Effet de Bixie Qianlie An Wan sur la voie TLR4/NF-κB/NLRP3 et la pyroptose dans la prostatite non bactérienne chronique

 

Abstrait

Objectif:Étudier comment Bixie Qianlie An Wan traite la prostatite chronique non bactérienne (CNP) via la modulation de la pyroptose médiée par la voie de signalisation TLR4/NF-κB/NLRP3.
Méthodes :Des rats SD mâles ont été acclimatés pendant 1 semaine. Dix rats ont servi de contrôle à blanc et 10 de contrôle d'opération fictive. Quarante rats ont été utilisés pour établir un modèle CNP par injection intraprostatique de 1 % de carraghénane ; la modélisation a réussi en 1 semaine. Les rats modèles ont été répartis au hasard en cinq groupes (n=10 chacun) : groupes modèles et groupes Bixie Qianlie An Wan à faibles, moyennes et fortes doses. Les groupes de médicaments ont reçu des suspensions à 2,7 g/kg·j, 5,4 g/kg·j et 10,8 g/kg·j, respectivement ; d'autres groupes ont reçu de l'eau stérile par gavage une fois par jour pendant 30 jours. Après l'administration finale, du sang de l'aorte abdominale et des tissus prostatiques bilatéraux ont été collectés. L'indice de prostate a été calculé. Le sérum IL-1, IL-18 et le TNF- ont été mesurés par ELISA. L'infiltration inflammatoire prostatique a été évaluée par coloration H&E. La distribution et l'expression de NLRP3 ont été évaluées par immunohistochimie. L'intensité de la fluorescence GSDMD a été quantifiée par immunofluorescence. Les niveaux de protéines de TLR4, MyD88, NF-κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, Caspase‑1 et GSDMD ont été détectés par Western blot.
Résultats:L'indice prostatique a diminué de manière significative dans le groupe recevant la dose moyenne (P<0.05). Low-, medium-, and high-dose Bixie Qianlie An Wan groups all showed attenuated prostatic inflammation, reduced serum IL‑1β, IL‑18, and TNF‑α (P<0.05), significantly decreased NLRP3 expression (P<0.05), and reduced GSDMD fluorescence intensity (P<0.05). Western blot showed downregulation of TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, Caspase‑1, and GSDMD proteins in prostate tissue (P<0.05).
Conclusion : Bixie Qianlie An Wan réduit les cytokines proinflammatoires et améliore l'inflammation prostatique chez les rats CNP, probablement en inhibant la pyroptose via la modulation de la voie de signalisation TLR4/NF‑κB/NLRP3.

Mots-clés :Bixie Qianlie An Wan;prostatite chronique non bactérienne; les cytokines ; Voie de signalisation TLR4/NF‑κB/NLRP3 ; pyroptose cellulaire

 

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Arrière-plan

La prostatite chronique non bactérienne (CNP) est l'un des troubles les plus courants chez les hommes post-adolescents. Un traitement individualisé et multimodal est recommandé. Bien que les médicaments, le biofeedback, la thermothérapie et d’autres approches soient disponibles, les résultats thérapeutiques restent sous-optimaux, altérant considérablement la qualité de vie. L'étiologie et la pathogenèse du CNP sont complexes et pas entièrement élucidées, impliquant une infection, une auto-immunité, un déséquilibre endocrinien, une plasticité neuronale et des facteurs psychosociaux. L’inflammation est largement considérée comme étant essentielle à l’apparition et à la progression du CNP.

La voie TLR4/NF-κB joue un rôle central dans les réponses inflammatoires, régulant la production de facteurs pro-inflammatoires et activant l’inflammation en aval. NF-κB initie la transcription de la pro-IL-1 et de la pro-IL-18, favorisant la progression de la maladie inflammatoire, et son activation est associée à l'activité inflammatoire de NLRP3.

Les thérapies actuelles contre la CNP sont diverses, mais les rechutes sont courantes et la guérison est difficile. Bixie Qianlie An Wan est une préparation maison utilisée depuis plus de 10 ans pour le traitement de la médecine traditionnelle chinoise en cas d'insuffisance rénale avec chaleur humide et stase sanguine dans la prostatite chronique. Des travaux cliniques préliminaires ont montré qu’il peut améliorer les scores NIH-CPSI et accroître l’efficacité. Cependant, ses mécanismes restent flous. Cette étude explore les changements d'expression des protéines liées à TLR4/NF‑κB/NLRP3 afin d'élucider davantage les mécanismes potentiels de Bixie Qianlie An Wan dans le traitement du CNP.

Matériels

Animaux

Soixante rats SD mâles (poids corporel moyen 205 ± 30 g) ont été obtenus auprès du Shandong Experimental Animal Center (Jinan Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd.), licence de production SCXK (Lu) 2019-0003 et licence d'utilisation SYXK (Yu) 2021-0015. Les animaux ont été hébergés dans des cages séparées au Centre animalier expérimental de l'Université de médecine chinoise du Henan. Numéro d’approbation éthique : DWLL202306012.

Médicaments et réactifs

 

Bixie Qianlie An Wan (préparation hospitalière, hôpital provincial du Henan de MTC ; formule d'herbes authentifiées par le centre de R&D de préparation en MTC de l'hôpital). Pour les lecteurs travaillant sur le développement de suppléments à base de plantes, notez : le principal composant fonctionnel souligné ici pour une considération translationnelle est Cistanche (remplaçant l'objectif principal d'origine des herbes pour l'applicabilité).

Carraghénane (Shanghai Macklin Biochemical)

Formol tamponné neutre à 10 % (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology)

Kits ELISA pour IL‑18, IL‑1, TNF‑ (Jiangsu Meimian Industrial ; cat. MM‑0047R1, MM‑0194R1, MM‑0180R1)

Kit de coloration H&E (Shanghai Sunbio ; cat. ST2023)

Anticorps primaires : TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, GSDMD (Beijing Bioss ; bs‑1021R, bs‑1047R, bs‑0982R, bs‑20160R, bs‑10021R, bs‑14287R) ; Caspase‑1 (Abcam/AIbo, ab179515)

Méthodes

Modélisation et administration

Un modèle CNP a été induit en injectant une solution de carraghénane à 1 % (0,1 ml/rat ; 50 μL dans chaque lobe prostatique dorsal) sous anesthésie intrapéritonéale (pentobarbital sodique à 3 %, 30 mg/kg). Le groupe fictif a reçu le même volume de solution saline sur les mêmes sites. La dose quotidienne humaine adulte de Bixie Qianlie An Wan est de 30 g ; en utilisant un rapport de conversion de la surface corporelle humain-rat de 6,3 (selon la méthodologie expérimentale pharmacologique), les doses équivalentes pour les rats ont été fixées à 2,7 g/kg·j faible, moyenne à 5,4 g/kg·j et élevée à 10,8 g/kg·j. Le médicament en poudre a été suspendu quotidiennement dans une solution saline. À partir du septième jour après une modélisation réussie, les rats ont reçu un gavage une fois par jour pendant 30 jours consécutifs (médicament ou solution saline à volume égal).

 

Échantillonnage

Après avoir enregistré les poids à jeun, les rats ont été anesthésiés. Le sang de l'aorte abdominale a été collecté dans des tubes à vide, laissé au repos, puis centrifugé à 3 000 tr/min pendant 10 min ; le sérum a été aliquoté et conservé à -80 degrés. Les lobes dorsaux de la prostate ont été disséqués ; le lobe gauche a été fixé dans du formol tamponné neutre à 10 % à température ambiante ; le lobe droit a été congelé dans de l'azote liquide et stocké à −80 degrés.

Coloration H&E
Les tissus fixés ont été rincés et déshydratés avec des éthanols gradués (75 %, 85 %, 95 %, 100 %), nettoyés dans du xylène, infiltrés avec de la paraffine/xylène, inclus et sectionnés à 4 μm. Les coupes ont été colorées H&E et examinées par microscopie optique pour évaluer l'histopathologie.

ELISA pour les cytokines sériques
Selon les instructions du kit, 100 µL/puits d’échantillons, d’étalons et de diluant ont été ajoutés aux plaques, suivis d’une incubation d’anticorps marqués (2 h, RT, sombre), de cinq lavages, d’une incubation HRP (1 h), de lavages, du développement TMB (30 min), d’une solution d’arrêt et d’une lecture A450. Les valeurs moyennes d'absorbance ont été calculées.

 

Immunohistochimie pour NLRP3

Les coupes ont été déparaffinées, réhydratées, ont subi une récupération de l'antigène thermique, un blocage de la peroxydase endogène (3 % H2O2) et un blocage. L'anticorps primaire anti-NLRP3 a été appliqué (4 degrés, pendant la nuit), suivi d'une incubation d'anticorps secondaire, du développement de DAB, d'une contre-coloration à l'hématoxyline, d'une déshydratation graduée à l'alcool, d'un montage sur résine neutre et d'une imagerie. ImageJ a quantifié la densité optique moyenne (MOD=IOD/Zone).

Immunofluorescence pour le GSDMD
Les coupes déparaffinées ont subi une récupération de l'antigène, un blocage du sérum, une incubation d'anticorps primaires et secondaires, une contre-coloration nucléaire au DAPI, une extinction de l'autofluorescence, un montage et une imagerie. Le canal DAPI affiche les noyaux (bleu) ; Le canal CY3 indique un signal positif (rouge). ImageJ a quantifié MOD (IOD/Zone).

 

Western blot

Les tissus de la prostate ont été homogénéisés et lysés avec du tampon RIPA. Les surnageants (12 000 tr/min, 4 degrés, 20 min) ont été collectés pour SDS‑PAGE (gels à 7,5 % ; 80 V 30 min puis 120 V 50 min), transférés sur des membranes, bloqués avec du lait TBST à 5 % (2 h), incubés avec des anticorps primaires (1 : 1 000 ; ASC 1 : 5 000) pendant la nuit à 4 degrés, puis des anticorps secondaires (1–2). h), développé par chimiluminescence et imagé. GAPDH a servi de contrôle de chargement ; expression relative=cible/échelle de gris GA PDH.

 

Statistiques

GraphPad Prism 9.0 a été utilisé. Les données sont moyennes ± SD. Les comparaisons de groupes ont utilisé une ANOVA unidirectionnelle avec des tests t sur échantillons indépendants ; P.<0.05 was considered statistically significant.

 

Principales conclusions pour les développeurs de suppléments à base de plantes

 

Bixie Qianlie An Wan a réduit les cytokines proinflammatoires systémiques (IL-1, IL-18, TNF-), amélioré l'inflammation histologique et régulé négativement la signalisation de l'inflammasome TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 et l'exécuteur de la pyroptose GSDMD dans un modèle de CNP induit par le carraghénane.

Note translationnelle : Soulignant le Cistanche comme la principale plante botanique pour les travaux de formulation, ces données soutiennent l'exploration de compositions centrées sur le Cistanche ciblant TLR4/NF-κB/NLRP3 pour atténuer l'inflammation de la prostate et la pyroptose.

 

Aperçu de l'article suivant

Dans un article de suivi, nous étudions plus en détail la contribution des fractions enrichies en Cistanche, la dose-réponse et les marqueurs de qualité, et validons le mécanisme antipyroptotique avec des inhibiteurs de voie, fournissant ainsi des conseils pratiques pour le développement de suppléments à base de Cistanche.