La calpastatine prévient les lésions des podocytes médiées par l'angiotensine II grâce au maintien de l'autophagie
Mar 17, 2022
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Imane Bensaada1,3, Blaise Robin1,3, Joe¨lle Perez2, Yann Salemkour1, Anna Chipont1, Marine Camus1,Mathilde Lemoine1, Léa Guyonnet1, Hélène Lazareth1, Emmanuel Letavernier2, Carole Hénique1,Pierre-Louis Tharaux1et Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France ; et2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Paris, France
La forte valeur prédictive de la protéinurie dans les pathologies glomérulaires chroniques est solidement établie ainsi que le rôle pathogène de l'angiotensine II favorisant la progression de la maladie glomérulaire avec altération de la barrière de fi-filtration glomérulaire, lésion des podocytes et cicatrisation des glomérules. Ici, nous avons constaté que l'hypertension chronique induite par l'angiotensine II inhibaitautophagieefflux dans les glomérules de souris. La suppression d'Atg5 (un gène codant pour une protéine impliquée dans l'autophagie) spécifiquement dans le podocyte a entraîné une podocytopathie accélérée induite par la dangiotensine II, une albuminurie accentuée et une glomérulosclérose. Cela indique que l'autophagie est un mécanisme de protection clé dans le podocyte dans cette condition. L'activité de la calpaïne induite par l'angiotensine-II dans les podocytes inhibeautophagieefflux. Podocytes de souris avec expression transgénique de l'inhibiteur endogène de la calpaïnecalpastatinepodocyte supérieur affichéautophagieau départ qui était résistant à l'inhibition dépendante de l'angiotensine II. De plus, une autophagie soutenue aveccalpastatinedommages limités aux podocytes et albuminurie. Ces résultats suggèrent que l'hypertension a des effets pathogènes sur la structure et la fonction glomérulaire, en partie par l'activation des calpaïnes conduisant au blocage de l'autophagie des podocytes. Ces résultats mettent en évidence un mécanisme original par lequel l'hypertension médiée par l'angiotensine II inhibe l'autophagie via le recrutement induit par le calcium de calpaïne avec des conséquences pathogènes en cas de déséquilibre parcalpastatineactivité. Ainsi, la prévention d'une diminution médiée par la calpaïneautophagiepeut être une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse pour les néphropathies associées à une activité élevée du système rénine-angiotensine.
MOTS CLÉS : angiotensine II ;autophagie; calpastatine; hypertension; podocyte
Déclaration de traduction
Etant donné le rôle crucial de l'autophagie dans le développement deun reinmaladies, modulation pharmacologique deautophagiepourrait être une stratégie prometteuse pour la prévention et le traitement de plusieursun reinmaladies. En parallèle, la suractivation de l'activité de la calpaïne dans les podocytes s'est avérée avoir des effets néfastes sur la fonction des podocytes alors que ses mécanismes d'action délétères n'ont pas été identifiés. Ici, nous apportons la preuve que la calpaïne lie l'action délétère de l'angiotensine II au blocage préjudiciable deautophagiedans les podocytes et suggèrent que l'inhibition de la calpaïne pourrait être une cible thérapeutique prometteuse pour les maladies des podocytes, en partie grâce au maintien de l'autophagie des podocytes.
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Après le diabète, l'hypertension est l'une des principales causes de maladies chroniques progressives.un reinmaladie1–3 et même une légère élévation de la pression artérielle est un facteur de risque indépendant d'insuffisance rénale terminale.4 Un nombre croissant d'études expérimentales ont mis en évidence l'importance des podocytes dans le développement deun reinblessure. La perte progressive de podocytes et les altérations microvasculaires apparaissent tôt avec le déclin fonctionnel du rein dans la néphropathie hypertensive expérimentale.5 Chez les patients, l'excrétion urinaire de podocytes viables s'est avérée être un marqueur sensible et spécifique de la prééclampsie,6,7 et les patients atteints de néphrosclérose avaient une plus faible densité de podocytes glomérulaires queun reindonneurs.8,9 De plus, le rôle pathogène de l'angiotensine II (AngII) favorisant la progression de la maladie glomérulaire est bien établi, non seulement dans les conditions hypertensives mais également dans plusieurs maladies glomérulaires.10–21
L'hypertension glomérulaire entraîne un étirement capillaire glomérulaire, des lésions endothéliales et une filtration élevée des protéines glomérulaires provoquant un collapsus glomérulaire et une glomérulosclérose. Il exerce également une action directe sur les structures glomérulaires, provoquant des réponses de régulation de signalisation visant à compenser. Un système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) systémique et local activé favorise l'hyperplasie mésangiale et la synthèse de facteurs de perméabilité vasculaire. Simultanément, les podocytes affichent une signalisation calcique22,23 et modifient leur forme lors de la stimulation dépendante du récepteur AngII de type 1 (AT1).24–28 Ces mécanismes adaptatifs deviennent inadaptés à long terme, conduisant finalement à la glomérulosclérose. L'AT1 assure la médiation d'une implication importante du RAAS pour la pression artérielle et l'homéostasie du sel et de l'eau. Les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine et les bloqueurs AT1 sont utilisés en clinique pour le traitement de l'hypertension et de l'insuffisance cardiaque chez les patients. Fait intéressant, les deux bloqueurs montrent également un effet protecteur surun reinfonction.
L'autophagie s'est avérée essentielle pour le maintien de l'homéostasie cellulaire, en particulier dans les cellules postmitotiques29,30 et notamment dans les podocytes.31–34Autophagieest un système de dégradation associé aux lysosomes pour les protéines cytoplasmiques à longue durée de vie et les organelles dysfonctionnelles35,36 et implique la séquestration des protéines et des organites dans les autophagosomes. La formation d'autophagosomes dépend de l'induction de plusieurs gènes dont Map1lc3a/b, Beclin 1 et Tags. 37 Il existe de plus en plus de preuves que la dérégulation de la voie autophagique est impliquée dans la pathogenèse du vieillissement rénal et plusieursun reinmaladies telles que les lésions rénales aiguës, la polykystose rénale, le vieillissement et la néphropathie diabétique.31,32,38–41
Régulation deautophagiedans les podocytes, physiologiques et surtout dans un contexte pathologique, est mal connue. Nous avons récemment démontré que l'autophagie des podocytes est indépendante de la cible mécaniste de la régulation de la rapamycine (mTOR) dans des conditions physiologiques, faisant de ce type de cellule une exception42. L'activation d'AT1 stimule la synthèse et le renouvellement des protéines dans les cellules. Ainsi, nous avons pensé que l'activation du RAAS pouvait également influencer la stimulation du renouvellement des protéines et la protéostase.
Dans la présente étude, nous nous sommes concentrés sur le rôle de la signalisation AngII dans les podocytesautophagierégulation. Nous avons identifié les calpaïnes protéases activées par le calcium médiant un effet de blocage chronique de l'AngII sur les podocytesautophagie. De plus, nous avons découvert que l'inhibiteur endogène de la calpaïnecalpastatinea pu prévenir l'inhibition de l'autophagie dépendante de l'AngII et les lésions des podocytes au cours de l'hypertension.
Ces découvertes mettent en évidence un mécanisme original par lequel l'hypertension médiée par l'AngII inhibeautophagievia le recrutement de calpaïne induit par le calcium avec des conséquences pathogènes en cas de déséquilibre de l'activité de la calpastatine.
MÉTHODES
Animaux
Calpastatinedes souris transgéniques (CSTTg) ont été gracieusement fournies par le Dr E. Letavernier.43 Des souris présentant une perturbation spécifique des podocytes du gène Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) ont été générées comme décrit précédemment31 en croisant des souris Nphs2.cre44 avec Atg5lox/lox mouse45 sur le fond C57BL6/J. Des souris Nphs2.cre Atg5lox/lox et des mâles témoins de même portée, âgés de 10 à 12 semaines, ont été utilisés dans cette étude. Le modèle hypertendu a été induit par perfusion sous-cutanée d'AngII (Sigma-Aldrich, A9525) à une dose de 1 mg/kg/min pendant 4 à 6 semaines via des mini-pompes osmotiques (Alzet Corp, modèle 2006). Des pompes ont été implantées sous-cutanées dans le dos entre les omoplates et les hanches. Les souris ont reçu une supplémentation en sel (3 % de NaCl) dans la nourriture. Des souris Atg5lox/lox (type sauvage [WT]) ont été utilisées comme témoins dans toutes les études. Pour le sel d'acétate de désoxycorticostérone (DOCA) avec le modèle de réduction du néphron, des souris mâles adultes ont subi une néphrectomie gauche unilatérale. Deux semaines après la néphrectomie, ils ont reçu des pastilles DOC avec la libération de 21-jours (Innovative Research of America) implantée en sc. Une deuxième pastille a été implantée 3 semaines après le premier implant. Toutes les souris ont reçu 0,9 % de NaCl dans l'eau de boisson ad libitum et ont été tuées après 6 semaines d'administration de COD.46 609CEE) et ont été agréés par le ministère français de la recherche et la commission d'éthique de la recherche universitaire locale (APAFIS-7646 et -22373).
Expérience de culture primaire de podocytes
Des podocytes primaires différenciés ont été cultivés comme décrit précédemment.47,48 En bref, le cortex rénal fraîchement isolé a été mélangé et digéré par la collagénase I (Gibco, 17100-017) au Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). Les tissus ont ensuite été passés à travers des tamis cellulaires de 70 mm et 40 mm (BD Falcon, 352340 et 352350). Les glomérules, qui adhèrent à la passoire cellulaire de 40 mm, ont été éliminés avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; Life Technologies, 10010023) þ 0,5 % d'albumine de sérum bovin (Eurobio, HALALB07-65) injectée sous pression et ont ensuite été lavés deux fois dans PBS. Des glomérules fraîchement isolés ont été étalés dans des plats à puits 6- au Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) complétés par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine (Life Technologies, 15140122) pour permettre aux podocytes de sortir des glomérules et grandir. L'enrichissement des podocytes a été vérifié par analyse Western blot comme décrit précédemment31,48,49 (Figure supplémentaire S1). Les podocytes ont été cultivés en absence ou en présence de bafilomycine A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) pendant 4 heures. Pour les expériences d'immunofluorescence, les podocytes primaires ont été étalés sur 4 étiquettes de boîtes (Dutcher, 055071). Les podocytes ont ensuite été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes et traités pour l'immunofluorescence.
Dosage de l'activité de la calpaïne
L'activité intracellulaire de la calpaïne a été déterminée dans les podocytes primaires, comme décrit précédemment.50–52 Au total, 100 000 cellules ont été cultivées dans des 24-boîtes de culture de tissus à puits au Roswell Park Memorial Institute 1640 complétées par 10 % de fœtus. sérum de veau et pénicilline/streptomycine à 1 %. Après la période de culture indiquée, le milieu a été remplacé par une solution de bicarbonate Krebs-Ringer HEPES (KRH) (pH 7,4) contenant du CaCl2 4 mM, avec ou sans inhibiteur de calpaïne 10 mM -1, et incubé pendant 10 minutes avant l'ajout. de 50 mM de substrat de calpaïne N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-méthyl coumarine (Sigma-Aldrich, S6510). Après une période d'incubation de 90-minutes, l'activité de la calpaïne a été déterminée comme la différence entre la fluorescence FL (mesurée à 360 nm d'excitation et à 430 nm d'émission) avec et sans inhibiteur de la calpaïne-1.
Western blot
Les podocytes primaires ont été rayés avec 8 0 ml de tampon de test de radioimmunoprécipitation contenant de la phosphatase et un inhibiteur de protéase. La concentration en protéines a été mesurée avec le kit d'analyse de protéines BCA (Merck Biochemistry, 71285). Vingt microgrammes de protéines ont été soumis à une électrophorèse sur du gel prémoulé Criterion XT (12 % Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Les protéines ont été transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (Thermo Fischer Scientific, 88518). Après blocage dans du lait à 5 % dans du Tris Buffer Saline 0,1 % de Tween (TBS-T), les membranes ont été incubées avec un anti-LC3 polyclonal de lapin (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), un anti-ATG5 polyclonal de lapin (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), anti-séquestre polyclonal de cobaye 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), anti-calpaïne polyclonal de lapin 1 domaine IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), lapin polyclonal anti–calpaïne 2 extrémité amino-terminale du domaine I (1:1000, Abcam, ab39165), souris monoclonale IgG1 anti–calpaïne 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), lapin anti-podocine (1:1000, Abcam, ab50339), anti-néphrine de cobaye (1:500, PROGEN, GP-N2) et anticorps monoclonal anti-tubuline de rat (1:5000, Abcam, ab6160). Après lavage, les membranes ont été incubées avec un anticorps lié à la peroxydase de raifort (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). La détection de signaux spécifiques a été réalisée à l'aide du kit ECL Chemiluminescent (Bio-Rad, 170-5070) sur un appareil LAS 4000 (Fuji). L'analyse densitométrie avec le logiciel ImageJ (National Institutes of Health) a été utilisée pour la quantification.
Mesures de tension artérielle et bilans physiologiques
La pression artérielle systolique des souris a été enregistrée à l'aide de la méthode du brassard de queue (Visitech Systems Inc., BP-2000). Dix mesures de chaque souris ont été prises, puis une valeur moyenne a été déterminée. La pression artérielle systolique a été mesurée au départ (à l'âge de 12 semaines) puis chaque semaine jusqu'à la fin de la période de traitement. Toutes les souris ont été placées dans des cages métaboliques avec un accès libre à l'eau pour une collecte d'urine de 6- heures. Les concentrations de créatinine urinaire et d'urée plasmatique ont été analysées par spectrophotométrie en utilisant une méthode colorimétrique (Olympus, AU400). L'excrétion urinaire d'albumine a été mesurée à l'aide d'un dosage immuno-enzymatique spécifique pour la détermination quantitative de l'albumine dans l'urine de souris (Crystal Chem, 80630).
Histologie
Reinsont été récoltés et fixés dans du formol tamponné au PBS à 4 %. Des sections incluses dans la paraffine (3- mm d'épaisseur) ont été colorées au strichrome de Masson pour évaluer la morphologie du rein. Les anomalies des reins ont été classées en fonction de la présence et de la gravité des anomalies constitutives, notamment la glomérulosclérose, l'expansion mésangiale, l'atrophie tubulaire ou les cylindres et la fibrose. La proportion de glomérules sclérosés a été évaluée par un examen à l'aveugle d'au moins 50 glomérules parun reinsection.
Coloration par immunofluorescence de coupes rénales et de podocytes primaires
Les podocytes primaires fixes ont été bloqués dans de l'albumine de sérum bovin à 3 % de TBS-T et incubés pendant une nuit à 4 degrés avec des anticorps primaires de cobaye anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) et des anti-lapin -protéine fluorescente FL verte (GFP ; 1:500, Abcam, ab290). Après les rinçages au TBS-T, les anticorps secondaires conjugués au fluorophore FL d'âne anti–cobaye IgG AF594-anticorps conjugués (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) et les anticorps conjugués d'âne anti-lapin IgG AF488-( Invitrogen, A21206) a été appliqué. Les images ont été prises à l'aide d'un microscope à fluorescence Zeiss 2 pieds, d'une caméra AxioCam HRc et du logiciel Axiovision 4.3.
Pour formol-fixé en paraffine (FFPE)reins, les sections (3 mm) ont été déparaffinées et hydratées et la récupération de l'antigène a été effectuée dans un tampon citrate chauffé (pH 6). Les sections ont ensuite été perméabilisées avec du Triton 0.1 % (Euromedex) et bloquées dans de l'albumine de sérum bovin TBS-T à 3 % avant une incubation d'anticorps pendant la nuit à 4 C. Nous avons utilisé de l'anti-néphrine de chèvre (1:100, PROGEN, GP -N2), cobaye anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), lapin anti-GFP(1:1000, Abcam, ab290), chèvre anti-Podocalyxine (PODXL ; 1 : 1000, Bio-Techne, AF-1556), et un anticorps de lapin anti–Wilms Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192). Les anticorps secondaires étaient des anticorps conjugués Alexa488 et Alexa 568 d'Invitrogen. Les noyaux ont été colorés en bleu à l'aide de Hoechst. Les lames ont été montées à l'aide d'un milieu de montage fluorescent (Dako, S3023). Des photomicrographies ont été prises avec un photomicroscope Zeiss Axiophot et le logiciel Axiovision. Des quantifications semi-automatiques aux Fidji ont été utilisées pour la quantification des zones positives à la néphrine et PODXLþ par coupe glomérulaire sur au moins 30 glomérules par souris. Le nombre de podocytes a été compté comme le nombre de noyaux WT1þ par section glomérulaire sur au moins 30 glomérules par souris.
Procédure de microscopie électronique à transmission
De petits morceaux de cortex rénal (1 mm3) ont été fixés dans du glutaraldéhyde à 3 % (Electron Microscopy Sciences) pendant 1 à 3 jours0 et lavés trois fois dans du PBS. Les échantillons ont été postfixés dans du tétroxyde d'osmium à 1 % 0.1 M (Electron Microscopy Science) dans du PBS 0,1 M (pH 7,4) et lavés à l'eau. Les échantillons ont été déshydratés dans des qualités d'alcool et d'oxyde de propylène à 100 % (Electron Microscopy Science). L'infiltration de la résine a été réalisée comme suit : mélanger l'Epikote 812 et l'oxyde de propylène dans un rapport de 1 : 1 pendant 30 minutes, puis mélanger l'Epikote 812 et l'oxyde de propylène dans un rapport de 1 : 2 pour une nuit à température ambiante. Les échantillons ont été intégrés dans des capsules de gélatine de 4 mm dans 100% d'Epikote 812 et polymérisés dans un four chauffé à 60 ° C. Des sections ultrafines ont été coupées avec un ultramicrotome UFC7 (Leica MicrosystemsGmbH) et déposées sur Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). Ils ont été contre-colorés avec de l'acétate d'uranyle à 7 % (distribution LFG) et du citrate de plomb de Reynold (LFG). Les échantillons ont été examinés au microscope électronique à transmission JEM1011 (JEOL) avec la caméra CCD Orius SC1000 (Gatan), fonctionnant avec le logiciel Digital Micrograph (Gatan) pour l'acquisition.
Cistanche-maladie rénale
Réseau quantitatif de réaction en chaîne par polymérase
Les glomérules fraîchement isolés ont été congelés dans du réactif de lyse QIAzol (Qiagen) à -80 degré . L'extraction de l'ARN total à l'aide de la méthode à base de phénol a été traitée conformément aux recommandations du fabricant. Les ADNc ont été synthétisés à l'aide du kit RT2 First Strand (Qiagen, 330401) et une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel a été réalisée à l'aide d'un tableau de PCR Custom RT2 Profiler (Qiagen, CLAM36771C) avec RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Les plaques de PCR quantitative ont été passées sur un cycleur Applied Biosystems StepOnePlus. Chaque matrice contient un contrôle de qualité pour l'efficacité de la transcription inverse et la contamination de l'ADN génomique. L'analyse PCR quantitative a été réalisée à l'aide de la méthode 2- DDCT avec l'aide du centre d'analyse de données GeneGlobe (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) et a exprimé comme le changement de pli Log2 dans l'expression des gènes.
Analyse protéomique in silico
La prédiction in silico du site de clivage des calpaïnes a été réalisée avec DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) et CaMPDB (http:// calpain.org/) outils en ligne. La séquence d'acides aminés de la protéine de souris a été obtenue auprès d'Uniprot (https://www.uniprot.org). Les résultats sont résumés dans les tableaux supplémentaires S1 et S2.
analyses statistiques
Tous les graphiques représentent les valeurs individuelles et la moyenne ± SEM. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism, version 9. La comparaison entre les 2 groupes a été effectuée à l'aide d'un test t paramétrique de Student lorsque les échantillons ont passé les tests de normalité Anderson-Darling et D'Agostino et le test F d'égalité de variance. Sinon, un test de Mann-Whitney non paramétrique a été utilisé. La comparaison entre plusieurs groupes a été effectuée à l'aide d'une analyse de variance 1-way ou 2-way suivie d'un test de comparaison multiple avec la correction de Simak. Les valeurs de P < 0.05="" ont="" été="" considérées="" comme="" significatives.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
Figure 1|L'hypertension induite par l'angiotensine II (AngII) D à un régime riche en sel (HSD) inhibe laautophagie. (a–c) Immunofluorescence de podocalyxine (PODXL ; rouge) et P62 (vert) dans les glomérules (a,a0) de souris de type sauvage (WT), (b,b0) de Souris WT après 6 semaines d'AngII þ HSD, et (c,c0) de souris Nphs2.cre Atg5lox/lox montrant l'accumulation de P62 dans les podocytes pendant l'hypertension et dans l'ATG spécifique aux podocytes{{1{{12 }}}}souris déficientes. Les pointes de flèches indiquent les points P62þ dans WT dans (a0 ). Les noyaux ont été contre-colorés avec Hoechst (bleu). Les sous-parties de la figure avec prime indiquent un grossissement plus élevé. Barres=50 mm. (d) Quantification associée de la surface P62þ exprimée en pourcentage de la surface glomérulaire. n=4 souris WT et n=5 WT avec AngII þ HSD, et souris Nphs2.cre Atg5lox/lox. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. Test de Mann-Whitney : *P=0.0159. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.un rein-international.org.
RÉSULTATS
L'hypertension induite par un régime riche en sel AngII D a inhibé l'autophagie des podocytes
Les podocytes présentent un niveau élevé deautophagiein vivo, comme le montre la forte expression de GFP chez des souris transgéniques avec fusion de GFP à LC3 (souris GFP-LC3), un marqueur clé de l'autophagie (Figure supplémentaire S2A). L'autophagie est un processus dynamique avec la formation constante d'autophagosomes et la dégradation d'autophagolysosomes. Le blocage de la dégradation autophagosomale avec de la chloroquine a entraîné l'accumulation de points GFPþ, indiquant un efflux autophagique élevé dans les podocytes (Figures supplémentaires S2A et B). La confirmation que les points GFPþ étaient des autophagosomes a été démontrée par une double fluorescence immuno-FL pour GFP et SQSTM1/P62, une protéine chaperon dégradée parautophagie(Figures supplémentaires S2C et D). Encore une fois, le traitement à la chloroquine a induit l'accumulation de points GFPþ P62þ, démontrant un important efflux autophagique dans les podocytes. Enfin, un efflux autophagique élevé a été conservé in vitro, comme le montrent l'expression de GFP et P62 dans des podocytes primaires isolés de souris GFP-LC3 et une forte accumulation de points GFPþ et P62þ sous traitement à la bafilomycine A1, un autre bloqueur de la dégradation autophagosomale (Figure supplémentaire S2E – H) .
La capacité de l'hypertension à moduler les réponses autophagiques des podocytes a ensuite été évaluée chez des souris infusées d'AngII avec un régime riche en sel (HSD) pendant 6 semaines et chez des témoins non hypertendus. Comme le montre la figure 1, AngII þ HSD a induit une accumulation de P62 dans les glomérules avec une forte accumulation dans les podocytes, suggérant ainsi que AngII þ HSD était responsable de la formation des podocytes.autophagieblocus (Figure 1a–d). Fait intéressant, l'accumulation de P62 dans les podocytes était similaire à celle observée chez les souris déficientes pour l'autophagie des podocytes (souris Nphs2.cre Atg5lox/lox). Dans un autre modèle d'hypertension, le modèle DOC-sel, nous avons également observé une accumulation progressive de P62 dans les podocytes au cours de l'évolution de la maladie (Figure supplémentaire S3).
La suppression d'Atg5 spécifiquement dans les podocytes entraîne une augmentation de l'albuminurie, une perte de podocytes et des lésions glomérulaires dans le modèle AngII D HSD
Nous avons ensuite examiné siautophagiele blocage uniquement dans les podocytes (souris Nphs2.cre Atg5lox/lox) affecte les lésions glomérulaires dans le modèle AngII þ HSD. Nous avons d'abord confirmé que Nphs2. cre Les souris Atg5lox/lox avaient une tension artérielle normale,un reinfonction, et aucune lésion histologique glomérulaire jusqu'à l'âge de 10 mois, comme indiqué précédemment (Figure supplémentaire S4).32 Ensuite, Atg5lox/lox (WT) et Nphs2. Les souris cre Atg5lox/lox ont reçu une perfusion d'AngII avec HSD pendant 6 semaines. Il est important de noter que la pression artérielle systolique était similaire dans les 2 groupes après la perfusion d'AngII au cours de l'étude (Figure 2a), bien que la méthode du brassard de queue utilisée pour mesurer la pression artérielle puisse ne pas avoir la capacité de résoudre les petites différences de pression artérielle. La perfusion d'AngII avec HSD a nettement augmenté le rapport albumine/créatinine urinaire chez les souris WT, et cet effet a encore été significativement augmenté chez les souris Nphs2.cre Atg5lox/lox (Figure 2b). Les souris hypertendues Nphs2.cre Atg5lox / lox présentaient également une sclérose glomérulaire significativement accrue par rapport aux autres portées WT (Figure 2c – e). En accord avec la protéinurie mesurée, les cylindres protéiniques et la dilatation tubulaire étaient significativement plus fréquents chez les souris présentant une déficience en podocytes en ATG5 (Figure 2f – h).
Figure 2|La suppression d'Atg5 spécifiquement dans les podocytes entraîne une augmentation significative de l'albuminurie,un reinblessure et perte de podocytes après 6 semaines de régime riche en sel (HSD) avec infusion d'angiotensine II (AngII). ( a ) Pression artérielle systolique chez les souris Atg5lox / lox et Nphs2.cre Atg5lox / lox pendant 36 jours d'AngII þ HSD. n=9 souris par génotype. Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) : ns. Dans (b–m), n=10 souris par génotype. Dans (b,g,h,k), les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. (b) AngII þ HSD (suite)
Figure 2|(suite) a entraîné une augmentation spectaculaire de l'albuminurie chez Nphs2. cre Souris Atg5lox/lox comparées aux souris témoins Atg5lox/lox. ANOVA à deux facteurs : génotype, P=0.013 ; temps, P=0.0018. ( c – f ) Images représentatives de sections colorées au trichrome de Masson de glomérules de contrôle Atg5lox / lox et de souris Nphs2.cre Atg5lox / lox après 6 semaines d'AngII þ HSD. Barres=50 mm en (c,d). Barres=100 mm en (e,f). (g,h) Comparaison (g) de la proportion de glomérules scléreux et (h) du nombre de moulages tubulaires par champ microscopique. Test de Mann-Whitney : **P=0.0026 en (h), ***P=0.0003 en (g). (i, j) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de la tumeur de Wilms 1 (WT1; rouge) et de la podocalyxine (PODXL; vert) dans les glomérules du contrôle Atg5lox/lox et des souris Nphs2.cre Atg5lox/lox après AngII þ HSD pendant 6 semaines. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barres=50 mm. (k) Quantification du nombre de cellules WT1þ par section glomérulaire. Test de Mann-Whitney : **P=0.0029 en (l,m). Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de CD44 (vert) dans les glomérules du contrôle Atg5lox/lox et des souris Nphs2.cre Atg5lox/lox après AngII þ HSD pendant 6 semaines. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barres=50 mm. (n, o) Photomicrographies représentatives en microscopie électronique à transmission de coupes de glomérules de souris témoins Atg5lox/lox et Nphs2.cre Atg5lox/lox après AngII þ HSD pendant 6 semaines, montrant l'effacement du processus du pied des podocytes (têtes de flèches) chez les Nphs2 hypertendus. cre Souris Atg5lox/lox. Barres=1 mm. n=3 souris par génotype. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.kidney-international.org.
Figure 3|Expression et activité de la calpaïne dans les podocytes. ( a ) Analyse par Western blot de l'expression de la calpaïne -1, de la calpaïne -2 et de la calpaïne -4 dans les podocytes primaires. L'expression de la tubuline sert de normalisation. (b) L'activité calpaïne a été mesurée sur des podocytes primaires traités ou non par l'angiotensine II (AngII ; 100 nM) pendant 24 heures avec ou sans calpeptine (10 mM). n=5 expériences indépendantes. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. Analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) : traitement, P=0.0035. Test de comparaison multiple de Sidak : * P=0.0128 pour AngII par rapport à la ligne de base, ##P=0.0056 pour AngII þ calpeptine par rapport à AngII. ( c ) L'activité de la calpaïne a été mesurée sur des podocytes primaires de type sauvage (WT) oucalpastatinesouris transgéniques (CSTTg) traitées ou non par AngII (100 nM) pendant 24 heures. n=7 expériences indépendantes. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. ANOVA bidirectionnelle jumelée pour le traitement : génotype, P=0.0483. Test de comparaison multiple de Sidak : ***P=0.0009 pour WT AngII par rapport à la ligne de base, *P=0.0420 pour CSTTg AngII par rapport à la ligne de base, #P=0.0424 pour WT par rapport à CSTTg AngII. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.un rein-international.org.
Le nombre de podocytes par glomérule était significativement diminué dans Nphs2. cre Souris Atg5lox/lox traitées avec AngII þ HSD (Figure 2i–k). La lésion des podocytes chez les souris Nphs2.cre Atg5lox / lox avec perfusion d'AngII þ HSD a même progressé vers une glomérulosclérose focale et segmentaire, comme le montre l'expression du marqueur d'activation des cellules épithéliales pariétales (PEC) CD44 dans les glomérules (Figure 2l et m). L'analyse par microscopie électronique a identifié des changements significatifs associés au déficit en ATG5 lors de la perfusion chronique d'AngII avec HSD, y compris l'effacement des processus du pied chez les Nphs2 hypertendus. cre Souris Atg5lox/lox. En revanche, peu de défauts ultrastructuraux ont été trouvés dans les podocytes de souris WT même après 10 semaines de perfusion d'AngII avec HSD (Figure 2n et o), indiquant que l'activité autophagique des podocytes est nécessaire à leur résistance aux dommages induits par AngII þ HSD. Au total, nos résultats indiquent que dans le modèle AngII þ HSD,autophagiel'inhibition aggrave les lésions et la perte des podocytes et induit une glomérulosclérose focale et segmentaire subséquente.
AngII D HSD active l'activité de la calpaïne dans les podocytes qui contribue au blocage de l'autophagie
Comme l'activité de la calpaïne s'est avérée (i) être activée par AngII dans plusieurs types de cellules et (ii) cliver plusieursautophagie,53 nous nous sommes demandé si le blocage de l'autophagie médié par AngII þ HSD– pouvait être attribuable à une activité accrue de la calpaïne induite par AngII. Nous avons d'abord découvert que les podocytes primaires exprimaient les 3 formes omniprésentes de calpaïnes (Figure 3a). Nous avons ensuite montré que l'AngII stimulait l'activité de la calpaïne dans les podocytes primaires. Cette augmentation de l'activité de la calpaïne a été bloquée par un inhibiteur sélectif de la calpaïne (Figure 3b). Nous avons utilisé une souris knock-in avec descalpastatinel'expression du transgène (entraînant une diminution de l'activité des calpaïnes)43 pour évaluer le rôle des calpaïnes dans l'AngII þ médiée par HSDun reinblessure et blocage de l'autophagie. Les podocytes primaires des souris CSTTg ont montré une diminution de l'activité de la calpaïne en réponse à l'AngII par rapport aux podocytes des souris témoins (Figure 3c). Ainsi,calpastatinela surexpression dans les podocytes a diminué l'activation de la calpaïne médiée par l'AngII.
Nous avons ensuite évaluéautophagieniveaux dans les podocytes de souris CSTTg. Nous avons généré des souris CSTTg avec le transgène GFP-LC3. Le rapporteur LC3-GFP a permis de compter les autophagosomes sous forme de points GFPþ/P62þ. P62 s'accumulera en agrégats dans les cellules lorsque l'efflux autophagique est bloqué. À l'état basal, nous avons compté moins de points GFPþ P62þ (Figure 4a, b et e) et moins d'accumulation de P62 (Figure 4c, d et f) dans les podocytes de souris CSTTg GFP-LC3 que dans les podocytes de souris GFP-LC3 normales. , suggérant une augmentation de l'efflux autophagique dans les podocytes de souris présentant une forte abondance de calpastatine.
Figure 4|Évaluation de l'efflux autophagique dans les podocytes decalpastatinesouris transgéniques (CSTTg). ( a, b ) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de la protéine fluorescente FL verte (GFP) (vert) et P62 (rouge) dans les glomérules de 12- souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3 âgées d'une semaine. Les pointes de flèches indiquent les autophagosomes GFPþ P62þ. ( c, d ) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de P62 (vert) et de podocalyxine (PODXL; rouge) dans les glomérules de souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3 âgées de 12- semaines. Les sous-parties de la figure avec prime indiquent un grossissement plus élevé. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barres=50 mm. (e) Quantification du nombre de points LC3þ P62þ par podocyte. Test de Mann-Whitney : **P= 0.0065. (f) Quantification de la zone P62þ par section glomérulaire. Test de Mann-Whitney : *P=0.0420. Dans (e,f), n=5 souris GFP-LC3 et n=8 souris CSTTg GFP-LC3. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.un rein-international.org.
L'efflux autophagique peut être surveillé par la mesure de la conversion de la forme cytoplasmique de LC3, LC3-I, en forme autophagosomale clivée et couplée à la phosphatidyléthanolamine de LC3, LC3-II, sur le Western blot . Les podocytes de souris CSTTg ont montré une augmentation de la conversion de LC 3- I en LC 3- II et une diminution de l'expression de P62, à la fois en présence et en l'absence de bafilomycine A1 (Figure 5a et b), indiquant une augmentation de l'efflux autophagique dans podocytes avec surexpression de la calpastatine. Enfin, l'accumulation de points GFPþ P62þ dans les podocytes après administration de chloroquine était plus importante chez les souris CSTTg GFP-LC3 que chez les souris GFP-LC3, confirmant ainsi quecalpastatinela surexpression induit un efflux autophagique dans les podocytes in vivo (Figure 5c – e). Dans l'ensemble, nos données suggèrent que l'AngII stimule l'activité de la calpaïne dans les podocytes, queautophagieest inhibée par la calpaïne dans les podocytes, et que l'inhibition de l'activité de la calpaïne endogène par la surexpression de la calpastatine est suffisante pour stimuler l'efflux autophagique dans les podocytes.
Les souris CSTTg sont protégées contre les lésions des podocytes induites par AngII D HSD
Les souris CSTTg n'ont montré aucunun reinaltération jusqu'à l'âge d'au moins 12 mois (Figure supplémentaire S5). Nous avons analysé les lésions des podocytes chez les souris CSTTg pendant le traitement AngII þ HSD. Bien que les souris WT aient développé une glomérulosclérose légère et des lésions des podocytes après 4 semaines d'hypertension, comme le montre l'expression anormale de la podocalyxine et de la néphrine, les souris CSTTg présentaient moins de lésions glomérulaires sclérotiques (Figure 6a et b) et préservaient l'expression de la podocalyxine et de la néphrine (Figure 6c – h) . De telles différences dans le phénotype des podocytes ont été observées à un stade où la densité des noyaux des podocytes n'était pas différente entre les souris WT et hypertendues CSTTg (Figure 6i – k).
Figure 5|Le blocage de la dégradation autophagosomale a confirmé l'augmentation de l'efflux autophagique des podocytes danscalpastatinesouris transgéniques (CSTTg). ( a ) Analyse par Western blot de l'expression de LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1) / P62 et ATG5 dans des podocytes primaires de souris de type sauvage (WT) ou CSTTg. L'expression de la tubuline sert de normalisation. Les podocytes ont été traités ou non avec de la bafilomycine A1 (BafA1 ; 100 nM) pendant 4 heures avant l'arrêt de la culture. (b) Quantification des ratios LC{{10}}II/tubuline et P62/tubuline. n=10 souris WT et n=8 souris CSTTg. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. Analyse de variance à deux voies appariée pour le traitement : pour LC3-II/tubuline : génotype, P=0.{{30}}008 ; traitement, P < 0,0001 ;="" pour="" p62/tubuline :="" génotype,="" p="0.0884 ;" traitement,="" p="">< 0,0001.="" test="" de="" comparaison="" multiple="" de="" sidak :="" pour="" lc3-ii/tubuline :="" ***p="">< 0,0001="" pour="" wt="" plus="" bafa1="" versus="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" pour="" csttg="" plus="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" pour="" wt="" þ="" bafa1="" contre="" csttg="" þ="" bafa1 ;="" pour="" p62/tubuline="" :="" ***p="">< 0,0001="" pour="" wt="" plus="" bafa1="" versus="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" pour="" csttg="" plus="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1.="" (="" c,="" d="" )="" images="" d'immunofluorescence="" représentatives="" de="" l'expression="" de="" la="" protéine="" fluorescente="" fl="" verte="" (gfp;="" vert)="" et="" p62="" (rouge)="" dans="" les="" glomérules="" de="" souris="" gfp-lc3="" et="" csttg="" gfp-lc3="" âgées="" d'une="" semaine="" 12-.="" les="" sous-parties="" de="" la="" figure="" avec="" prime="" indiquent="" un="" grossissement="" plus="" élevé.="" les="" noyaux="" ont="" été="" colorés="" avec="" hoechst="" (bleu).="" barres="50" mm.="" les="" souris="" ont="" été="" traitées="" avec="" de="" la="" chloroquine="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" heures="" avant="" la="" mise="" à="" mort.="" les="" pointes="" de="" flèches="" indiquent="" les="" autophagosomes="" gfpþ="" p62þ.="" (e)="" quantification="" du="" nombre="" de="" points="" lc3þ="" p62þ="" par="" podocyte.="" n="5 souris" par="" génotype.="" les="" valeurs="" sont="" présentées="" sous="" forme="" de="" graphiques="" individuels="" et="">±SEM. Test t non apparié avec SD égal : *P=0.0302. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.un rein-international.org.
Figure 6 |Calpastatinela surexpression prévient les lésions des podocytes induites par le régime alimentaire riche en sel (HSD) de l'angiotensine II (AngII). ( a, b ) Images représentatives de sections colorées au trichrome de Masson de glomérules de souris transgéniques de type sauvage (WT) et de calpastatine (CSTTg) après 6 semaines d'AngII þ HSD. Barres=50 mm. (c,d,f,g) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de (c,d) podocalyxine (PODXL) et (f,g) néphrine (NPHS1) chez des souris WT et CSTTg après 6 semaines d'AngII þ HSD et (e ,h) quantifications associées. Barres=50 mm. (i, j) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de la tumeur de Wilms 1 (WT1; vert) et PODXL (rouge) dans les glomérules de souris WT et CSTTg après 6 semaines d'AngII þ HSD et (k) quantification associée du nombre de WT1þ cellules par section glomérulaire. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barres=50 mm. Dans (e,h,k), les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. n=9 souris WT et n=7 souris CSTTg. Test t non apparié avec SD égal : **P=0.0095 en (e), *P=0.0249 en (h), P=0.7891 en (k). Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.un rein-international.org.
De même, après 6 semaines d'hypertension, les souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3 ont présenté une lésion des podocytes, mais les lésions étaient plus importantes chez les souris GFP-LC3 (Figure 7). Le rapport albumine/créatinine urinaire était plus élevé chez les souris GFP-LC3 après 4 semaines d'AngII þ HSD (Figure 7a). Le nombre de podocytes n'était pas différent entre les 2 génotypes, mais l'expression de la néphrine était significativement plus réduite chez les souris GFP-LC3 (contrôle) (Figure 7b – e). En corrélation aveccalpastatine-médiée par la protection, l'analyse ultrastructurale a montré un effacement léger et focal des processus du pied des podocytes chez les souris GFP-LC3 traitées avec AngII þ HSD avec une meilleure préservation de l'effacement du processus du pied chez les souris CSTTg, bien que la quantification globale du nombre de processus du pied par base glomérulaire la longueur de la membrane (GBM) n'était pas statistiquement différente, probablement parce que la lésion des podocytes est focale et segmentaire dans notre modèle (Figure 7f – h). À noter, l'infiltration de macrophages et de lymphocytes T dansreinsn'étaient pas différents entre les groupes (Figure supplémentaire S6). Pris ensemble, ces résultats ont démontré quecalpastatineprevented AngII þ HSD–induced podocyte injury.
La surexpression de la calpastatine restaure l'efflux autophagique dans les podocytes de souris après un traitement AngII D HSD
Enfin, nous nous sommes demandé sicalpastatine-la protection glomérulaire médiée dans le modèle AngII þ HSD impliquait le maintien de l'autophagie dans les podocytes. Fait intéressant, l'accumulation de P62 induite par AngII þ HSD dans les podocytes a été empêchée chez les souris CSTTg et GFP-LC3 CSTTg (Figure 8a – d), ce qui indique que la calpastatine a empêché le blocage des podocytes.autophagie. Il convient de noter que le nombre de points GFPþ P62þ de marquage des autophagosomes était similaire dans les podocytes de souris hypertendues GFP-LC3 et GFP-LC3 CSTTg, suggérant ainsi que l'AngII þ HSD induisait un ralentissement de l'efflux autophagique des podocytes plutôt qu'un arrêt complet (Figure 8e– g).
Prédiction in silico du site de clivage des calpaïnes dans les protéines des podocytes
Nous avons utilisé plusieurs outils in silico pour prédire les cibles potentielles de calpaïne dans les podocytes (tableaux supplémentaires S1 et S2). Trois bases de données en ligne ont été comparées : GPS-CCD,54 CaMPDB,55 et DeepCalpain.56 L'analyse in silico a identifié plusieurs protéines de podocytes, dont la néphrine et la podocine, qui pourraient être clivées par les calpaïnes. Ainsi,calpastatine-la protection glomérulaire médiée pourrait être liée à une réduction de l'activité enzymatique de la calpaïne, conduisant à une dégradation réduite de certaines protéines des podocytes.
De plus, au moins 3autophagie-les protéines apparentées sont des cibles directes des calpaïnes. L'ATG5 est clivée par les calpaïnes, entraînant une perturbation de la formation du complexe ATG12-ATG5.57,58 L'administration d'inhibiteurs de calpaïne in vivo a également empêché le clivage de la protéine d'autophagie Beclin-1.59 Analyse in silico de le site de clivage putatif sur les protéines liées à l'autophagie soutient l'hypothèse selon laquelle la calpaïne pourrait réguler l'autophagie par le clivage enzymatique des protéines de l'autophagie.
Fonction cistanche-rein
Expression de l'ARNm du réticulum endoplasmique (ER) et des marqueurs de stress oxydatif dans les glomérules de souris traitées avec AngII plus HSD
Nous avons évalué le stress du réticulum endoplasmique (RE) et le stress oxydatif par PCR quantitative dans les glomérules pendant le traitement AngII þ HSD (tableau 1). Au départ, nous n'avons observé aucun changement dans l'expression de l'ARNm des gènes analysés dans les glomérules des souris WT et Nphs2.cre Atg5lox/lox (Figure supplémentaire S7). Après 6 semaines d'hypertension, les glomérules de Nphs2. Les souris cre Atg5lox / lox ont montré un profil d'ARNm différent des gènes des voies de stress ER et de stress oxydatif avec une expression accrue de Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 et Hsp90b1 par rapport aux glomérules WT, suggérant ainsi queautophagiela déplétion des podocytes a favorisé le stress ER et le stress oxydatif induits par AngII þ HSD. À l'inverse, les glomérules de souris CSTTg présentaient une régulation négative de plusieurs gènes des voies du stress ER et du stress oxydatif ainsi qu'une diminution de l'expression de certains gènes pro-apoptotique (Figure 9).
Pris ensemble, ces résultats indiquent quecalpastatinela surexpression pourrait prévenir les lésions glomérulaires en réduisant le RE induit par AngII þ HSD et le stress oxydatif.
DISCUSSION
Dans la présente étude, nous avons démontré que dans l'hypertension induite par AngII þ HSD, l'autophagie des podocytes est nettement régulée à la baisse. De plus, les souris avec une délétion spécifique des podocytes d'Atg5 étaient plus sujettes à la glomérulosclérose induite par AngII þ HSD et à la perte de podocytes, montrant ainsi queautophagiedans les podocytes empêche le développement de la néphropathie hypertensive, soulignant le rôle critique de l'autophagie dans les lésions des podocytes induites par AngII þ HSD. On sait peu de choses sur les stimuli extracellulaires qui régulent l'autophagie cellulaire, et ces résultats éclairent la régulation physiopathologique de l'autophagie des podocytes par AngII.
Dans la plupart des glomérulopathies humaines, l'effacement du processus du pied des podocytes est une caractéristique de la lésion glomérulaire entraînant une protéinurie. L'autophagie est susceptible de jouer un rôle essentiel dans le maintien de la fonction des podocytes car ces cellules différenciées en phase terminale affichent des taux élevés deautophagiemême en l'absence de stress. Une étude précédente a montré que l'AngII favorise l'autophagie par la génération d'espèces réactives de l'oxygène dans une lignée cellulaire de podocytes murins immortalisés de manière conditionnelle.60 La production d'espèces réactives de l'oxygène est en effet un inducteur général de l'autophagie dans de nombreux types de cellules et les raisons de cette divergence avec nos résultats pas clair. Contrairement à cette dernière étude, nous avons utilisé des podocytes cultivés primaires murins conservant l'expression de la podocine et de la néphrine et des approches in vivo et non des lignées cellulaires murines. Nous confirmons les rapports précédents selon lesquels les podocytes postmitotiques présentent un niveau inhabituellement élevé de constitutiveautophagie. La mesure de la quantité accrue de LC3-II après la stimulation de l'AngII en présence ou en l'absence d'inhibiteurs lysosomal est nécessaire pour déterminer si l'efflux autophagique est augmenté ou bloqué. Des études antérieures ont négligé ce phénomène.60
Figure 7 |Calpastatinela surexpression prévient les lésions des podocytes induites par le régime riche en sel (HSD) de l'angiotensine II (AngII) D chez les souris LC3 de la protéine fluorescente FL verte (GFP). ( a ) AngII þ HSD a entraîné une augmentation spectaculaire de l'albuminurie chez les souris GFP-LC3 par rapport aux souris GFP-LC3 CSTTg (calpastatine transgénique). n=8 à 13 souris par génotype. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. Analyse de variance à deux facteurs : génotype, P=0.0429 ; temps, P=0.0165. Test de comparaison multiple de Sidak : *P=0.0453 pour les souris GFP-LC3 par rapport aux souris CSTTg GFP-LC3 au jour 28. (b,c) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de la tumeur de Wilms 1 (WT1 ; vert) et de la néphrine (NPHS1) (rouge) dans les glomérules de souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3 âgées de 18- semaines après 6 semaines de perfusion AngII þ HSD. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barres=50 mm. Quantification de (d) la zone NPHS1þ par section glomérulaire et (e) le nombre de cellules WT1þ par section glomérulaire chez les souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3 âgées de 18- semaines après 6 semaines de perfusion AngII þ HSD. n=19 souris GFP-LC3 et n=25 souris CSTTg GFP-LC3. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. Test t non apparié avec SD égal : **P=0.0010 en (d), P= 0.1158 en (e). ( f, g ) Images de microscopie électronique à transmission de glomérules de souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3 après 6 semaines d'AngII þ HSD. Les pointes de flèches indiquent l'effacement du processus du pied. Barres=1 mm. ( h ) Quantification du nombre de processus de pied par micromètre de membrane basale glomérulaire (GBM). n=3 souris par génotype. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et signifient SEM. Chaque parcelle représente le nombre moyen de podocytes par micromètre de GBM sur 1 longueur continue de GBM. Test t non apparié avec SD égal : P=0.7512. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.un rein-international.org.
Ici, nous avons utilisé un modèle hypertensif basé sur la perfusion AngII et HSD. Les podocytes présentent des récepteurs AT1 et sont exposés à des peptides librement filtrés tels que AngII. RAAS spécifique. De même, des études in vivo ont confirmé l'effet de l'AngII sur les lésions des podocytes et le ciblage génique spécifique des podocytes de l'AT1 a démontré que l'activation des récepteurs AT1 dans le glomérule dans la néphrite lupique expérimentale est suffisante pour accélérerun reinblessure en l'absence d'hypertension66,67.autophagiela dérégulation dans notre modèle pourrait être liée à la signalisation directe de l'AngII-AT1 sur les podocytes ou être une conséquence de l'hypertension. Nous pouvons fournir une première réponse à cette question. En effet, dans le modèle DOC-sel, nous avons également constaté une accumulation de P62 dans les podocytes de souris hypertendues (Figure supplémentaire S3). Cela suggère que le blocage de l'autophagie se produit dans les podocytes de ce modèle, qui est censé être indépendant de l'AngII. de l'autophagie des podocytes dépend des effets directs ou indirects de l'AngII.
Figure 8 |Calpastatinela surexpression empêche l'angiotensine II (AngII) D induite par un régime riche en sel (HSD)autophagierégulation négative dans les podocytes. ( a, b ) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de P62 (vert) et de podocalyxine (PODXL; rouge) dans les glomérules de la protéine fluorescente FL verte (GFP) – LC3 et CSTTg (calpastatinetransgéniques) souris GFP-LC3 après 6 semaines d'AngII þ HSD. Les sous-parties de la figure avec prime indiquent un grossissement plus élevé. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barres=50 mm. (c,d) Quantification de la surface de P62þ par section glomérulaire. n=9 souris de type sauvage (WT) et n=7 souris CSTTg dans (c), et n=16 souris GFP-LC3 et n=16 souris CSTTg GFP-LC3 en (d). Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. Test de Mann-Whitney : **P=0.0033 en (c), **P=0.0011 en (d). ( e, f ) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de GFP (vert) et de P62 (rouge) dans les glomérules de souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3 après 6 semaines d'AngII þ HSD. Les sous-parties de la figure avec prime indiquent un grossissement plus élevé. Les pointes de flèches indiquent les autophagosomes GFPþ P62þ. (g) Quantification du nombre de points LC3þ P62þ par podocyte. n=11 souris GFP-LC3 et n=16 souris CSTTg GFP-LC3. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et moyenne ± SEM. Test t non apparié avec SD égal : P=0.1014. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.un rein-international.org.
Tableau 1|Réseau PCR de profileur RT2 personnalisé
La calpaïne-1 et la calpaïne-2 sont des protéases pro-inflammatoires omniprésentes, dont l'activité est contrôlée parcalpastatine, leur inhibiteur spécifique. En effet, la calpastatine inhibe sélectivement les calpaïnes et aucune autre protéase à ce jour. L'activation de la calpaïne a été liée récemment àun reinblessure dans plusieurs contextes pathologiques.69,70 Il a été constaté que le canal potentiel C6 du récepteur transitoire du transporteur du canal calcique activait la calpaïne-1 dans les podocytes via l'activation du Ca2þ/calcineurine. Les reins des patients atteints de glomérulosclérose focale et segmentaire présentaient une expression accrue du canal potentiel du récepteur transitoire C6, une augmentation de l'activité de la calpaïne et de la calcineurine et une expression réduite de la taline cible de la calpaïne-1, qui est essentielle à la stabilité du cytosquelette des podocytes.71 Canal potentiel du récepteur transitoire C6 se lie également directement à calpain-1 et calpain-2. Cette interaction est cruciale pour la régulation du clivage de la taline-1 et le contrôle de la motilité des podocytes.72
Souris transgéniques surexprimantcalpastatinesont protégés contre le remodelage vasculaire et l'inflammation dépendante de l'AngII73 ; contre l'inflammation dans des modèles de glomérulonéphrite,43 de septicémie,74 ou de rejet d'allogreffe75 ; et contre l'inflammation liée à l'âge.76 Les lésions des podocytes chez ces souris n'ont pas été explorées. Peltier et al. a montré que la surexpression decalpastatinea empêché l'inflammation périvasculaire dépendante de l'AngII dans les reins.43 Ainsi, la protection rénale chez les souris CSTTg pourrait être médiée, au moins partiellement, par un mécanisme anti-inflammatoire. Nous évaluons l'infiltration des macrophages et des lymphocytes dans notre modèle et n'avons trouvé aucune différence significative dansun reininflammation entre CSTTg et souris témoins lors de l'analyse globaleun reininfiltration leucocytaire (Figure supplémentaire S6).
La calpaïne a été impliquée récemment dans la régulation de l'autophagie (revue récemment dans Weber et al.53) avec des propriétés intéressantes et bioprotectrices de l'inhibition de la calpaïne dans un contexte diabétique via la restauration deautophagie.77 Ici, nous avons signalé que l'inhibition de la calpaïne parcalpastatinela surexpression (i) prévient les lésions des podocytes au cours de l'hypertension et (ii) restaure l'autophagie dans les podocytes, mettant ainsi en évidence un nouveau rôle délétère de l'activation de la calpaïne au cours de l'hypertension par l'inhibition deautophagie.
Presque toutes les protéines ATG se sont révélées être clivées par les calpaïnes in vitro. 78 Ici, nous avons postulé queautophagiele maintien chez les souris CSTTg hypertendues était médié par l'inhibition de la calpaïne. Pour étayer notre hypothèse, nous avons montré que les podocytes de CSTTg ont une activité de calpaïne réduite lorsqu'ils sont confrontés à l'AngII in vitro (Figure 3c). Nous avons constaté une augmentation du niveau de protéine ATG5 dans les podocytes de souris CSTTg, ce qui suggère que la surexpression de la calpastatine a empêché le clivage ATG5 médié par la calpaïne dans ce contexte (Figure 5a). En revanche, il a été démontré quecalpastatine-l'inhibition médiée par les calpaïnes pourrait être indépendante de l'inhibition de leur activité protéase79 ; ainsi, nous ne pouvions pas exclure la régulation de l'autophagie par la calpastatine indépendante de l'activité enzymatique de la calpaïne.
En résumé, ces résultats ont révélé un rôle auparavant non reconnu decalpastatinedans la régulation des podocytesautophagieet a fourni une piste pour l'étude de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la survie des podocytes au cours des néphropathies hypertensives.
DIVULGATION
Tous les auteurs n'ont déclaré aucun intérêt concurrent.
REMERCIEMENTS
Ce travail a été soutenu par l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) et l'Université de Paris. L'IB a été soutenu par une bourse d'études supérieures du ministère de l'Éducation nationale, de la Recherche et de la Technologie. OL a été financé par un prix de la Fondation européenne pour l'étude du diabète (EFSD) soutenu par le programme EFSD/Novo Nordisk pour la recherche sur le diabète en Europe et une subvention de la Société francophone du Diabète (SFD). BR et CH ont été financés par la subvention de démarrage 107037 du Conseil européen de la recherche et de l'Union européenne (P-LT). YS a été soutenu par une bourse d'études supérieures de la Fondation de France.
Nous remercions Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac, et l'équipe ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France) pour l'aide aux soins et à la manipulation des animaux, Nicolas Sorhaindo pour les mesures biochimiques (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat , Paris, France), et Alain Schmitt et Jean-Marc Massepour la microscopie électronique à transmission (Institut Cochin, Paris, France). Nous reconnaissons le soutien administratif de Véronique Oberweis, Bruno Pillard et Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France).
MATÉRIEL COMPLÉMENTAIRE
Fichier supplémentaire (PDF)
Figure S1. La culture primaire de podocytes exprime des marqueurs de podocytes. Analyse Western blot de l'expression des marqueurs podocytaires NPHS1 et NPHS2 en culture primaire de podocytes de souris WT et CSTTg. La tubuline (TUBA) sert de contrôle de chargement. Représentatif de n=4 souris par génotype.
Figure S2. Le niveau basal élevé de podocytesautophagie. (A, B) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de GFP (vert) et NPHS1 (rouge) dans les glomérules de souris GFP-LC3 traitées ou non avec CQ (80mg/kg) 4 heures avant la mise à mort. Les pointes de flèches montrent des autophagosomes GFPþ. (C,D) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de GFP (vert) et P62 (rouge) dans les glomérules de souris GFP-LC3 traitées ou non avec CQ (80 mg/kg) 4 heures avant la mise à mort. Les pointes de flèches montrent les autophagosomes GFPþ P62þ. (A–D) (0 ) représentent un grossissement plus élevé. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barre=50 mm. N=4 souris par condition (E–H) Images représentatives en immunofluorescence de l'expression de GFP (vert) et P62 (rouge) dans les podocytes primaires de souris GFP-LC3 traitées (F, H) ou non (E, G ) avec la Bafifilomycine A1 (100 nM) pendant 4 heures. N=5 souris par condition.
Figure S3. P62 s'accumule dans les podocytes dans le modèle d'hypertension DOC-sel. (A–C) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de P62 (vert) et PODXL (rouge) dans les glomérules de souris WT après 2 à 6 semaines de modèle DOC-sel. (0 ) représentent un grossissement plus élevé. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barre ¼ 50 mm. (D) Quantification de la zone P62 par zone de podocytes (pour cent). N=5–6 souris par condition. Analyse de variance à un facteur : temps P=0.0059, test de comparaison multiple de Sidak : D42 versus D14 **P=0.0055, D28 versus D14 P=0.8590.
Figure S4. Podocyteautophagieest indispensable pour le développement des podocytes. (A) Pression artérielle systolique, (B) rapport albumine/créatinine urinaire et (C) taux d'urée sanguine chez les souris Atg5lox/lox et Nphs2.cre Atg5lox/lox. N=5–6 souris par génotype. Les valeurs sont présentées sous forme de graphiques individuels et de moyennes±SEM. Test de Mann-Whitney : P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) et P=0.6623 (C). (D – E) Images représentatives des sections colorées au trichrome de Masson de glomérules de souris Atg5lox/lox et Nphs2.cre Atg5lox/lox. (F – G) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de PODXL (vert) et WT1 (rouge) chez les souris Atg5lox/lox et Nphs2.cre Atg5lox/lox. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). (D–G) Barre=50 mm. N ¼ 6 souris par génotype. (H – I) Photomicrographies représentatives de coupes de microscopie électronique à transmission de glomérules de souris Atg5lox/lox et Nphs2.cre Atg5lox/lox. Barre=1 mm. N=3 souris par génotype.
Figure S5.Calpastatinela surexpression n'influence pasun reinfonction à la ligne de base. (A) azote uréique du sang et (B) taux d'albumine plasmatique chez les souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3 âgées de 12-semaine. N=5 GFP-LC3 et N=6 CSTTg GFP-LC3. Les valeurs sont présentées sous forme de graphiques individuels et de moyennes±SEM. Test de Mann-Whitney : P=0.6623 (A) et P=0.9307 (B). (C, D) Images représentatives des sections colorées au trichrome de Masson de glomérules de souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3. (E – H) Images d'immunofluorescence représentatives de l'expression de PODXL (E, F) et NPHS1 (G, H) chez les souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3. (C–H) Barre=50 mm. (I, J) Quantification associée de la zone PODXL et NPHS1 par section glomérulaire. N=5 GFP-LC3 et N=6 CSTTg GFP-LC3. Les valeurs sont présentées sous forme de graphiques individuels et de moyennes±SEM. Test de Mann-Whitney : P=0.1898 (A) et P=0.8413 (B).
Fonction cistanche-rein
Figure S6.Calpastatinela surexpression n'influence pas l'inflammation rénale globale. Immunohistochimie représentative de l'expression de F4/80 (A, B) et CD3 (D – E) chez les souris GFP-LC3 et CSTTg GFP-LC3 après 6 semaines d'angiotensine II þHSD. Barre=200 mm. (C, F) Quantification associée de la surface F4/80 et CD3 parun reinsection. Souris N=7 CSTTg GFP-LC3 et N=8 GFP-LC3. Les valeurs sont présentées sous forme de parcelles individuelles et signifient SEM. Test de Mann-Whitney : P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
Figure S7. Podocyteautophagiedeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
Tableau S1. Prévision in silico des sites de clivage des calpaïnes. Les sites de clivage de Calpain ont été prédits dans les protéines liées aux podocytes et à l'autophagie avec GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP://calpain.org) et DeepCalpain Predict (http://deepcalpain. cancerbio.info/help.php). Fichier supplémentaire (Excel)
Tableau supplémentaire S2. Le dossier complet de la prévision in silico des sites de clivage des calpaïnes. Les sites de clivage des calpaïnes ont été prédits dans les podocytes et lesautophagie-protéines liées au GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) et DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Les sites de clivage de prédiction sont repris pour chaque protéine pour GPS-CCD et DeepCalpain Predict.
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