

Le plasma a été séparé du sang de cordon ombilical humain prélevé à l'accouchement. Le plasma de sang de cordon a été administré par perfusion intraveineuse à des souris âgées (18- mois), à des témoins fictifs (18- mois) et à de jeunes souris (3- mois comme positif contrôle) a été injecté avec une solution saline. À 1 et 4 mois après la transplantation, des tests 2- de rotarod d'essai ont été effectués pour évaluer la coordination motrice et la mémoire à long terme (Fig. S1). Le profilage des métabolites non ciblés a été effectué sur le sang des trois groupes et l'analyse bioinformatique a déterminé laanti-âgevoie pertinente (métabolisme de l'acide arachidonique). Le biocapteur a été développé pour détecter facilement et efficacement l'acide arachidonique circulant dans le sang.

Préparation d'échantillon de sang de cordon

Le sang de cordon humain a été prélevé par le comité d'examen institutionnel de l'hôpital général CHA (Séoul, Corée, IRB n° CHAMC-2015- 08-130-009). Du sang de cordon humain a été prélevé sur 4 donneurs et traité avec un anticoagulant citrate-phosphate-dextrose avec adénine (CPDA-1). Le plasma de sang de cordon humain a été isolé par centrifugation à 2,000 g pendant 15 min à température ambiante. Des échantillons de plasma isolés ont été stockés à -80 degrés et utilisés avec un seul cycle de congélation-décongélation à température ambiante.

Expérimentation animale

Les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université CHA (IACUC). Nous avons utilisé des souris femelles C57BL/6 de 18- mois pour évaluer les perturbations métaboliques et les phénotypes comportementaux en corrélation avec le vieillissement etanti-âge. Les témoins positifs étaient des souris C57BL/6 femelles âgées de 3- mois. Toutes les souris ont été élevées à température ambiante dans un cycle lumière-obscurité standard de 12 heures. Pour les souris adultes, le plasma de sang de cordon ou une solution saline (130 µL) a été injecté par voie intraveineuse 12 fois pendant 4 semaines. Le plasma de sang de cordon humain isolé n'a pas été regroupé et un animal donné a reçu du plasma de sang de cordon du même donneur. Le nombre d'animaux utilisés dans chaque expérience est décrit dans les sections de méthode correspondantes. Le plasma a été recueilli par centrifugation (3,000 g, 15 min à température ambiante).

Acquisition de métabolites et analyse de données

Pour le profilage des métabolites à diffusion hématogène, du sang a été prélevé sur les souris par ponction cardiaque aux moments désignés : le groupe jeune (3- mois, n=10), le groupe fictif ({{ 4}} mois, n=10 ; 23- mois, n=12), le groupe traité au plasma (20- mois, n {{13 }} ; 23-mois, n=5). Les échantillons de sang ont été analysés à l'aide d'un système de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) (Agilent). Nous avons converti les fichiers LC/MS au format mzXML standard (ProteoWizard) [25], puis les avons traités à l'aide de MAIT (boîte à outils d'identification automatique des métabolites) [26] pour la détection des caractéristiques, l'analyse statistique et l'identification des métabolites. Les caractéristiques statistiquement significatives (c'est-à-dire les métabolites ionisés et/ou fragmentés) ont été identifiées par analyse de variance (ANOVA). Ces caractéristiques ont été appariées à tous les métabolites putatifs possibles dans la base de données des métabolomes [9] sur la base du rapport masse/charge de l'ion spectral de masse (tolérance m/z de 0.005). Nous avons caractérisé les altérations globales des métabolites via une analyse de clustering hiérarchique et les structures inhérentes des données métabolomiques via une analyse en composantes principales (ACP). Deux ou trois répliques techniques (garantissant que la variation technique est beaucoup plus petite que la variation biologique) par souris ont été incluses dans l'apprentissage non supervisé tel que l'ACP et le regroupement hiérarchique. Le clustering hiérarchique sur les composants principaux (HCPC) a été réalisé par FactoMineR, un package R [27]. Pour une analyse fonctionnelle, les voies métaboliques les plus susceptibles d'être perturbées par le vieillissement et le traitement au plasma ont été déterminées via l'analyse des voies KEGG (MetaboAnalyst 3.0) [28]. La distribution hypergéométrique a été utilisée pour mesurer la surreprésentation des métabolites appariés dans les voies KEGG spécifiques.

Préparation de billes immunomagnétiques

Des billes magnétiques (5 mg) recouvertes de groupes époxy (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen) ont été mises en suspension dans 100 µL de solution de phosphate de sodium 0,1 M. Cent microgrammes d'anticorps contre l'acide arachidonique (Biomatik) ont été ajoutés et soigneusement mélangés. Cent microlitres de solution de sulfate d'ammonium 3 M ont été ajoutés, et le mélange a été incubé à température ambiante pendant 2 heures, puis incubé davantage à 4 degrés pendant une nuit avec une rotation d'inclinaison lente. La réaction de conjugaison a été réalisée à pH=7.4. Ces processus induisent la formation d'une liaison covalente entre les groupes époxy (bille) et amine (anticorps), ce que nous avons précédemment confirmé en soumettant des conjugués anticorps-bille à des tests de pH [29]. En moyenne, 2,4 x 104 anticorps ont été immobilisés par bille. Les billes magnétiques conjuguées à l'anticorps ont été séparées avec un aimant permanent, lavées deux fois avec une solution de PBS et remises en suspension dans 200 µL de PBS avec 1 % de BSA. Les perles ont été stockées à 4 degrés jusqu'à un mois.

Conjugaison HRP à l'acide arachidonique

La HRP a ensuite été conjuguée à la BSA via une chimie d'amination réductrice. Plus précisément, 100 µg d'AA conjugué à la BSA (RPU51089, Biomatik) a été dissous dans 0,5 mL de tampon carbonate-biocarbonate 0,2 M (pH 9,4), ajouté à un milligramme d'EZ-link lyophilisé. Plus Activated Peroxydase (Thermo Scientific), et incubé pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, 10 µL de cyanoborohydrure de sodium (Thermo Scientific) ont été ajoutés et le mélange a été incubé pendant 15 min à température ambiante. Enfin, 20 µL de tampon Quenching (Thermo Scientific) ont été ajoutés, suivis d'une incubation de 15 min à température ambiante. L'électrophorèse sur gel et l'analyse des bandes protéiques ont confirmé la conjugaison HPR à BSA-AA (Fig. S3a). Les AA conjugués à la HRP ont été recueillis et concentrés avec un filtre centrifuge Amicon Ultra 100K (Millipore). La peroxydase restante et la BSA-AA ont été lavées quatre fois avec du PBS.

Détection électrochimique des AA dans les échantillons de plasma

Pour la détection électrochimique des AA, du sang a été prélevé sur les jeunes (n {{0}}), les groupes fictifs (n=8) et les groupes traités au plasma (n=5 pendant 1 mois et n=5 pendant 3 mois). Des échantillons de plasma de souris (0 0,5 µL) ont été dilués dans 50 µL de BSA à 1 % dans du PBS (dilution ×100-) et mélangés avec une solution de billes immunomagnétiques (50 µL) et une solution d'AA conjuguée à la HRP (50 µL). La quantité d'AA-HRP était suffisamment importante pour saturer les sites de liaison dans les billes magnétiques. Nous avons utilisé environ 8,4 × 107 billes par test, ce qui a rendu disponibles 2,0 × 1012 sites de liaison AA. La quantité d'AA-HRP était d'environ 1,7 × 1013 ; le rapport entre l'AA-HRP et les sites de liaison était d'environ 8:1. Le mélange a été incubé à température ambiante pendant 1 heure avec une rotation d'inclinaison lente. La bille témoin a été préparée en mélangeant 1 % de BSA dans du PBS (50 µL) avec une solution de billes immunomagnétiques (50 µL) et une solution d'AA conjuguée à la HRP (50 µL). Toutes les billes ayant réagi ont été séparées avec un aimant permanent et lavées deux fois avec 80 µL de PBS (1 % de BSA). Enfin, les billes ont été remises en suspension dans 7 µL de PBS. La solution de billes préparée et 20 µL de solution TMB (Biomatik) ont été chargés sur le dessus de l'électrode. Après 6 min, la mesure de chronoampérométrie a commencé. Nous avons utilisé un capteur électrochimique miniaturisé (un système prototype développé par AcurreHealth Inc.). Les niveaux actuels dans la plage de 40-45 s ont été moyennés. Nous avons utilisé le facteur de conversion (×100) pour rapporter les concentrations initiales estimées d'AA dans le plasma.

Dosage immuno-enzymatique (ELISA)

Les expériences ELISA ont été réalisées à l'aide du kit ELISA d'acide arachidonique (AA) de souris (Biomatik) conformément aux directives de fabrication. Des AA dilués en série ont été ajoutés dans chaque puits et incubés avec des AA conjugués à la HRP à 37 degrés pendant 40 min. Après quatre lavages avec du tampon de lavage, une solution de TMB a été ajoutée et incubée pendant 20 minutes. Le développement de la couleur a été arrêté en ajoutant une solution d'arrêt. L'absorbance a été lue à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Tecan).

Essai Rotarod

Nous avons modifié le test Rotarod de Kong et al. [30] pour évaluer la coordination locomotrice. Le rotarod avec une tige de 3- cm de diamètre a démarré à 4 tr/min et a accéléré de 4 tr/min par 30 secondes pendant 5 min. Les souris ont été placées sur la tige et le temps mis par les souris pour tomber de la tige a été mesuré. Chaque souris a reçu 3 essais par jour et les temps de course de chaque jour ont été calculés comme la moyenne des temps de formation. Le premier test rotarod a été effectué 1- mois après le traitement au plasma : le groupe jeune (n=29), le groupe fictif (n=17), le groupe traité au plasma (n {{ 11}}). Une session de recyclage a été lancée 4- mois après le traitement au plasma. Pour éviter le surentraînement, un recyclage a été effectué pendant 2 jours. L'autre procédure était la même que la première session.

Imagerie des tissus cérébraux

1 mois (n=4) et 4 mois (n=3) après l'injection de plasma sanguin de cordon humain ou d'une solution saline, les animaux ont été euthanasiés puis perfusés avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et du PBS à travers le ventricule gauche. Les groupes jeunes (n=5) et fictifs (n=4) ont été utilisés comme témoins. Leur cerveau était

extrait et cryoprotégé. Chaque cerveau a été sectionné sur un cryotome à une épaisseur de 30 µm. À

effectuer l'immunohistochimie, la liaison non spécifique a été bloquée avec 5 % de sérum de chèvre normal dans 0.3 % de Triton X-100 pendant 40 min. L'anticorps primaire contre Doublecortin (DCX; 1: 400, Cell Signaling, # 4604S) a été appliqué pendant une nuit à 4 degrés, puis du PBS a été utilisé pour le lavage [31]. L'anticorps secondaire Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) a été utilisé pour la détection de DCX. Les images ont été prises à l'aide d'un microscope à fluorescence (Nikon Eclipse 80i) et analysées à l'aide de l'image J [32].

analyses statistiques

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide des fonctions de base R et de lme4, un package R pour Linear

Modèles à effets mixtes ou modèle linéaire généralisé

(GLM) suivi d'un test post-hoc LSD [33]. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± erreur standard et une valeur p <0.05 a="" été="" considérée="" comme="">

Matériel complémentaire

Chiffres supplémentaires.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Remerciements

Nous remercions AccureHealth Inc. pour avoir fourni le capteur électrochimique miniaturisé. Cette étude a été financée en partie par la subvention de l'Institut pour la promotion des technologies de l'information et des communications (IITP) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (2017M3A9B4025699).

Intérêts concurrents

Les auteurs ont déclaré qu'il n'existe aucun intérêt concurrent.