L'extrait de Cistanche Deserticola peut-il favoriser la réponse immunitaire?

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Shuangshuang Feng a,1, Xiumei Yang a, Xiang Weng a,1, Bin Wang b, Ailian Zhang a,*

a Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, 830046, Xinjiang, Chine

b Key Lab of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, 200032, Chine

Pertinence ethnopharmacologique :Les polysaccharides à base de plantes ont montré un grand potentiel de renforcement immunitaire. Les adjuvants sont un outil clé pour développer des vaccins efficaces. Dans notre étude précédente, un polysaccharide soluble dans l'eau extrait deCistanchedésertiqueYC Ma a montré une puissante activité immunostimulatrice.

Le but de l'étude:Dans cette étude, les profils immunitaires et l'efficacité des extraits aqueux de plantes cultivéesCistanchedésertiqueYC Ma (AECCD) sur des souris ICR contre l'ovalbumine (OVA) ont été étudiés. Dans des expériences in vitro, l'éventuel mécanisme d'activation des DC par AECCD a été évalué.

Matériaux et méthodes:Les AECCD ont été extraits à l'aide d'eau chaude, après quoi les polysaccharides bruts ont été précipités par de l'éthanol. Les souris ont d'abord été immunisées par voie sous-cutanée avec de l'OVA (10 ug par souris) seul ou de l'OVA (10 ug par souris) contenant respectivement différentes doses d'AECCD (200, 400 et 800 ug par souris) aux jours 1 et 14 et l'amplitude et la cinétique de les anticorps et les réponses à médiation cellulaire ont ensuite été évalués.

Résultats:L'AECCD a provoqué des réponses IgG vigoureuses et à long terme avec des réponses mixtes Th1/Th2 et des niveaux régulés à la hausse de cytokines associées à Th (CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- et CD8 plus IFN-). De plus, l'AECCD a induit la forte concentration cellulaireimmunitaireréponsecaractérisée par une prolifération accrue des splénocytes ainsi que par la réponse cellulaire T activée. Notamment, AECCD a considérablement amélioré la maturation des cellules dendritiques (CD) et inhibé les Tregs. Des expériences in vitro, des tests préliminaires ont indiqué que l'AECCD induisait l'activation des DC en favorisant la maturation phénotypique, la section des cytokines et l'activité allostimulatrice. Le récepteur de type Toll 4 (TLR4) était un récepteur essentiel pour que les DC se lient directement à l'AECCD. Les inhibiteurs de NF-κB ont diminué les niveaux d'expression de CD40, CD80, CD86 et MHC-II et la production d'IFN-, TNF- et IL-6 par DCS.

Conclusion :Enfin, ces résultats suggèrent que l'AECCD pourrait déclencher des réactions spécifiques à l'antigène puissantes et durables.immunitaireréponsesvia l'activation des DC, qui était impliquée dans la régulation des marqueurs de maturation et de l'expression des cytokines via la voie NF-κB liée au TLR4-. L'étude indique que l'AECCD est un immunomodulateur potentiel.

Mots clés:Adjuvant polysaccharidique Cultivé,Cistanchedésertique, Immunomodulateur, Cellules dendritiques Récepteur Toll-like 4, Voie de signalisation NF-κB

Cistanche désertiqueextrait promouvoirimmunitaireréponse

1. Introduction

De nombreuses études ont suggéré que les adjuvants peuvent améliorer l'efficacité des vaccins contre diverses maladies infectieuses telles que le VIH, le COVID-19, la grippe et la fièvre aphteuse (Cao et al., 2020 ; Giuseppe et al., 2018 ). Les adjuvants peuvent induire différents types et amplitudes deimmunitaireréponses, de sorte qu'un adjuvant choisi de manière appropriée peut induire laimmunitaireréponserequis pour un agent pathogène ou un antigène donné (Reed et al., 2013). Les extraits herbacés naturels sont depuis longtemps largement utilisés dans la vie quotidienne ou les soins de santé. Dans de nombreux cas, la médecine traditionnelle chinoise (MTC) et ses composants actifs, en particulier les multiples adjuvants dérivés de polysaccharides de la MTC, ont considérablement amélioré l'efficacité des vaccins. Les polysaccharides de la MTC (Advax™, polysaccharide d'astragale, polysaccharide de ginseng, polysaccharide de Lycium barbarum et polysaccharide de Ganoderma lucidum) présentaient plusieurs avantages par rapport aux autres adjuvants, tels qu'une meilleure sécurité, une biocompatibilité, une forte amélioration immunitaire et une faible réactogénicité (Li et Wang, 2015 ; Schijns et al., 2020). Les composés et les formulations à base de polysaccharides TCM ont donc le potentiel en tant que candidats adjuvants.

Cistanche désertiqueYC Ma (Roucongrong en chinois) est une médecine traditionnelle chinoise enregistrée dans la pharmacopée chinoise et utilisée comme aliment tonique depuis des centaines d'années en Chine (Chinese Pharmacopoeia Commission, 1992). Des études pharmacologiques modernes ont montré ses multiples applications pharmacologiques et immunomodulatrices (Dong et al., 2007 ; Fu et al., 2017). Dans notre étude précédente, les polysaccharides bruts dérivés deCistanchedésertiqueYC Ma a favorisé les réponses humorales et cellulaires spécifiques à l'antigène et a régulé la maturation des cellules dendritiques (DC) (Zhang et al., 2018 ; Zhao et al., 2019). Cependant, sauvageCistanchedésertiqueYC Ma a été excessivement exploré et répertorié comme espèce en voie de disparition.CistanchedésertiqueYC Ma a été planté à grande échelle et est largement utilisé dans le développement et l'application des ressources TCM. Cependant, le potentiel adjuvant desCistanchedésertiqueYC Ma n'est toujours pas clair.

Les DCS sont des régulateurs essentiels contre les maladies infectieuses. Une fois les DC activées, les molécules de surface et les cytokines pro-inflammatoires sur les DC interagissent avec les récepteurs correspondants pour activer les lymphocytes T et déclencher des réponses spécifiques à l'antigène et la production de cytokines dirigeant l'adaptation.immunitaireréponses(Banchereau et Steinman, 1998). Il a été rapporté que le récepteur de type péage 4 (TLR4) sur les DC fonctionne comme un récepteur polysaccharidique important (Park et al., 2014 ; Qi et al., 2016). En effet, de nombreux polysaccharides peuvent interagir directement ou indirectement avec TLR4 sur les DC pour activer le facteur nucléaire kappa B (NF-κB) en aval, qui peut induire l'expression de divers gènes pro-inflammatoires tels que IFN-, TNF- et IL{{11 }} et la réponse inflammatoire pour éliminer les pathogènes (Tian et al., 2019 ; Zhou et al., 2017 ; Zhu et al., 2013). Par conséquent, DCS et NF-κB ont été largement étudiés en tant que cibles potentielles pour le traitement de la maladie.

Dans l'étude, avec la stratégie in vivo (souris ICR), nous avons d'abord évalué les effets immunostimulants d'extraits aqueux deCistanchedésertiqueYC Ma (AECCD) avec différentes doses (faible, moyenne et élevée) pour provoquer uneimmunitaireréponsecontre l'OVA et expliquer la manière in vitro d'activer les DC et les voies liées aux récepteurs en aval. Avec un modèle de souris, nous avons révélé que l'AECCD favorisait la réponse anticorps à long terme avec des titres d'IgG accrus et desimmunitaireréponse. Il est important de noter que l'AECCD a induit des cytokines associées aux Th, en particulier la production d'IFN, ce qui a conduit à une réponse Th1 contre les infections. L'effet d'induction était étroitement corrélé à une maturation accrue des DC et à une diminution des Tregs. Mécaniquement, l'AECCD a favorisé l'activation des DC via la voie NF-κB liée au TLR4-. En résumé, l'étude a confirmé la puissante activité adjuvante de l'AECCD dans la promotion de la réponse adaptative. L'étude a jeté les bases du développement d'adjuvants polysaccharidiques AECCD.

2. Matériels et méthodes

2.1. Réactifs

Ovalbumine (OVA), 3-(4, 5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-bromure de diphényltétrazolium (MTT), polymyxine B (PMB), concanavaline A (ConA), le lipopolysaccharide (LPS), la mitomycine C et la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) ont été obtenus auprès de Sigma (USA). Le sérum bovin fœtal (FBS) a été acheté auprès de Biological Industries. Le kit de comptage de cellules-8 (CCK-8) a été acheté auprès de Biosharp (Chine). Les conjugués IgG/IgGl/IgG2a-HRP anti-souris de chèvre provenaient de Southern Biotech (USA). Inject Alum provenait de Thermo Scientific Pierce (États-Unis). Le GM-CSF provenait de Peprotech (USA). Anticorps marqués par fluorescence (anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD62L-PE, anti-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, anti-IL-4-PE, anti–IFN– -PE, anti-CD86-APC, anti-CD40-FITC/PE, anti- Les tampons CD11c-PE/FITC, anti-CD80-APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm et Perm/Wash provenaient tous de BD Bioscience (États-Unis). Le kit de coloration réglementaire des lymphocytes T provenait d'eBiosciences (USA). TAK-242 était de MedchemExpress (Shanghai, Chine). PDTC provenait de Beyotime Biotechnology (Chine). Le kit d'analyse en flux multi-analytes provenait de Biolegend (USA).

2.2. Préparation de AECCD C. deserticola

(Un spécimen de référence n° CD10041602) a été identifié par le professeur Jiang He. L'AECCD a été obtenu par extraction à l'eau, précipitation à l'éthanol et méthode de déprotéinisation avec quelques modifications mineures (Zhang et al., 2018). Bref, cultivéCistanchedésertiquea d'abord été extrait avec de l'eau plusieurs fois, puis les polysaccharides bruts ont été précipités pendant une nuit en ajoutant de l'éthanol selon un rapport volumique de 1:4. Ensuite, les polysaccharides bruts obtenus ont été déprotéinés par la méthode Sevag (Liu et al., 2012). La teneur totale en sucre a été détectée à 76,82 pour cent avec la méthode anthrone-acide sulfurique (Dubois et al., 1951).

2.3. Analyse spectroscopique infrarouge

Dans le but d'analyser les groupes fonctionnels organiques, AECCD avec KBr a été pressé en pastilles pour la mesure des spectres infrarouges (IR). Les spectres IR des échantillons ont été déterminés entre 4000 et 400 cm-1.

Cistancheherbepromouvoirimmunitaireréponse

2.4. Expériences in vivo

2.4.1. Immunisation des animaux

Des souris femelles C57BL/6 et des souris ICR (âgées de 6 semaines) de la Xinjiang Medical University (Urumqi, Chine) ont été acclimatées pendant 3 jours. Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux règlements du Comité d'éthique des expérimentations animales du Laboratoire clé des ressources biologiques et du génie génétique du Xinjiang à l'Université du Xinjiang (BRGE-AE001).

Les souris ont été immunisées par voie sous-cutanée avec de l'OVA seul ou de l'OVA avec différentes concentrations d'AECCD et ont reçu un rappel au jour 14 selon différents groupes comme suit (6 souris dans chaque groupe) : groupe témoin (0 0,9 % de NaCl), groupe OVA ( 10 ug OVA), groupe AECCD-H (AECCD 800 ug), groupe OVA/ AECCD-L (10 ug OVA, AECCD 200 ug), groupe OVA/AECCD-M (10 ug OVA, AECCD 400 ug ), groupe OVA/AECCD-H (10 ug OVA, AECCD 800 ug) et groupe OVA/Alum (10 ug OVA, Alum100 ug). Des formulations de vaccin dans 100 μL de NaCl à 0,9 % ont été injectées à deux sites différents (50 μL à chaque site) dans la peau du dos de chaque souris. Après la vaccination, des échantillons de sang ont été prélevés du plexus rétro-orbital, et les sérums ont été acquis et stockés à - 80 ◦C pour une analyse plus approfondie de la détection des IgG. La prolifération des splénocytes et la détection des cytokines, des sous-ensembles de lymphocytes T, des marqueurs de surface des DC et des Treg ont été menées après le même protocole de vaccination.

2.4.2. Analyse des anticorps

Les titres d'IgG dans le sérum contre l'OVA ont été déterminés par ELISA aux jours 14, 28, 42 et 56 après la primovaccination mentionnée précédemment (Zhang et al., 2018). Les IgG1 et IgG2a ont été mesurées au jour 21. L'absorbance à 450 nm/630 nm a été obtenue en utilisant un lecteur (Bio-Rad, USA). Les résultats de la réponse des anticorps sont exprimés en titres d'IgG et les isotypes IgGl et IgG2a sont exprimés en absorbances correspondantes.

2.4.3. Test de prolifération des splénocytes

Le test de prolifération des splénocytes chez la souris a été réalisé avec un kit de test CCK-8 conformément aux instructions du fabricant. Au jour 21 après la première immunisation, les splénocytes ont été isolés de la rate de souris immunisées et les érythrocytes ont été lysés après broyage. Les splénocytes (1 × 106 cellules/puits) ont été stimulés avec OVA (10 ug/mL), OVA 323-339 (10 ug/mL), ConA (10 ug/mL) et LPS (10 ug/mL) pour deux jours et des cellules vierges ont été utilisées comme contrôle. L'activité de prolifération a été exprimée sous forme d'indice de stimulation (SI), qui a été calculé le rapport d'absorbance d'une cellule stimulée à une cellule non stimulée sous la longueur d'onde de 570/630 nm.

2.4.4. Analyse du phénotypage des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques drainants et la rate

Des suspensions de splénocytes provenant de ganglions lymphatiques et de rate chez des souris immunisées ont été obtenues selon la méthode mentionnée ci-dessus (Zhang et al., 2018). Après lavage, les échantillons (1 × 106 cellules/puits) ont été colorés pendant 30 min avec des anticorps pour les marqueurs de surface, y compris anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE et anti-CD62L-PE. Les taux de lymphocytes T ont été examinés par cytométrie en flux. Les résultats des phénotypes des lymphocytes T sont exprimés en pourcentages de cellules CD4 plus T (pourcentage), CD8 plus cellule T (pourcentage), CD44 plus cellule T (pourcentage) et CD62L plus (pourcentage) cellule T.

2.4.5. Analyse par cytométrie en flux des niveaux de cytokines

Aux fins de l'analyse de la coloration des cytokines intracellulaires, les lymphocytes spléniques ont été séparés et transformés en une suspension unicellulaire au jour 21 après la première immunisation (Zhang et al., 2017). Les échantillons (2 × 106 cellules/mL) stimulés avec OVA (10 ug/mL) ont été incubés pendant 4 h. Golgistop a ensuite été ajouté pendant 12 h. Les échantillons ont ensuite été lavés, bloqués et colorés avec des anticorps anti-CD4-APC ou anti-CD8a-FITC pendant 30 min. Après fixation et perméabilisation avec Cyto fix/Cytoperm, les échantillons ont ensuite été marqués avec des anticorps anti-IL-4-PE ou anti –IFN– -PE. Une analyse de flux a été effectuée pour déterminer le niveau de cytokine.

2.4.6. Estimation de l'activation des DC et des cellules Treg dans une rate

Pour déterminer si les DC et les Treg jouent un rôle dans l'améliorationimmunitaireréponsecontre OVA, au jour 3 après la première vaccination, des lymphocytes spléniques de souris immunisées ont été récoltés pour l'évaluation de la maturation des DC (Zhang et al., 2017). Les cellules ont été respectivement bloquées et incubées avec des anti-CD11c-PE/FITC, anti-CD40-PE, anti-CD86-APC, anti-CD80-APC et anti-MHCII- FITC pendant 30 minutes. Les cellules ont été analysées par cytométrie en flux. Au jour 21 après la première immunisation, les Tregs ont été testés avec le kit de coloration des lymphocytes T régulateurs de souris. Les splénocytes ont été colorés avec anti-CD4-FITC pour les marqueurs de surface cellulaire, suivis d'une coloration intracellulaire avec anti-CD25-APC et anti-Foxp3-PE conformément aux instructions du fabricant. Le niveau de cellules CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus a été déterminé par cytométrie en flux.

Cistanche plante l'extrait favorise uneimmunitaireréponse

2.5. Expériences in vitro

2.5.1. Génération de CD, viabilité cellulaire et taux d'endotoxines

Des DC issues de la moelle osseuse de souris C57BL/6 ont été obtenues selon la méthode décrite précédemment (Inaba et al., 1992). En bref, les cellules ont été cultivées avec du milieu complet RPMI-1640 (20 ng/mL de GM-CSF et 5 ng/mL d'IL-4). Après six jours, toutes les cellules en suspension ont été collectées sous forme de CD immatures pour des analyses ultérieures. Le pourcentage de CD11c plus DC dans les cellules non adhérentes a été déterminé à 94 % par cytométrie en flux.

La viabilité cellulaire des CD et des splénocytes de souris après AECCD a été détectée avec le kit CCK{{0}} conformément aux instructions du fabricant. Les cellules de DCS et de splénocytes ont été obtenues puis stimulées avec différentes concentrations d'AECCD (0, 10, 100, 400, 800 et 1600 ug/mL). La viabilité cellulaire a été exprimée comme le rapport de l'absorbance du groupe traité à l'absorbance du groupe témoin) × 100 %.

Afin d'exclure l'effet de l'endotoxine dans l'AECCD, après que l'AECCD (100, 200 et 400 ug/mL) et le LPS (100 ng/mL) aient été prétraités avec du PMB (100 ug/mL) pendant 60 min, les CD (5 × 105 cellules/mL) ont été incubées avec AECCD prétraité (100, 200 et 400 ug/mL) et LPS pendant 12 h. Après le traitement ci-dessus, les niveaux de CD40, CD86, CD80 et MHCII ont été évalués.

2.5.2. Analyse du phénotype DC

Les niveaux de molécules costimulatrices ont été déterminés pour évaluer la maturation par des expériences in vitro. Au sixième jour, les DC ont été traitées avec AECCD (20, 100, 200 et 400 ug/mL) ou LPS (100 ng/mL) pendant 12 h. Ensuite, les DC ont été colorées avec des molécules de surface et analysées par cytométrie en flux.

2.5.3. Production de cytokines par les DC in vitro

Le surnageant de culture cellulaire a été collecté pour mesurer le niveau de cytokines à l'aide d'un kit ELISA ou d'un kit d'analyse en flux multi-analyte avec la méthode CBA. Toutes les étapes expérimentales ont été réalisées selon les instructions du fabricant.

2.5.4. Réaction lymphocytaire mixte allogénique (MLR)

Des splénocytes de souris BALB/c ont été obtenus de manière aseptique dans du milieu RPMI- 1640 (Zhang et al., 2018). Les DC C57BL/6 matures (mûries en présence de différentes concentrations d'AECCD ou de LPS) ont été prétraitées avec 50 ug/mL de Mitomycine C pendant 60 min à 37 ◦C. Après lavage, les DC ont été mélangées aux splénocytes selon un ratio de 1:5 ou 1:10 pendant 2 jours. La prolifération cellulaire a été déterminée par le test MTT.

2.5.5. Expériences de neutralisation d'inhibiteurs

Pour étudier la voie NF-κB liée au TLR4-, les DC collectées ont été chargées sur une plaque 24-puits, puis prétraitées avec TAK-242 (5 μM) ou PDTC (5 μM) , respectivement. Après 1-h d'incubation, les cellules ont été stimulées avec différentes concentrations d'AECCD (100, 200 et 400 ug/mL) ou de LPS (100 ng/mL) pendant 24 h. Ensuite, les niveaux d'expression des molécules de surface et des cytokines dans les surnageants de culture ont été déterminés selon les méthodes décrites ci-dessus.

3. Résultats

3.1. Spectroscopie FTIR

Les principaux pics d'absorption de l'AECCD sur la figure 1 étaient des pics d'absorption caractéristiques des structures glycosidiques correspondant à la vibration d'étirement O – H à 3342, 95 cm - 1. La bande à 2933, 54 cm - 1 avait la faible absorption caractéristique des vibrations d'étirement C – H. Le pic à 1657,39 cm−1 a été attribué à la vibration de flexion O–H. L'absorption à 1411.00 cm− 1 a été attribuée aux vibrations d'étirement O–H ou C–H et C–O. Les pics à 1018,38 cm−1 indiquaient également des vibrations des bandes glycosidiques CO et C–O–C.

Fig. 1. Spectres FTIR de l'AECCD.

3.2. Réponse d'anticorps sériques spécifiques à l'OVA

Les sérums des souris immunisées ont été testés pour vérifier la présence d'anticorps générés (IgG, IgG1 et IgG2a) contre l'OVA. Comme le montre la figure 2A, les titres d'IgG chez les souris immunisées avec OVA/AECCD-M ont provoqué des IgG totales plus élevées (titres : 220,000, 25{{30}}, 000 et 250,000) par rapport à ceux du groupe OVA (titres : 100,000, 100,000 et 120,000), et a été proche du groupe Alum (titres : 250,000, 250,000 et 270,000) aux jours 28, 42 et 56 après la primo-vaccination. OVA/AECCD-M/H a significativement amélioré les taux d'IgG1 par rapport au groupe OVA (P < 0,05)="" et="" la="" différence="" entre="" le="" groupe="" ova/aeccd-m/h="" et="" le="" groupe="" alum="" n'était="" pas="" significative="" (p=""> 0,05). OVA/AECCD-M/H a également nettement amélioré les niveaux d'IgG2a par rapport au groupe OVA et au groupe Alum (Fig. 2B et C) (P < 0,05).="" les="" niveaux="" accrus="" d'igg2a="" pourraient="" prévenir="" une="" maladie="" nécessitant="" des="">immunitaireréponse.

Fig. 2. Titres d'anticorps spécifiques à l'OVA et isotypes d'IgG dans le sérum. Des échantillons de sérum ont été prélevés après des immunisations primaires et de rappel pour les anticorps avec ELISA. (A) Les titres d'IgG du sérum regroupé ont été évalués aux jours 14, 28, 42 et 56 après la première immunisation. (B–C) IgG1 et IgG2a ont été mesurés au jour 21 après la première immunisation. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (n=6). *P < 0.05="" par="" rapport="" à="">

3.3. Réponses immunitaires cellulaires

La prolifération des lymphocytes spléniques a été étudiée par test MTT sous restimulation avec OVA ou OVA{{0}}. L'analyse de la prolifération a révélé que l'OVA/AECCD-M augmentait nettement la prolifération des splénocytes après l'exposition à l'OVA, à l'OVA323-339, à la Con A ou au LPS par rapport au groupe OVA. OVA et OVA323-339 ont significativement amélioré la réponse de prolifération plus élevée que celle du groupe Alum (Fig. 3) (P <>

Fig. 3. Prolifération de splénocytes lors d'un traitement AECCD in vivo. Les splénocytes ont été restimulés avec OVA, OVA323-339, ConA ou LPS et mesurés par la méthode MTT au jour 21 après la première immunisation. La prolifération cellulaire a été représentée par l'indice de stimulation (SI): (A–B) Indice de stimulation de l'OVA et de l'OVA323-339. (C – D) Indice de stimulation de ConA et LPS. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (n=5). *P<0.05, **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001="" compared="" to="" ova;="" #p="" <="" 0.05="" and="" ##p="" <="" 0.01="" compared="" to="" ova/="">

3.4. Activation des sous-ensembles de lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques drainants et la rate

Les ganglions lymphatiques et la rate des souris immunisées ont été récoltés pour détecter les sous-ensembles de lymphocytes T au jour 21 après la primo-vaccination. Le pourcentage de sous-ensembles de lymphocytes T (CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus lymphocytes T) des ganglions lymphatiques du groupe OVA/AECCD-M était significativement plus élevé que celui du groupe OVA et du groupe Alum (Fig. 4A–D) (P < 0.05).="" les="" pourcentages="" de="" sous-ensembles="" de="" cellules="" t="" (cd4="" plus,="" cd8="" plus,="" cd44="" plus="" et="" cd62l="" plus="" cellules="" t)="" dans="" une="" rate="" étaient="" significativement="" plus="" élevés="" que="" ceux="" du="" groupe="" ova="" (fig.="" 4e="" –="" j)="" (p=""><0, 05).="" ces="" résultats="" ont="" indiqué="" que="" l'aeccd="" favorisait="" la="" médiation="">immunitaireréponse.

Fig. 4. Niveaux de sous-ensembles de lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques drainants et la rate in vivo. Au jour 21 après la première vaccination, les cellules des ganglions lymphatiques et de la rate ont été utilisées pour détecter les sous-ensembles de lymphocytes T par cytométrie en flux. (A–D) Pourcentages de cellules CD4 plus, CD8 plus et CD44 plus T dans les ganglions lymphatiques. (E–J) Pourcentages de cellules CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus et CD62L plus T dans la rate. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (n=5). *P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01="" et="" ***p="">< 0,001="" par="" rapport="" à="" ova ;="" #p="">< 0,05="" et="" ##p="">< 0,01="" par="" rapport="" à="">

3.5. Cytokines sécrétées par les splénocytes restimulés in vivo

Les cytokines Th1/Th2 de la rate de souris immunisées ont été déterminées par coloration intracellulaire au jour 21 après la première vaccination. Les niveaux de CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- et CD8 plus IFN- dans le groupe OVA/AECCD-M étaient significativement plus élevés que ceux du groupe OVA et du groupe Alum (P < 0="" .05,="" figure="" 5).="" les="" différences="" indiquaient="" que="" l'aeccd="" pouvait="" stimuler="" les="" réponses="" th1/th2,="" en="" particulier="" celles="" médiées="" par="" les="" lymphocytes="">immunitaireréponse.

Fig. 5. Analyse des cytokines spécifiques de l'antigène dans les lymphocytes T in vivo. Les splénocytes de souris immunisées ont été examinés au jour 21 après la première immunisation par coloration de cytokine intracellulaire. (A) Pourcentages de CD4 plus IL-4. (B–C) Pourcentages de CD4 plus IFN- et de CD8 plus IFN- . Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (n=5). *P < {{10}}.05="" et="" **p="">< 0,01="" par="" rapport="" à="" ova ;="" #p="">< 0,05="" par="" rapport="" à="">

3.6. Maturation des DC et Tregs in vivo

L'activation CC peut initier une immunité adaptative. Les effets de l'AECCD sur la maturation des DC chez les souris immunisées ont été évalués au jour 3 après la première immunisation. OVA/AECCD-M a induit les niveaux les plus élevés de CD40, CD80, CD86 et MHCII sur les CD par rapport au groupe OVA, et la différence entre OVA/AECCD-M groupe et le groupe Alum était significatif (Fig. 6A–D) (P < 0,05).="" la="" fréquence="" de="" cd4="" plus="" cd25="" plus="" foxp3="" plus="" tregs="" dans="" le="" groupe="" ova/aeccd-m="" était="" considérablement="" inférieure="" à="" celle="" du="" groupe="" ova="" (fig.="" 6e)="" (p="">< 0,05).="" ces="" données="" suggèrent="" que="" l'aeccd="" pourrait="" activer="" les="" dc="" et="" abaisser="" la="" fréquence="">

Fig. 6. Effets de l'AECCD sur la maturation des DC et les Tregs in vivo. Des splénocytes de souris ICR ont été utilisés pour détecter des molécules costimulatrices sur les DC et les Treg au jour 3 ou 21 après la première immunisation. (A–D) Pourcentages de CD40, CD86, CD80 et MHCII sur CD11c plus DC. (E) Pourcentages de CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Tregs. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (n {{10}}). *P < 0.05="" et="" **p="">< 0.01="" par="" rapport="" à="" ova ;="" #p="">< 0,05="" et="" ##p="">< 0,01="" par="" rapport="" à="">

3.7. Dosages de cytotoxicité et de contamination par endotoxines

Après le traitement avec différentes concentrations d'AECCD pendant 2 jours, les cellules de DCS et les splénocytes de souris ont été utilisés pour déterminer la cytotoxicité potentielle avec le kit CCK-8. Il n'y avait pas de réponse de prolifération inhibée significative dans la viabilité cellulaire des CD et des splénocytes par rapport à celle des groupes témoins (Fig. 7A – B) (P> 0.05). Ces résultats ont montré que l'AECCD à la concentration de 10 à 1600 ug/mL n'a montré aucune cytotoxicité significative pour les CD et les splénocytes par rapport au témoin (P > 0,05). Ainsi, la concentration d'AECCD dans les expériences ultérieures a été fixée à moins de 1600 ug/mL.

Pour exclure l'interférence de la contamination par les endotoxines dans les effets de l'AECCD sur l'activation des DC, le PMB, un antibiotique largement reconnu en raison de son effet neutralisant du LPS, a été utilisé pour exclure la contamination par les endotoxines (Morrison et Jacobs, 1976). Comme le montre la Fig. 7C–F, les niveaux d'expression de CD40, CD80, CD86 ou MHC-II dans les DC traitées à l'AECCD en présence de PMB n'ont montré aucun changement significatif ( P > 0,05). Cependant, une baisse spectaculaire des niveaux d'expression de CD40, CD80 CD86 et MHC-II a été observée dans les DC traitées au LPS en présence de PMB (P < 0,001).="" ces="" résultats="" ont="" démontré="" que="" l'aeccd="" était="" exempt="" de="" contamination="" par="" des="">

Fig. 7. Cytotoxicité et effets du PMB sur la maturation induite des CD lors de l'AECCD. (A–B) Des DCS et des splénocytes de souris ont été cultivés en présence d'AECCD pendant 2 jours pour déterminer la viabilité cellulaire avec la méthode MTT. (C – F) Les DC ont été incubées pendant 12 h avec AECCD ou LPS prétraités en présence/absence de PMB pendant 6 0 min. Les pourcentages de CD40, CD80, CD86 et MHCII sur CD11c plus DC ont été déterminés. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD (n =3). **P < 0,01="" et="" ***p="">< 0,001="" par="" rapport="" au="" groupe="" avec="">

3.8. Maturation phénotypique et activation fonctionnelle des DC in vitro

Sur la base des expériences d'immunisation ci-dessus, la maturation phénotypique des DC a été explorée plus avant après le traitement avec AECCD in vitro. Au jour 6, les CD immatures ont été stimulées avec une concentration donnée d'AECCD ou de LPS pour analyser les molécules de surface. L'AECCD a induit une maturation cellulaire caractérisée par une augmentation significative des pourcentages de CD40, CD80 CD86 et MHC II de manière dose-dépendante (P <0, 001,="" fig.="" 8a="" –="" d).="" une="" maturation="" phénotypique="" similaire="" des="" dc="" a="" également="" été="" observée="" après="" la="" stimulation="" avec="" 100="" ng/ml="" de="" lps.="" les="" données="" d'analyse="" ont="" révélé="" que="" l'aeccd="" améliorait="" la="" maturation="" des="">

D'après les résultats ci-dessus, AECCD a amélioré la maturation phénotypique des DC. Afin d'observer l'effet de l'AECCD sur la fonction DC in vitro, la capacité des DC traitées à l'AECCD à stimuler la prolifération des lymphocytes T allogéniques dans une MLR à un rapport DC-splénocytes de 1: 5 ou 1: 1 0 a été enquêté. Les DC traitées avec différentes concentrations d'AECCD ont induit une prolifération significative des lymphocytes T par rapport aux DC non traitées (Fig. 8E – F) (P <0.001). la="" maturation="" des="" dc="" pourrait="" induire="" la="" production="" de="" cytokines.="" ensuite,="" les="" surnageants="" des="" dc="" traitées="" par="" aeccd="" ou="" lps="" ont="" été="" détectés="" par="" kit="" elisa.="" les="" niveaux="" d'il="" -12="" et="" de="" tnf-="" dans="" les="" surnageants="" des="" dc="" ont="" été="" considérablement="" augmentés="" de="" manière="" dose-dépendante="" (="" p=""><0, 001,="" fig.="" 8g="" –="">

Fig. 8. Maturation phénotypique et activation fonctionnelle des CD lors d'un traitement AECCD in vitro. (A–D) Au jour 6, les CD ont été traités avec une concentration donnée d'AECCD ou de LPS pendant 12 h. Les cellules ont été colorées avec des anticorps et déterminées par cytométrie en flux. Intensité de fluorescence moyenne (MFI) de CD40, CD80, CD86 et MHCII sur CD11c plus DC. (E–F) Les DC C57BL/6 traitées avec différentes concentrations d'AECCD ou de LPS ont été mélangées avec des splénocytes de souris BALB/c dans un rapport de 1:5 ou 1:10 dans un MLR pendant 2 jours. La prolifération cellulaire a été déterminée par le test MTT. (G – H) Les surnageants de culture des DC ont été dosés pour l'IL -12 et le TNF-a par le kit ELISA. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD (n =3). *P < 0.05,="" **p="">< 0,01="" et="" ***p="">< 0,001="" par="" rapport="" aux="" dc="" non="" traitées ;="" #p="">< 0,05="" par="" rapport="" au="">

3.9. TLR4, un récepteur de l'AECCD sur les DC

Le DCS peut initier la signalisation cellulaire par les récepteurs membranaires. Àdéterminerle rôle de TLR4 dans la participation à la maturation des DC traitées par AECCD, après le prétraitement avec l'inhibiteur de TLR4 TAK -242, les DC ont été stimulées avec une concentration donnée d'AECCD, puis l'état d'activation des DC a été examiné par cytomètre en flux . Les niveaux d'expression des cytokines dans les surnageants de culture ont été analysés par un kit d'analyse en flux multi-analyte. La régulation à la hausse de CD40, CD80, CD86 et MHC-II induite par l'AECCD a été significativement inhibée en bloquant les voies TLR4 (P <0, 01,="" fig.="" 9a="" –="" d).="" de="" plus,="" par="" rapport="" au="" témoin="" non="" traité,="" le="" blocage="" de="" tlr4="" avec="" tak-242="" a="" eu="" un="" effet="" d'inhibition="" plus="" significatif="" sur="" la="" production="" d'ifn-,="" tnf-="" et="" il-6="" (p="">< 0,01,="" fig.="" 9e="" –="" g)="">

Fig. 9. Activation de la signalisation TLR4 dans les DC traitées à l'AECCD. Après que les DC immatures aient été traitées avec AECCD en l'absence ou en présence de TAK -242 pendant 12 h, la maturation phénotypique a été examinée par cytomètre en flux et les niveaux de cytokines dans les surnageants par la méthode CBA. (A–D) Pourcentages de CD40, CD80, CD86 et MHCII sur CD11c plus DC. (E–G) Niveaux d'IFN-, TNF- et IL-6. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD (n=3). **P < 0,01="" et=""><0.001 compared="" to="" the="" group="" with="">

3.10. Activation DC par AECCD via la voie NF-κB liée au TLR4-

Pour déterminer si les expressions des molécules de surface et des cytokines des DC traitées à l'AECCD étaient régulées par le NF-κB après que les DC immatures prétraitées avec l'inhibiteur de NF-κB PDTC aient été stimulées avec l'AECCD pendant 12 h, les niveaux d'expression des molécules costimulatrices et des cytokines ont été mesurés par cytomètre en flux. Les niveaux de CD40, CD80 CD86 et MHC-II induits par AECCD ont été significativement diminués par rapport au témoin non traité en bloquant les voies NF-κB avec les inhibiteurs correspondants (P < 0,001,="" fig.="" 10a–d).="" simultanément,="" l'expression="" de="" l'ifn-,="" du="" tnf-="" et="" de="" l'il-6="" était="" également="" significativement="" inhibée="" par="" le="" pdtc="" (p=""><0, 05,="" fig.="" 10e="" –="">

Fig. 10. Implication de NF-κB dans l'activation des DC induite par l'AECCD. Les CD ont été traités avec AECCD en l'absence ou en présence de PDTC pendant 24 h. (A–D) Les pourcentages de CD40, CD80, CD86 et MHCII sur CD11c plus DC ont été déterminés par cytométrie en flux. (E–G) Les niveaux d'IFN-, TNF- et IL-6 dans le surnageant ont été déterminés par la méthode CBA. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD (n=3).*P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" et="" ***p="">< 0,001="" par="" rapport="" au="" groupe="" avec="">

4. Discussion

Actuellement, divers polysaccharides issus de la MTC ont été étudiés comme adjuvants pour les vaccins humains et animaux (Sun et al., 2018 ; Rey-Ladino et al., 2011). Dans cette étude, les effets immunomodulateurs de l'AECCD et le mécanisme d'activation primaire des DC ont été étudiés in vivo et in vitro par une série d'expériences afin d'évaluer l'adaptationimmunitaireréponsecontre OVA et le statut d'activation de DCS. Des expériences in vivo ont indiqué que l'AECCD favorisait remarquablement la production d'isotypes d'IgG et d'IgG spécifiques à l'OVA, augmentait la prolifération des splénocytes et induisait l'activation des lymphocytes T et des cytokines (IL-4/IFN-). En outre, l'AECCD a amélioré la maturation des DC et a présenté une diminution des Tregs. Ces résultats suggèrent que la fonction d'AECCD en tant qu'adjuvant efficace a été réalisée en favorisant la maturation des DC et en inhibant les Tregs. Des expériences in vitro ont indiqué que l'AECCD favorisait la maturation phénotypique des CD, la section des cytokines et l'activité allostimulatrice via la voie NF-κB liée au TLR4-. Ces résultats expérimentaux ont indiqué que l'AECCD avait un potentiel significatif en tant que stimulateur immunitaire.

Chaque adjuvant a des caractéristiques immunitaires uniques contre différents antigènes, ce qui indique que les adjuvants ont un potentiel d'application dans différentes maladies. Dans un premier temps, les propriétés adjuvantes de la co-administration d'AECCD avec OVA ont été testées en déterminant leurs effets sur l'adaptationimmunitaireréponseChez la souris. De nombreuses études ont montré que les activités immunostimulatrices étaient directement proportionnelles à la dose dans une certaine plage (Li et al., 2020 ; Reed et al., 2020 ; Zhang et al., 2017). De même, dans l'étude, l'analyse des anticorps et de l'isotype a révélé que l'AECCD dans une certaine gamme de doses améliorait les réponses IgG, IgG1 et IgG2a spécifiques à l'OVA et que la dose moyenne d'AECCD était la dose optimale. Dans des expériences ultérieures, nous avons principalement étudié l'effet stimulant de l'AECCD à une dose moyenne optimale. La dose moyenne d'AECCD a augmenté de manière significative la réponse de prolifération des splénocytes chez les souris immunisées, indiquant que l'AECCD a favorisé la croissance cellulaire.immunitaireréponsescontre l'OVA. Ces résultats suggèrent que l'AECCD améliorait à la fois humoral et cellulaireimmunitaireréponses, qui étaient associés à un potentiel adjuvant.
L'activité substantielle des lymphocytes T induite peut être propice à l'éradication de la maladie. Au cours d'uneimmunitaireréponse, les lymphocytes T activés peuvent atteindre les tissus lymphoïdes secondaires, y compris la rate et les ganglions lymphatiques (Steinman, 2012). La dose moyenne d'AECCD a efficacement amélioré l'efficacité du vaccin car elle pourrait améliorer de manière significative les réponses des lymphocytes T CD4, CD8, CD44 et CD62L dans les ganglions lymphatiques drainants et la rate. Les lymphocytes T CD8 activés ont assuré l'éradication des agents pathogènes en sécrétant de l'IFN-. Les cellules T CD4 proliférées ont été différenciées en cellules Th1 et cellules Th1. Les cellules Th1 ont sécrété la cytokine Th1 pour stimuler la prolifération des lymphocytes et les cellules Th2 ont sécrété la cytokine Th2 pour améliorer la production d'anticorps (Seder et al., 2008). Dans l'étude, les niveaux de CD4 plus IL-4, de CD4 plus IFN- et de CD8 plus IFN- ont été augmentés par l'AECCD à dose moyenne. AECCD a induit une réponse Th1/Th2 équilibrée et dirigé leimmunitaireréponseen modifiant le réseau de cytokines.

Un adjuvant doit induire une immunité spécifique et contrôler le résultat deimmunitaireréponseen régulant le statut des DC en de nombreux points (Carrera Silva et al., 2013). L'expression des molécules de surface sur les DC est un indicateur crucial pour évaluer la maturation des DC et est généralement corrélée à la différenciation des lymphocytes T (Steinman, 2012). Dans cette étude, l'AECCD a amélioré l'expression des molécules costimulatrices et facilité la maturation des DC lorsqu'elle a été utilisée comme adjuvant contre l'OVA. C'est peut-être l'un des moyens par lesquels l'AECCD a promu les relations humorales et cellulaires.immunitaireréponses. Pendant ce temps, l'AECCD a également diminué la fréquence des CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Tregs, ce qui a fourni une immunité équilibrée après la vaccination. Nos résultats ont corroboré les découvertes récentes selon lesquelles divers polysaccharides de TCM étaient le régulateur de la maturation des DC (Bo et al., 2019 ; Li et al., 2015 ; Zhu et al., 2016).

Activation de l'adaptatifimmunitaireréponsespar les adjuvants polysaccharidiques passe principalement par leur reconnaissance par des récepteurs spécifiques des DC (Akira, 2004). Les DC activées par les voies liées au TLR4- peuvent sécréter divers immunomodulateurs en tant que médiateurs critiques contre les infections (Akira, 2007). Par conséquent, dans des expériences ultérieures, nous avons exploré au préalable le mécanisme moléculaire de l'effet stimulant de l'AECCD sur les CD in vitro. Afin d'observer la cytotoxicité de l'AECCD, la viabilité cellulaire des DC et des splénocytes de souris a d'abord été déterminée. AECCD à 10-1600 ug/mL n'a montré aucune cytotoxicité pour les CD et les splénocytes. Pour exclure toute contamination par le LPS, nous avons prétraité l'AECCD avec du PMB. Les niveaux d'expression de CD40, CD80 CD86 et MHC-II dans les DC traitées à l'AECCD n'étaient pas diminués, mais le PMB inhibait efficacement l'expression des molécules costimulatrices dans les DC traitées au LPS. Cela a démontré que l'AECCD était exempt de contamination par des endotoxines. Ensuite, le statut d'activation des contrôleurs de domaine a été exploré plus en détail. Semblables aux DC traitées au LPS, de manière dose-dépendante, les DC traitées à l'AECCD ont augmenté les niveaux de CD40, CD80 CD 86 et MHC II ainsi que la production de la cytokine pro-inflammatoire, qui était un paramètre de maturation fonctionnelle des DC. Dans une MLR, la capacité de prolifération des lymphocytes T allogéniques a été évaluée dans les CD traitées à l'AECCD. L'AECCD pourrait amorcer et activer les lymphocytes T allogéniques. Les DC ont d'abord été prétraitées avec de la mitomycine C, puis soigneusement lavées pour éliminer ce réactif, de sorte que les effets de l'AECCD sur les DC n'étaient probablement pas attribués à l'activité mitogène. Les données expérimentales ont révélé que la maturation phénotypique et l'activation fonctionnelle des DC pourraient être attribuées à la stimulation de l'AECCD.

Un certain nombre de polysaccharides TCM pourraient stimuler la maturation des DC via TLR4. Le NF-κB, en tant que membre de la voie en aval liée au TLR4-, joue un rôle important dans la régulation de la maturation phénotypique et fonctionnelle des CD et dans l'induction de l'expression de divers gènes impliqués dansimmunitaireréponses(Qi et al., 2016 ; Re et Strominger, 2001 ; Wei et al., 2016 ; Zhu et al., 2013). Grâce à des expériences in vitro, nous avons découvert que l'AECCD favorisait la maturation des DC et que TAK-242 (inhibiteur de TLR4) et PDTC (inhibiteur de NF-κB) diminuaient les niveaux d'expression de CD40, CD80, CD86 et MHC -II et les niveaux de sécrétion d'IFN-, TNF- et IL-6 sur les DC traitées à l'AECCD. Ces résultats ont indiqué que TLR4 et NF-κB étaient impliqués dans l'activation des DC induites par l'AECCD et la sécrétion de cytokines. Ces résultats étaient cohérents avec les études précédemment rapportées car l'AECCD en tant qu'adjuvant améliorait le ciblage de l'antigène sur les DC.

En résumé, nos résultats ont montré que l'AECCD induisait des réponses durables et Th1/Th2, en particulier médiées par les lymphocytes T.immunitaireréponsecontre l'OVA. L'AECCD a activé les CD via la voie NF-κB médiée par le TLR4-, améliorant ainsi la production d'immunomodulateurs et la prolifération des lymphocytes T allogéniques. L'AECCD peut être utilisé comme adjuvant efficace dans le développement de vaccins. Cependant, une analyse précise des composants sera effectuée pour déterminer quel composant dans les DC activés par l'AECCD. En mettant l'accent sur les mécanismes concernant la façon dont l'AECCD stimule l'immunogénicité, y compris l'optimisation des formulations d'adjuvants et de la voie d'administration du vaccin, nous explorerons plus avant les composants immunomodulateurs et les propriétés adjuvantes spécifiques de l'AECCD dans le but de concevoir des adjuvants vaccinaux efficaces contre les maladies infectieuses.

Cistanche avantages désertiquepromouvoir uneimmunitaireréponse

Les contributions de l'auteur

Acquisition, analyse et interprétation des données : Shuangshuang Feng, Xiumei Yang, Xiang Weng. Rédaction du projet original : Shuangshuang Feng, Xiang Weng.

Acquisition de financement :Ailian Zhang.

Enquête:Ailian Zhang.

Méthodologie:Ailian Zhang, Bin Wang.

Surveillance:Ailian Zhang.

Déclaration d'intérêts concurrents

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt lié à cette étude.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [numéros de subvention 31960164 et 31660259]. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, la préparation ou le manuscrit.

Les auteurs remercient le professeur Xingguo Zheng et Jiang He (Urumqi, Chine) pour avoir aimablement fourni les matériaux et l'identification.

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