Une carence en calréticuline perturbe la biogenèse des ribosomes et entraîne un retard dans le développement du rein embryonnaire

edmund.chen@wecistanche.com

Résumé

La néphrogenèse est régie par des voies de signalisation complexes qui contrôlent la croissance et la différenciation cellulaire. Le chaperon du réticulum endoplasmique calréticuline (Calr) est bien connu pour sa fonction dans le stockage du calcium et dans le repliement des glycoprotéines. Son rôle dansun reinle développement n'est toujours pas compris. Nous fournissons des preuves du rôle central de Calr dans la néphrogénèse dans cette enquête. Nous montrons que la carence en Calr entraîne la formation perturbée d'une zone néphrogénique intacte et un retard de la néphrogenèse, comme en témoigne la perturbation de la formation de corps en forme de virgule et en forme de s. En utilisant des approches de protéomique et de transcriptomique, nous avons démontré qu'en plus d'une altération des protéines clés de signalisation Wnt, lesreinsde Calr // ont montré une altération globale de l'expression des protéines ribosomiques qui révèle des perturbations de la synthèse protéique et de la néphrogénèse. L'inactivation médiée par CRISPR/cas9 a confirmé que la déficience en Calr est associée à une déficience de plusieurs protéines ribosomiques et de protéines clés dans la biogenèse des ribosomes. Nos données mettent en évidence un lien direct entre l'expression de Calr et la biogenèse des ribosomes.

Introduction

Un reinl'organogenèse est caractérisée par une succession d'événements morphogénétiques qui sont entraînés par la croissance et la différenciation cellulaire. Au cours de la néphrogénèse, la transition mésenchymo-épithéliale (MET) et la ramification du bourgeon urétéral (UB), qui résulte de l'induction réciproque entre l'UB et le mésenchyme métanéphrique (MM) [1], sont les forces motrices de la formation du néphron. Au cours de ce processus, une interaction complexe et réciproque de différentes voies de signalisation est nécessaire pour orchestrer la différenciation épithéliale et la formation du néphron [1–3]. Parmi les voies clés de ce processus, la signalisation du facteur neurotrophique dérivé de la glie (Gdnf) via son récepteur Ret joue un rôle central au cours d'un processus appelé bourgeonnement urétéral. La perturbation de cette signalisation peut provoquer un uretère ectopique ourénalagénésie lorsque la signalisation est totalement absente [4]. Outre la signalisation Gdnf/Ret, la signalisation canonique Wnt/ -caténine est connue pour coordonner de multiples aspects derénaldéveloppement à la fois dans le MM et l'UB [5] et l'inhibition de la signalisation canonique Wnt dans la lignée du bourgeon urétéral et les progéniteurs du néphron entraînentrénalagénésie [6]. Le maintien de la reprogrammation transcriptionnelle au cours de la néphrogénèse dépend de l'accessibilité de la chromatine [7]. Nous avons démontré que les protéines d'hétérochromatine, connues pour être impliquées dans la régulation épigénétique du silençage génique, sont indispensables pour maintenir l'équilibre entre les activateurs et les inhibiteurs de ramification au stade précoce du développement [7].

CISTANCHE AMÉLIORE LA FONCTION RÉNALE/RÉNALE

La calréticuline (Calr) est un chaperon promiscueux du réticulum endoplasmique (RE) avec une capacité de liaison au calcium élevée et une faible affinité, qui sont essentielles pour la séquestration du Ca2 plus vers le RE et différents processus cellulaires, notamment la transduction du signal, l'expression des gènes et le trafic des protéines. [8,9]. Les mécanismes traitant du rôle de Calr dans les maladies sont principalement basés sur la chélation de Ca2 plus par le domaine C-terminal liant Ca2 plus de Calr et son rôle dans la réponse protéique dépliée (UPR) [10,11]. L'UPR peut jouer un rôle cytoprotecteur lors d'une provocation avec des protéines mal repliées ou peut être préjudiciable aux cellules en tant qu'apoptose induite par la signalisation UPR soutenue. Bien que peu d'études aient abordé le rôle potentiel de Calr dans les maladies par la régulation de la transcription, la fonction de chaperon ER de Calr reste l'un des mécanismes cruciaux pour le destin de la cellule [9,12]. Le stress prolongé du RE et le mauvais repliement des protéines sont prédominants dans diversmaladies rénalescomme les glomérulopathies aiguëslésion rénale, néphropathie diabétique,rénalfibrose et chroniquemaladie du rein[13,14]. Le rôle de Calr dans le développement embryonnaire n'est toujours pas clair. Calr knock-out provoque une létalité embryonnaire au stade de développement E14.5 en raison d'un développement cardiaque altéré [15]. Les conséquences du déficit en Calr sur les mécanismes moléculaires deun reindéveloppement embryonnaire, cependant, ne sont pas encore entièrement compris. Dans la présente étude, nous avons effectué des analyses comparatives transcriptomiques et protéomiques de l'embryonun reinà partir des trois génotypes Calr plus / plus , Calr plus // et Calr// et ont mis en évidence l'impact du knock-out de Calr sur la néphrogénèse et sur l'expression des protéines ribosomiques.

Mots clés:carence en calréticuline; néphrogénèse; biogenèse ribosomale, Rein, Rénal

2. Résultats

2.1. Résultats de l'inactivation de la calréticuline dans les anomalies morphologiques et histologiques du rein et dans l'altération de la ramification rénale

L'inactivation génétique de Calr chez la souris provoque une létalité embryonnaire précoce due à des anomalies septales ventriculaires [15]. Afin de déterminer si le knock-out de Calr a un impactun reindéveloppement, des embryons de souris au stade E13.5 ont été préparés à partir de Calr plus // souris gravides (figure 1A). Les embryons Calr// ont montré une altération significative de la croissance par rapport à Calr plus / plus et Calr plus // et ont révélé une altération significative du développement embryonnaire. La morphologie grossière des embryons et lareinsont montré des diminutions significatives de taille entre les souris Calr plus/plus et Calr-//, les souris Calr// présentant la plus grande anomalie (Figure 1A). Pour illustrer l'impact du KO de Calr surun reindéveloppement et structure, des embryons à trois stades de développement différents (E13.5, E14.5, E16.5) et des trois génotypes (Calr plus / plus , Calr plus // et Calr//) ont été sacrifiés et lesreinsont été obtenus. Les coupes de tissus ont montré différents stades de développement de laun rein,qui progresse à travers des structures morphologiques compliquées comme en témoigne la coloration PAS et HE des coupes de tissus.Reinsdu même stade embryonnaire avec différents génotypes ont montré différents niveaux de développement (figure 1B). De plus, des différences importantes dansun reinstructures ont été observées en particulier lors de la comparaison de Calr // à Calr plus / plus et Calr plus //. Ces différences restent également dans les stades avancés de la néphrogénèse (figure 1B). Caler//reinsmontrent une déficience grave par rapport à Calr plus / plus et Calr plus // (Figure 1B). Au stade E13.5 la taille du Calr//un reinétait plus petit et le nombre de bourgeons urétéraux et de branches de bourgeons urétéraux était significativement plus faible. Des observations similaires ont été faites aux étapes E14.5 et E16.5. Culture d'organes de l'embryonreinsdes trois génotypes embryonnaires a dévoilé un trouble substantiel de la ramification UB etun reincroissance. Pour visualiser lerénalstructures, les rudiments cultivés ont été colorés avec de la laminine comme marqueur de la membrane basale et avec la lectine Dolichos biflorus agglutinine (DBA) pour visualiser l'UB.

La coloration par fluorescence FL combinée de la cultureun reinles rudiments ont montré une altération significative de la ramification accompagnant une carence en Calr et entraînant un retard global dansun reindéveloppement (Figure 2A,B). Au moment de l'isolement, le Calr//un reinles rudiments montraient 6 à 10 pointes UB, tandis que les rudiments Calr plus / plus et Calr plus // présentaient 20 à 30 pointes UB. Les rudiments cultivés Calr plus / plus et Calr plus // se sont développés normalement pendant la période de culture (72 h) et ont montré un UB bien ramifié (85 ± 9, n=6 chacun) ainsi que différentes structures connues d'en rein en développement in vivo. Le cultivéun reinagrégats pré-tubulaires démontrés,rénalvésicules et mésenchyme de la coiffe (Figure 2A,B). En revanche, les rudiments Calr// ne se sont pas développés normalement et ont montré une altération significative de la ramification UB (15 ± 3 n=6) (Figure 2B).

Figure 2. Souris Calr−/−un reinles rudiments présentent une altération sévère de la croissance et de la ramification UB. (UN):Un reindes rudiments de Calr plus / plus Calr plus /- et Calr-/- (E13.5) ont été isolés et cultivés ex vivo pendant trois jours. Calr−/−un reinles rudiments ont montré une altération globale de la croissance et une altération significative de la ramification des bourgeons urétéraux. (B) : coloration par immunofluorescence deun reinrudiments après trois jours de culture. Une co-coloration de laminine (rouge) et de lectine DBA (vert) a été réalisée pour visualiser les différentes structures des rudiments. La quantification de la ramification a été réalisée en comptant le nombre de branches du bourgeon urétéral. La quantification est présentée sous forme de diagramme à barres avec des barres d'erreur. Chaque barre représente le numéro de la branche signifie ± sd à partir de six rudiments cultivés. Différences significatives : (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0,001.="" 2,5×="" 2,5×="" 2,5×="" int.="" j.="" mol.="" sci.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" sur="" 21="" figure="" 2.="" calr悆="" les="" rudiments="" des="" reins="" de="" souris="" présentent="" une="" grave="" altération="" de="" la="" croissance="" et="" de="" la="" ramification="" ub.="">Un reindes rudiments de Calr plus/plus Calr plus // et Calr/ (E13.5) ont été isolés et cultivés ex vivo pendant trois jours. Calr /un reinles rudiments ont montré une altération globale de la croissance et une altération significative de la ramification des bourgeons urétéraux. (B) : coloration par immunofluorescence deun reinrudiments après trois jours de culture. Une co-coloration de laminine (rouge) et de lectine DBA (vert) a été réalisée pour visualiser les différentes structures des rudiments. La quantification de la ramification a été réalisée en comptant le nombre de branches du bourgeon urétéral. La quantification est présentée sous forme de diagramme à barres avec des barres d'erreur. Chaque barre représente le numéro de la branche signifie ± sd à partir de six rudiments cultivés. Différences significatives : (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>

2.2. Le déficit en Calr est associé à des altérations importantes et significatives du transcriptome

Les examens morphologiques et histologiques ont montré une altération deun reindéveloppement dans les embryons de souris Calr/ par rapport à Calr plus / plus et Calr plus // . Afin de déterminer si le knock-out de Calr a eu un impact sur l'expression des protéines et des voies clés de la néphrogénèse, des analyses de transcriptome entières duun reindes rudiments ont été réalisés à partir des trois génotypes embryonnaires. Afin d'évaluer les gènes différentiellement exprimés entre Calr plus / plus , Calr plus // et Calr/un reinéchantillons, des tests quantitatifs basés sur le nombre de lectures ont été effectués à l'aide du test exact de Fisher avec un ajustement de Benjamini-Hochberg pour plusieurs tests. Les figures supplémentaires S1 et S2 affichent la carte thermique de l'analyse comparative entre les expressions géniques dans leun reinrudiments de Calr plus / plus , Calr plus // et Calr / . Afin d'obtenir un aperçu complet des changements d'expression génique entre Calr plus / plus et Calr / rein, un MA-plot a été créé avec le changement de pli transformé (FC) d'expression entre Calr plus / plus et Calr / à log2 de transformé niveau d'expression moyen pour chaque gène dans tous les échantillons (Figure 3A, Figure supplémentaire S1). Le tracé MA montre des gènes régulés de manière différentielle dans Calr plus / plus par rapport à Calr / . La classification fonctionnelle des gènes régulés selon le processus biologique a révélé une altération du processus de développement chez Calr/reins(Figure 3B, tableau supplémentaire S1). Une enquête plus approfondie sur l'annotation de la voie des gènes régulés a révélé une aberration de deux processus principaux : la signalisation Wnt et le repliement des protéines car la majorité des protéines régulées se sont avérées impliquées dans ces deux voies principales (Figure 3B). Le clustering hiérarchique et le clustering k-means sur les profils d'expression ont confirmé que l'embryonun reinles transcriptomes de Calr plus/plus et de Calr plus // sont très similaires mais diffèrent significativement des transcriptomes de Calr/(Figure 3C, Figures supplémentaires S1 et S2).

CISTANCHE AMÉLIORE L'INFECTION RÉNALE/RÉNALE

Nos données d'analyse du transcriptome ont montré que le knock-out de Calr s'accompagnait d'une altération de l'expression de protéines clés dansun reindéveloppement (figures 3C et 4A, tableau supplémentaire S2) aux côtés des protéines clés de la signalisation Wnt et un grand nombre de gènes néphrogéniques ont été régulés à la baisse ou non détectés dans le Calr /un reinrudiments (figure 3C, figure 4A). Entre autres, les facteurs de transcription, tels que Six1 et Six2, précédemment signalés comme fonctionnant à différents stades de la néphrogénèse, étaient significativement régulés à la baisse dans le rein embryonnaire Calr//. Osr1 est l'un des gènes dont l'expression est requise pour Eya1, Pax2, Six2, Sall1 et GDNF et l'expression de ce gène était presque absente dans Calr/. Afin d'étudier l'impact de l'altération de la signalisation Wnt et des gènes clés néphrogéniques surun reindéveloppement chez des souris Calr knock-out, une coloration par immunofluorescence avec des marqueurs du développement embryonnaire a été réalisée dansun reincoupes d'embryons au stade E14.5. La coloration a clairement confirmé l'altération des gènes étudiés dans Calr/(Figure 4B). De plus, par rapport à Calr plus / plus et Calr plus // , le Calr /un reinn'a pas de zone néphrogénique claire (figure 4B) comme en témoigne la coloration et cela confirme une perturbation grave dansun reindéveloppement dans Calr/ embryons.

2.3. Des analyses protéomiques comparatives ont identifié des altérations significatives du protéome du rein calr/embryonnaire

Les analyses morphologiques et histologiques ont montré qu'une restriction de Calr est problématique pour le développement embryonnaire de laun rein. Pour mieux comprendre le rôle de Calr dansun reindéveloppement embryonnaire, de larges analyses protéomiques ont été réalisées surreinsen utilisant deux stratégies. Dans les premières expériences, nous avons utilisé l'électrophorèse sur gel 2D pour comparer l'état embryonnaireun reinprotéomes des embryons de souris Calr plus/plus et Calr plus // du stade E13.5. Le patron 2D a montré une altération significative du protéome de Calr plus //reins(p < 0.05)="" (figure="" supplémentaire="" s3a).="" l'identification="" des="" protéines="" différentiellement="" abondantes="" a="" révélé="" une="" altération="" de="" l'expression="" des="" protéines="" impliquées="" dans="" les="" voies="" de="" stress="" et="" dans="" le="" métabolisme="" des="" arn="" chez="" calr="" plus="">un rein(Figure supplémentaire S3B, C). Afin de mieux explorer l'altération du protéome dans Calr plus // et Calr悆 / par rapport au Calr plus / plusun rein, nous avons effectué un profilage du protéome basé sur la spectrométrie de masse (figure 5, tableaux supplémentaires S3 à S8). Une analyse de chevauchement a montré une reproductibilité élevée de la détection des protéines entre les génotypes (figure 5A). L'analyse statistique a montré des altérations significatives de l'expression des protéines entre Calr plus / plus vs Calr悆 / (Figure 5A, Tableaux supplémentaires S3 et S4, Figure supplémentaire S4A.), Calr plus // vs Calr/ (Figure 5A, Tableaux supplémentaires S5 et S6, Figure supplémentaire S4B), et Calr plus / plus vs Calr plus // (Figure 5A, Tableaux supplémentaires S7 et S8, Figure supplémentaire S4C). La coloration par immunofluorescence a confirmé l'inactivation de Calr dans Calr //reins. De plus, nous avons confirmé les résultats de la protéomique pour deux protéines régulées à la baisse dans Calr / : Calbindin 1(Calb-1) et Superoxide dismutase 1 (Sod1). Dans le cas de Sod1, les données protéomiques et transcriptomiques ont révélé un knock-out de Sod1 dans le Calr悆 // embryonnaireun reinet la coloration par immunofluorescence a confirmé le déficit en Sod1 dans le Calr / embryonnaireun rein(Figure 5B). Sod1 est une métalloenzyme antioxydante qui joue un rôle important dans la détoxification des espèces réactives de l'oxygène (ROS) en convertissant les radicaux superoxydes libres en peroxyde d'hydrogène pour une détoxification supplémentaire par les catalases cellulaires, empêchant ainsi la toxicité. Calb-1 est la principale protéine intracellulaire de liaison au calcium dans le tubule contourné distal (DCT) et joue un rôle clé dans la réabsorption transcellulaire de Ca2 plus. En tant que tampon Ca2 plus intracellulaire et protéine de transit Ca2 plus, Calb-1 transporte Ca2 plus du côté apical vers le côté basolatéral sans modification significative de la concentration intracellulaire de Ca2 plus. Le lien entre le knock-out Calr et l'altération de l'expression des deux protéines n'est pas clair et nécessite une enquête plus approfondie.

Figure 3. Analyse comparative de l'expression génique de souris knock-out pour la calréticuline. (A) : tracé MA montrant des gènes régulés à la hausse et à la baisse à grande échelle chez les souris Calr plus/plus par rapport à Calr/. Des tests quantitatifs du changement de pli (basés sur le nombre de lectures normalisées transformées en log) ont été effectués à l'aide du test exact de Fisher avec une correction de Benjamini-Hochberg (p <0.05) et="" les="" gènes="" non="" significatifs="" sont="" représentés="" en="" gris.="" ma="" plot="" est="" utilisé="" pour="" afficher="" les="" gènes="" différentiellement="" exprimés="" dans="" calr="" plus="" plus="" vs="" calr="" (b)="" :="" distribution="" des="" processus="" biologiques="" des="" gènes="" régulés="" à="" la="" baisse="" dans="" calr/par="" rapport="" à="" calr="" plus="" plus="" -.="" la="" classification="" des="" gènes="" identifiés="" a="" été="" réalisée="" à="" l'aide="" d'un="" outil="" bioinformatique="" david.="" le="" symbole="" du="" gène="" a="" été="" utilisé="" pour="" catégoriser="" les="" annotations="" de="" l'ontologie="" du="" gène,="" par="" exemple,="" les="" processus="" biologiques.="" (c) :="" analyse="" d'enrichissement="" des="" principaux="" gènes="" qui="" se="" sont="" avérés="" significativement="" régulés="" entre="" les="" trois="" génotypes="" (calr="" plus/plus,="" calr="" plus="" et="" calr/).="" l'analyse="" comparative="" est="" représentée="" sous="" forme="" de="" carte="" thermique="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Classification d'ontologies génétiques et analyses de réseaux d'interaction protéine-protéine

Les diagrammes de volcan et les analyses de camembert ont montré que l'altération de l'expression de Calr entraîne des changements globaux dans l'embryon.un reinprotéome (Figure supplémentaire S4). Afin d'obtenir plus d'informations sur les mécanismes biologiques associés au développement embryonnaireun reinaltération du développement chez Calr / souris, nous avons combiné la bioinformatique DAVID avec des informations sur la fonction putative des protéines trouvées dans les bases de données UniProt et GenBank. La classification des protéines identifiées en fonction de leur implication dans les processus biologiques a abouti à vingt catégories, avec neuf catégories fortement représentées (Figure supplémentaire S4D). L'une des principales catégories était le processus de développement, avec plus de 1000 des protéines identifiées appartenant à ce groupe. Étant donné que les interactions protéine-protéine sont les mécanismes clés de presque tous les processus biologiques, y compris le développement, l'extraction d'informations sur d'éventuelles interactions protéine-protéine et la régulation de la voie reliant les protéines régulées dans Calr plus // et Calr/ embryonicun reinpourrait fournir des informations importantes sur les processus qui sont altérés dans des conditions de déficience en Calr. À cette fin, nous avons étudié les réseaux d'interaction entre les protéines régulées à l'aide de STRING 11.0 (http://string.embl.de, consulté le 24 mars 2021). Une analyse plus approfondie des protéines exprimées uniquement dans Calr plus / plus et Calr plus // a révélé deux nœuds d'interaction forts à partir de protéines impliquées dans deux processus principaux, à savoir le métabolisme de l'ARN et la phosphorylation oxydative (Figure supplémentaire S5A). Cela suggère que le Calr / embryonnaireun reinpeut souffrir d'une anomalie du métabolisme de l'ARN et d'un manque d'énergie. L'étude des réseaux d'interaction entre les protéines surexprimées dans Calr plus/plus et Calr plus // par rapport à Calr/ soutient fortement nos hypothèses car les réseaux montrent trois nœuds d'interaction forts. Deux des nœuds ont accumulé des protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN et la phosphorylation oxydative, tandis que le troisième nœud implique des protéines ribosomiques et a révélé une perturbation de la formation des ribosomes et du renouvellement des protéines (Figure supplémentaire S5B). Un examen attentif des protéines ribosomiques jugées régulées a montré une altération significative des protéines des grandes et petites sous-unités ribosomiques, ce qui a révélé la grave perturbation de la biogenèse ribosomique et de la synthèse des protéines (Figure 6A–D).

2.5. Calr Knockout entraîne une altération de l'expression des protéines ribosomiques 

Les analyses des données transcriptomiques et protéomiques ont montré une altération significative de l'expression des protéines ribosomiques chez les souris embryonnaires Calr/.reins. Analyse Western blot et quantification MS des embryonsun reindes extraits protéiques des trois génotypes ont confirmé la régulation négative significative de Rps10, Rps19 et Rps26reins(Figure 7A) et Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17 et Rps19 (Figure supplémentaire S6A,B) dans Calr/. De plus, la coloration des embryonsun reindes coupes ont confirmé l'étendue de l'altération de l'expression des protéines ribosomiques ; aucun Rps10 ou Rps6 n'a pu être détecté dans Calr/ embryonnaireun reincoupes (figure 7B). Afin d'étudier le lien entre l'inactivation de Calr et l'expression de la protéine ribosomale, nous avons établi un modèle in vitro d'inactivation de Calr dans MDCK.rénalcellules tubulaires à l'aide du système d'endonucléase CRISPR/cas9. Les analyses par western blot ont confirmé la régulation à la baisse dose-dépendante de l'expression de Calr dans les cellules MDCK et ont démontré une déplétion significative de la sous-unité ribosomique 40S codant pour les protéines Rps10 et Rps19, ce qui a révélé une perturbation de la biogenèse des ribosomes. De plus, l'expression de composants essentiels pour la synthèse des protéines, par exemple l'élongation, a révélé que le facteur d'initiation eEIF5a diminuait de manière significative dans les cellules MDCK knock-out de Calr (figure 7C). Le knock-out de Calr s'est accompagné d'importantes altérations morphologiques, protéomiques et transcriptomiques. Nos investigations in vivo et in vitro ont en outre mis en évidence que ces aberrations s'accompagnaient d'une baisse significative de la biogenèse des ribosomes. La diminution de l'expression des protéines ribosomiques dans le knock-out de Calrun reinn'était pas limitée aux stades embryonnaires mais pouvait également être démontrée dans des cellules dérivées d'adultesreins, révélant un rôle potentiel de Calr dans la biogenèse ribosomique.

Figure 7. Le déficit en Calr est associé à une régulation à la baisse de l'expression des protéines ribosomiques. (A) : Analyses par Western blot des protéines ribosomiques Rps10, Rps19 et Rps26 dans des extraits protéiques de Calr plus / plus , Calr plus // et Calr // embryonnairereins. Des reins embryonnaires ont été récoltés à partir de trois souris gravides différentes Calr plus /-. Après génotypage, les embryons de même mère et de même génotype ont été regroupés et leur embryonun reinextraits protéiques ont été regroupés. Après estimation des protéines, des analyses Western blot ont été effectuées en triple pour chaque protéine étudiée. Pour l'analyse comparative des échantillons, une ANOVA à une voie a été utilisée. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sd d'au moins trois expériences indépendantes. Les différences étaient considérées comme statistiquement significatives lorsque p < 0.05.="" (b) :="" coloration="" par="" immunofluorescence="" contre="" rps10="" et="" rps6="" dans="" des="" coupes="" de="" tissu="" rénal="" calr="" plus/plus="" et="" calr悆/embryonnaire="" avec="" un="" grossissement="" de="" 20×.="" (c)="" :="" analyse="" western="" blot="" de="" l'extrait="" protéique="" des="" cellules="" mdck="" (à="" gauche)="" et="" quantification="" de="" l'arnm="" après="" l'inactivation="" de="" calr="" dans="" les="" cellules="" mdck="" (à="" droite).="" calr="" a="" été="" éliminé="" en="" utilisant="" le="" système="" crispr/cas9="" avec="" deux="" sgarn="" différents.="" les="" transferts="" western="" ont="" été="" sondés="" avec="" les="" anticorps="" calr,="" gapdh,="" rps10,="" rps19="" et="" eif5a.="" les="" quantifications="" d'arnm="" calr="" et="" rps10="" dans="" l'échantillon="" sgcalr-2="" ont="" été="" effectuées="" à="" l'aide="" de="" qpcr.="" la="" régulation="" à="" la="" baisse="" de="" calr="" à="" l'aide="" du="" système="" crispr/cas9="" a="" révélé="" une="" association="" entre="" une="" déficience="" en="" calr="" et="" une="" altération="" de="" l'expression="" des="" protéines="" ribosomiques.="" différences="" significatives="" :="" (**)="" p="">< 0,01,="" (***)="" p="">< 0,001,="" (****)="" p=""><>

3. Débat

Lareinsse développent par la morphogenèse ramifiée qui est un processus qui implique des processus complexes de croissance et de différenciation et est piloté par les signaux provenant des cellules environnantes dans le compartiment mésenchymateux naissant [16]. Au cours des dernières années, plusieurs gènes et voies clés dansun reindéveloppement ont été identifiés. Les facteurs trophiques, notamment le GDNF, les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) sont impliqués dansrénalcroissance et différenciation. Ils régissent la signalisation impliquée dans la morphogenèse de la ramification UB ainsi que dans le maintien et la différenciation du mésenchyme néphrogénique dans l'embryon.un rein[17]. Calr knock-out provoque une létalité embryonnaire due à un développement cardiaque dysfonctionnel [15]. Des augmentations de la concentration cytoplasmique de Ca2 plus sont nécessaires dans les cardiomyocytes normaux pour entraîner la myofibrillogenèse cardiaque. Cette modification indispensable de la concentration de Ca2 plus dépend de Calr et est absente dans les conditions de carence en Calr [18]. Le rôle fonctionnel du chaperon ER et de la protéine de liaison au calcium Calr dans la néphrogénèse n'a pas encore été exploré. Afin d'étudier le rôle potentiel de Calr dans l'embryonun reindéveloppement et l'impact du déficit en Calr sur la néphrogénèse, nous avons réalisé une analyse comparative transcriptomique et protéomique. Dans l'ensemble, la carence en Calr a entraîné un retard du développement des reins et des altérations insignifiantes du transcriptome et du protéome. De plus, nos données ont révélé qu'une déficience en Calr déclenchait des troubles graves des voies de la néphrogenèse, car des altérations significatives de l'expression des protéines clés de signalisation Wnt (par exemple, Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq et Kremen2) étaient identifiées. La signalisation inductive entre l'épithélium du bourgeon urétéral et le mésenchyme métanéphrique est principalement régulée par la signalisation de rétroaction Wnt [19,20]. Alors que Calr est un élément majeur de l'homéostasie du calcium cellulaire, il est simultanément un chaperon essentiel du RE pour le repliement et le trafic des glycoprotéines et des protéines impliquées dans la signalisation cellulaire et l'expression des gènes [21]. Le knock-out de Calr pourrait entraîner la perturbation du repliement des protéines et du stress ER, ce qui perturbe la machinerie de traduction. Cela peut expliquer le retard observé dans le développement des reins chez les souris homozygotes.

L'un des aspects surprenants et intéressants mis en évidence par nos données est l'altération de l'expression des protéines ribosomiques. Nous avons démontré une déplétion presque complète de plusieurs protéines des sous-unités ribosomiques 40S et 60S. De plus, nos expériences in vitro ont confirmé la corrélation entre la régulation négative de Calr et l'altération de l'expression des protéines ribosomiques. La biogenèse des ribosomes est bien organisée et soumise à une réglementation stricte. De nouvelles études ont démontré que le ribosome joue un rôle important non seulement dans la physiologie cellulaire normale, mais aussi dans la réaction aux stimuli et dans la pathogenèse des maladies. De plus, la biogenèse des ribosomes contrôle la croissance cellulaire, et la prolifération et les altérations des ribosomes se reflètent dans l'aberration de la prolifération cellulaire, l'arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose et la manifestation pathologique [22,23].

En plus de leur rôle dans la biogenèse des ribosomes, les protéines ribosomiques exercent diverses fonctions extra-ribosomales, par exemple dans la croissance et la prolifération cellulaires, dans la réparation de l'ADN et dans la différenciation et le développement cellulaires [24-31]. L'altération des fonctions des protéines ribosomiques était associée à des troubles hématologiques et métaboliques et pouvait entraîner des maladies cardiovasculaires et des cancers [32–36]. La mutation des gènes codant pour les protéines ribosomiques est associée à une anomalie de l'érythropoïèse entraînant des syndromes cliniques, par exemple l'anémie de Diamond-Blackfan (DBA) [37] et le syndrome 5q [38]. Des mutations dans le RPS10 sont associées à l'anémie Diamond-Blackfan et 30% de ces patients ont un fer à cheval ou un sigmoïdereins[39]. Fait intéressant, les patients Diamond-Blackfan ont un risque plus élevé de développer un syndrome myélodysplasique, qui est associé à la mutation de l'exon 9 du gène Calr [40–42]. Ce remodelage de la machinerie traductionnelle provoque des aberrations massives dans le processus de développement et affecte non seulement les systèmes urogénital mais aussi circulatoire et reproducteur, provoquant éventuellement une létalité embryonnaire en cas de carence en calréticuline. Nos données ont révélé une biogenèse perturbatrice des ribosomes dans le Calr/ embryonnaireun reinet a mis en évidence un rôle substantiel de Calr dans la biogenèse des protéines. Nous pensons qu'une meilleure compréhension des relations entre le déficit en Calr et l'altération de l'expression des protéines ribosomiques fournirait de nouvelles informations pour comprendre comment Calr impacte la biogenèse des ribosomes et l'embryon.un reindéveloppement et permettent de nouvelles vues sur les processus régissant le développement des organes.

4. Matériels et méthodes

4.1. Animaux

Des souris de même portée calréticuline hétérozygotes (Calr plus // ) et de type sauvage (Calr plus / plus ) ayant des antécédents génétiques C57BL/6J identiques ont été obtenues auprès du professeur Marek Michalak, Université de l'Alberta, Edmonton, Alberta, Canada. Les souris ont été élevées dans des conditions de logement spécifiques exemptes d'agents pathogènes et génotypées comme décrit précédemment dans Michalak et al. [15]. Pour notre étude, des souris enceintes Calr plus // ont été sacrifiées à différents stades du développement embryonnaire (jours embryonnaires 13,5 : E13,5 ; 14,5 : E14,5 ; et 16,5 : E16,5), les embryons ont été récoltés et lesreinsont été disséqués. Pour le génotypage, un morceau de la queue de l'embryon a été utilisé. Lareinsont ensuite été préparés pour une coloration histochimique ou une analyse transcriptomique ou protéomique. Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément à la législation allemande sur les soins aux animaux et l'éthique (normes NIH) et ont été approuvées par le comité d'éthique local du centre médical universitaire de Göttingen, en Allemagne (33.14-42502-04-11/0598).

CISTANCHE AMÉLIORE LA DOULEUR RÉNALE/RÉNALE

4.2. Coloration histochimique

Pour la coloration histologique de l'embryonreins, l'exciséreinsont été fixés pendant une nuit dans une solution de formaldéhyde tamponnée à 4 %, puis inclus dans des blocs de paraffine. Les sections incluses dans la paraffine ont été déparaffinées et réhydratées et colorées avec une solution d'hématoxyline Gill III et une solution d'éosine Y (Merck, Darmstadt, Allemagne) selon le protocole du fabricant.

4.3. Culture d'organes ex-vivo de rein embryonnaire

La culture d'organes ex vivo a été réalisée selon Davies et.al [43]. Des souris gravides ont été sacrifiées au stade E13.5 du développement embryonnaire, les embryons ont été récoltés et lesreinsont été disséqués. Après génotypage, 6un reindes rudiments de chaque génotype (Calr plus / plus , Calr plus // et Calr/ ) ont été étalés sur une membrane PET transparente avec une taille de pores 0.4 µM (24 puits, BD Falcon). La membrane a été placée dans un puits d'une plaque de 24 puits, contenant 400 µLun reinmilieu de culture (KCM, DMEM, FCS inactivé à 10 %). Cela a permis auun reinentrer en contact avec le milieu sans le noyer. Dans ces conditions, il était possible de conserverun reincultivé à 37 ◦C et 5 pour cent de CO2 pendant au moins 144 h.

4.4. Coloration par immunofluorescence des reins en culture et analyse immunohistologique des coupes de rein

L'embryonnairereinsont été cultivées ex vivo pendant 72 h, puis lesun reinles rudiments ont été fixés dans du méthanol froid à t 20 ◦C pendant 30 min. L'étape de fixation a été suivie de 3 étapes de lavage de 5 min chacune dans du PBS. L'anticorps primaire anti-laminine monoclonal de lapin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) a été dilué dans du PBS et incubé à 4 °C pendant une nuit. Le cultivéun reinLes rudiments ont été lavés dans du PBS pendant 4 h et l'anticorps secondaire (Molecular Probes Alexa Fluor 555 chèvre anti-lapin IgG (1:500)) a été ajouté pendant une nuit à 4 ◦C. L'UB a été coloré à l'aide de la lectine Dolichos biflflorus agglutinine (DBA) pendant au moins 3 h. Après incubation, lareinsont été lavés dans du PBS pendant 3 h et inclus pour analyse microscopique. Immunomarquage d'embryons déparaffinés et réhydratésun reincoupes a été réalisée pour détecter l'expression et la distribution de plusieurs protéines. Les sections ont été traitées avec une solution de récupération d'antigène (acide citrique 1,8 µM et citrate de sodium 8,2 µM) préchauffée dans un cuiseur à vapeur pendant 25 min. Les sections ont été bloquées avec du sérum de chèvre à 10 % dans du PBS pendant 1 h et incubées pendant une nuit à 4 °C avec les anticorps primaires (les anticorps primaires suivants ont été utilisés : anti-Calbindin-1 monoclonal de lapin, anti-Wt1, anti- Six2, anti-Pax2, anti-Calr (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anticorps monoclonaux de lapin anti-Rps6, antiRps10 (Invitrogen) et anticorps monoclonaux de lapin anti-Sod1 (Abnova, Taipei, Taïwan) Les anticorps primaires ont été détectés par fluorescence anticorps secondaires marqués (Molecular Probes Alexa Fluor 555 chèvre anti-IgG de souris et Alexa Fluor 555 chèvre anti-IgG de lapin) pendant 1 h à température ambiante. Pour les contrôles négatifs, les coupes de tissus ont été incubées uniquement avec l'anticorps secondaire. Les lames ont été montées avec des lamelles dans un milieu de montage Vectashield avec DAPI pour contre-colorer les noyaux (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

4.5. Culture de cellules

Madin-Darby caninun rein(MDCK) ont été obtenues de l'American Type Culture Collection (ATCC) et propagées dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM), 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % de L-glutamine à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2-. Les cellules sont cultivées dans des flacons T25 et ont été divisées deux fois par semaine. Pour le passage cellulaire, les cellules MDCK ont été trypsinisées pendant une courte période de temps pour éviter l'altération de la structure cellulaire.

4.6. Génération de cellules knock-out

Les séquences d'ARNsg de Calr (XM8622117) pour l'espèce canis lupus ont été conçues à l'aide de l'outil en ligne BlueHeronBio (Origene, Herford, Allemagne). La séquence d'ARNsg 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 a été insérée dans le plasmide pLenti-Cas-Guide (plasmides Addgene #3931646) avec les enzymes de restriction BamHI et BsmBI pour générer la construction pLenti-Cas9-Calr a ensuite été confirmée par séquençage Sanger. Afin d'éliminer Carl dans les cellules MDCK, une transfection transitoire pLenti-Cas9-Calr a été réalisée. Un jour avant la transfection, 200 000 cellules/mL ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits avec du milieu MEM. Avant la transfection, le milieu de culture a été remplacé par du milieu Opti-MEM sans FCS. La lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a été utilisée pour transfecter les cellules. Le mélange d'ADN plasmidique de lipofectamine a été préparé avec OptiMEM sur la base du protocole de l'instructeur. Pour la transfection sur plaque à 6 puits, 4 µg d'ADN plasmidique ont été ajoutés à 250 µL de milieu Opti-MEM séparément et incubés pendant 10 min à température ambiante. Par la suite, le mélange d'ADN a été ajouté au mélange Lipofectamine 2000 et incubé pendant 30 min avant d'être ajouté aux cellules. Le succès de la transfection a été évalué par Western blot.

4.7. Analyse du transcriptome

Pour les études de transcriptome, 3 souris gravides Calr plus // ont été utilisées. Les embryons (8–10/souris gravides) ont été récoltés et lereinsétaient isolés. Après génotypage,reinsdu même génotype et de la même mère ont été regroupés et traités pour l'extraction de l'ARN. Les ARN totaux ont été isolés de Calr plus / plus , Calr plus // et Calr / embryonicreinsen utilisant la méthode Trizol (Invitrogen) selon les recommandations du fabricant. Les échantillons ont ensuite été traités avec la DNAse I (Sigma) pour éliminer la contamination par l'ADN. La qualité de l'ARN a été vérifiée à l'aide de l'électrophorèse microfluidique Agilent 21{{10}}0 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Californie, États-Unis). Pour le séquençage, les échantillons d'ARN ont été préparés à l'aide du "TruSeq RNA Sample Prep Kit" selon le protocole du fabricant (Illumina, San Diego, CA, USA). Le séquençage à lecture unique (50 bp) a été réalisé à l'aide d'un HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, Californie, États-Unis). Les séquences ont été alignées sur la séquence de référence du génome de Mus Muscullus (Ensembl genome assembly 3.2.1 ; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly.html, consulté le 24 mars 2021) en utilisant l'alignement STAR logiciel (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbor, USA) (version 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, consulté le 24 mars 2021) [44] permettant 2 mésappariements dans 50 bases. Le package SAMtools (version 0.1.18) et HTSeq (version 0.6.1p1) ont été utilisés pour le filtrage des hits uniques et le comptage [45,46]. Les gènes candidats ont été filtrés jusqu'à un minimum de 2- fois le changement et la valeur p corrigée par FDR < 0,05. l'annotation="" des="" gènes="" a="" été="" réalisée="" à="" l'aide="" de="" mus="" muscullus="" de="" l'ensembl="" v78="" (www.ensembl.org,="" consulté="" le="" 1er="" mars="" 2019)="" via="" le="" package="" biomart="" (version="" 2.24.0)="" [47].="" l'analyse="" d'enrichissement="" go="" pour="" les="" gènes="" candidats="" a="" été="" réalisée="" avec="" le="" package="" goseq="" (version="" 1.2)="" [48]="" en="" utilisant="" des="" paramètres="">

4.8. Lyse rénale, extraction de protéines et électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2-DE)

Pour l'électrophorèse sur gel 2D, des embryons de 6 femelles enceintes Calr plus // (8 à 10 embryons/femelle) ont été utilisés. Pour l'extraction de protéines pour l'électrophorèse sur gel 2D (2-DE), lereinsd'embryons au même stade embryonnaire et du même génotype et de la même femelle (8 à 10 embryons/femelle enceinte) ont été regroupés, interrompus avec un tampon de lyse (9,5 M d'urée, 2 % de CHAPS (w/v), 2 % d'ampholytes (w /v), 1 % de DTT), et vortexé. Après ajout du tampon de lyse, les échantillons ont été incubés à 4 ◦C pendant 30 min. Pour éliminer les débris cellulaires, une centrifugation a été effectuée à 13,000× g et 4 ◦C pendant 30 min. Le surnageant a été recentrifugé pendant 30 minutes supplémentaires à 13,000× g et 4 ◦C pour obtenir une pureté maximale. Les surnageants ont été collectés et les culots ont été jetés et les échantillons résultants ont été utilisés immédiatement ou stockés à -80 ◦C jusqu'à leur utilisation. Afin de réduire la contamination saline et d'enrichir les protéines, une précipitation au méthanol-chloroforme selon Wessel et Flügge [49] a été réalisée. Le culot a été séché et dissous dans le tampon de lyse. La concentration totale de protéines a été déterminée à l'aide du test de protéines Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) selon Bradford. BSA (Sigma, Steinheim, Allemagne) a été utilisé comme standard. Afin de garantir la reproductibilité expérimentale, nous avons généré des gels en triple à partir de chaqueun reinbassin. La séparation des protéines 2D a été réalisée comme décrit précédemment [50]. Les gels 2-DE ont été colorés avec une coloration de gel fluorescent Flamingo (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) en suivant les instructions du fabricant. Après coloration, les gels ont été scannés à une résolution de 50 µm sur un scanner Fuji FLA-5100. Les images numérisées ont été analysées à l'aide de Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Allemagne). Pour la visualisation des protéines, les gels DE 2- ont également été colorés pendant une nuit avec du bleu de Coomassie colloïdal, Roti-Blue (Roth, Karlsruhe, Allemagne).

4.9. Analyse par spectrométrie de masse et identification des protéines

Des taches significativement régulées ont été excisées des gels et une digestion trypsique dans le gel et une extraction de peptide ont été effectuées comme décrit précédemment par Dihazi et al. [51]. En bref, les points de gel ont été rincés deux fois dans du bicarbonate d'ammonium 25 mM (amBic) et une fois dans de l'eau, rétrécis avec 100 % d'acétonitrile (ACN) pendant 15 min et séchés dans un SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) pendant 20 à 30 min. Tous les spots excisés ont été incubés avec 12,5 ng/µL de trypsine de qualité séquençage (Roche Molecular Biochemicals, Bâle, CH) dans 25 mM amBic pendant une nuit à 37 ◦C. L'extraction des peptides a été effectuée deux fois en utilisant d'abord 50 % d'ACN/1 % d'acide trifluoroacétique (TFA) puis 100 % d'ACN. Tous les extraits ont été regroupés et le volume a été réduit à l'aide de SpeedVac. Les peptides tryptiques ont été soumis à un séquençage par spectrométrie de masse à l'aide d'un spectromètre de masse Q-TOF Ultima Global (Micromass, Manchester, Royaume-Uni) équipé d'un nanoflux ESI Z-spray. L'identification des protéines a été réalisée avec le moteur de recherche Mascot par rapport aux bases de données MSDB et Swissprot en utilisant une tolérance de masse peptidique et une tolérance de fragment de 0,5 Da.

CISTANCHE AMÉLIORE L'INSUFFISANCE RÉNALE/RÉNALE

4.10. Extraction de protéines, SDS-PAGE, digestion trypsique sur gel et analyses par spectrométrie de masse

Pour la quantification par spectrométrie de masse de l'altération des protéines dans le Calr/un rein, les échantillons du même génotype et de la même mère ont été regroupés. Afin de générer suffisamment de pools et d'assurer la réplication biologique et expérimentale, nous avons utilisé 6 différentes enceintes Cal plus // avec 8 à 10 embryons/souris. L'embryonnairereinsdes trois génotypes ont été récoltés à partir des embryons et l'extraction des protéines a été effectuée en utilisant le tampon de lyse comme décrit ci-dessus. Les extraits protéiques ont été séparés par SDS-PAGE, les gels ont été colorés au bleu de Coomassie, chaque voie excisée et coupée en 2 tranches 0 de taille égale, et les tranches soumises à une digestion en gel avec de la trypsine. Pour l'analyse par spectrométrie de masse, les échantillons ont été enrichis sur une précolonne C18 à phase inversée auto-emballée (0.15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11} }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Allemagne) et séparés sur une colonne analytique en phase inverse C18 (0.0ID 75 mm × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 µm, Dr. Maisch) en utilisant un gradient linéaire de 30 min de 5 à 35 % d'acétonitrile/0,1 % d'acide formique (v:v) à 300 nl min-1). L'éluant a été analysé sur un spectromètre de masse hybride quadripolaire/orbitrap Q Exactive (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Allemagne) équipé d'une source FlexIon nanoSpray et fonctionnant sous le logiciel Excalibur 2.4 en utilisant une méthode d'acquisition dépendante des données. Chaque cycle expérimental était de la forme suivante : un balayage MS complet sur la plage de 350 à 1 600 m/z a été acquis à un réglage de résolution de 70,000 cible FWHM et AGC de 106 et un temps de remplissage maximal de 60 ms . Jusqu'aux 12 précurseurs peptidiques les plus abondants des états de charge de 2 à 5 au-dessus d'un seuil d'intensité de 2 × 104 ont ensuite été séquentiellement isolés à une largeur d'isolement de 2,0 FWHM, fragmentés avec de l'azote à un réglage d'énergie de collision normalisé de 25% et les spectres d'ions produits résultants a été enregistré à un réglage de résolution de 17 500 FWHM et il y avait une cible AGC de 2 × 105 et un temps de remplissage maximal de 60 ms. Les valeurs m/z du précurseur sélectionné ont ensuite été exclues pendant les 15 s suivantes. Deux répétitions techniques par échantillon ont été acquises. Les listes de pics ont été extraites des données brutes à l'aide du logiciel Raw2MSMS v1.17 (Institut Max Planck de biochimie, Martinsried, Allemagne). L'identification des protéines a été réalisée à l'aide du logiciel MASCOT 2.5.1 (Matrixscience, Londres, Royaume-Uni). Les protéines ont été identifiées par rapport au protéome de référence de souris UniProtKB v2017.09 (16930 entrées de protéines) ainsi qu'un ensemble de 51 contaminants couramment identifiés dans notre laboratoire. La recherche a été effectuée avec la trypsine comme enzyme et l'iodoacétamide comme agent bloquant la cystéine. Jusqu'à deux clivages trypsiques manqués et l'oxydation de la méthionine en tant que modification variable ont été autorisés. Les tolérances de recherche ont été fixées à 10 ppm pour la masse des précurseurs et à 0,05 Da pour les masses des fragments et ESI-QUAD-TOF a été spécifié comme type d'instrument. La version 4.8.9 du logiciel Scaffold (Proteome Software Inc., Portland, OR, USA) a été utilisée pour valider les identifications de peptides et de protéines basées sur MS/MS. Les identifications de peptides étaient acceptées si elles pouvaient être établies avec une probabilité supérieure à 95,0 % par l'algorithme du percolateur. Les identifications de protéines ont été tronquées à un taux de fausse découverte de 1 % à un minimum de 2 peptides identifiés avec confiance. Les hits protéiques qui contenaient des peptides similaires et, en outre, ne pouvaient pas être différenciés sur la base de l'analyse MS/MS seule ont été regroupés pour satisfaire aux principes de parcimonie. Les protéines partageant des preuves peptidiques significatives ont été regroupées en grappes. Les abondances de protéines ont été estimées par leurs comptages spectraux après la normalisation des sommes totales entre tous les réplicats.

4.11. Analyse Western Blot

Des analyses Western blot ont été réalisées selon Towbin et al. [52]. Des quantités égales de protéines (50–75 µg) ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et transférées sur des membranes de nitrocellulose (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Royaume-Uni). Les membranes ont été bloquées dans du lait en poudre écrémé à 5 % dans un tampon TBST (Tris-HCl 20 mM, pH 7. 4 150 NaCl 0,1 % Tween 20) et incubées avec des anticorps primaires (anti-Calr, anti -Rps10, anti-Rps19, anti-Rps26 et anti-eIF5A) pendant une nuit à 4 ◦C. Afin de visualiser les bandes protéiques, des anticorps secondaires marqués par fluorescence ont été utilisés. Afin de confirmer une charge protéique égale, les transferts ont été traités avec des anticorps anti-Actb ou anti-GAPDH (Sigma, Taufkirchen, Allemagne).

4.12. Bioinformatique

La classification des protéines identifiées selon leurs fonctions principalement connues et postulées a été réalisée à l'aide de la bioinformatique DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov, consulté le 21 février 2019) [53,54]. Des symboles génétiques ont été utilisés pour étudier et catégoriser les annotations de l'ontologie des gènes (GO) (processus biologiques et fonctions moléculaires). L'analyse du réseau des interactions protéine-protéine connues et prédites des protéines identifiées a été réalisée à l'aide de STRING (outil de recherche pour la récupération des gènes/protéines en interaction) [55].

4.13. Analyses statistiques

Pour {{0}}DE, les images numérisées ont été analysées et la correspondance des points sur les gels et la normalisation ont été effectuées à l'aide de Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Allemagne). Delta2D calcule une valeur de "qualité du spot" pour chaque spot détecté. Cette valeur montre à quel point un point représente la forme de cloche gaussienne 3D "idéale". Sur la base du rapport de volume de spot moyen, les spots dont l'expression relative a été modifiée au moins 2- fois (augmentation ou diminution) en triple entre les échantillons comparés ont été considérés comme significatifs. Afin d'analyser la signification de la régulation des protéines, le test t de Student a été effectué et la signification statistique a été supposée pour les valeurs P inférieures à 0.05. Tous les transferts ont été quantifiés à l'aide du logiciel ImageJ. Les données ont été compilées avec le progiciel GraphPad Prism, version 8 (San Diego, CA, USA). Le logiciel a été utilisé pour la présentation graphique et l'analyse soit par la distribution t de Student, soit par l'ANOVA unidirectionnelle. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sd d'au moins trois expériences indépendantes. Les différences étaient considérées comme statistiquement significatives lorsque p < 0,05.="" les="" extrémités="" des="" bourgeons="" urétéraux="" et="" les="" néphrons="" ont="" été="" comptés="" manuellement="" et="" les="" données="" ont="" été="" compilées="" avec="" le="" progiciel="" graphpad="" prism,="" version="">