Administration médiée par les neutrophiles CAR de nanomédicaments sensibles au microenvironnement tumoral pour la chimio-immunothérapie du glioblastome

Le glioblastome (GBM) est l’une des tumeurs solides les plus agressives et mortelles chez l’homme. Bien que des thérapies efficaces, telles que les cellules T et les produits chimiothérapeutiques émergents du récepteur d'antigène chimérique (CAR), aient été développées pour traiter divers cancers, leur efficacité dans le traitement du GBM a été largement entravée par la barrière hémato-encéphalique et les barrières hémato-encéphalique-tumorales. Les neutrophiles humains traversent efficacement les barrières physiologiques et affichent une immunité effectrice contre les agents pathogènes, mais la courte durée de vie et la résistance à l'édition du génome des neutrophiles primaires ont limité leur large application en immunothérapie. Ici, nous concevons génétiquement des cellules souches pluripotentes humaines avec l'inactivation de gènes médiés par CRISPR/Cas9-pour exprimer diverses constructions CAR anti-GBM avec des domaines de signalisation CD3ζ spécifiques à T ou spécifiques aux neutrophiles. Les neutrophiles CAR dotés de la meilleure activité antitumorale sont produits pour administrer et libérer de manière spécifique et non invasive des nanomédicaments sensibles au microenvironnement tumoral afin de cibler le GBM sans qu'il soit nécessaire d'induire une inflammation supplémentaire au niveau des sites tumoraux. Cette chimio-immunothérapie combinatoire présente des activités anti-GBM supérieures et spécifiques, réduit l'administration de médicaments hors cible et prolonge la durée de vie des souris femelles porteuses de tumeurs. Ensemble, ce système biomimétique d’administration de médicaments CAR-neutrophiles constitue une plate-forme sûre, puissante et polyvalente pour traiter le GBM et éventuellement d’autres maladies dévastatrices.

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Le glioblastome (GBM) se caractérise par un taux de mortalité élevé, une durée de vie courte et un mauvais pronostic avec une forte tendance à la récidive1,2. L’efficacité thérapeutique de la chirurgie et des médicaments chimio-médicaments est principalement entravée par la structure fine du cerveau et la barrière hémato-encéphalique physiologique (BBB) ​​ou la barrière hémato-encéphalique-tumorale (BBTB)3-5. En particulier, l’administration de médicaments au système nerveux central (SNC) pour traiter les tumeurs cérébrales est très difficile :<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

L'immunité innée et la plasticité des neutrophiles contre divers cancers12-16, y compris le GBM, ont été moins explorées que leur application en tant que porteurs cellulaires dans l'administration de médicaments8-10. Les neutrophiles circulant dans le sang se dirigent vers le microenvironnement tumoral hypoxique (TME), où ils deviennent des neutrophiles hétérogènes associés à la tumeur (TAN), un composant essentiel du TME immunosuppresseur qui contribue à la progression du cancer et à la résistance thérapeutique12,17. Semblables aux macrophages, des phénotypes anti-tumoraux N1 et pro-tumoraux N2 des TAN ont été trouvés dans le TME18-21 hypoxique. Diverses stratégies thérapeutiques ont été développées pour cibler directement les neutrophiles en mettant l'accent sur la déplétion ou l'inhibition des neutrophiles12,22, conduisant à plusieurs essais cliniques (par exemple, l'inhibiteur du CCR5 Maraviroc dans NCT03274804). Ainsi, l’application directe de neutrophiles non traités en tant que nanoporteur peut présenter un risque supplémentaire pour les patients atteints de cancer, dans lesquels les neutrophiles trafiquants de drogue peuvent être reprogrammés vers le phénotype immunosuppresseur pro-tumoral N2 au sein du TME après avoir atteint des sites tumoraux. De plus, les activités antitumorales intrinsèques des neutrophiles naïfs devraient être explorées et renforcées pour obtenir une efficacité thérapeutique optimisée lorsqu’elles sont utilisées comme support de médicament en association avec des produits chimiothérapeutiques.

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La modification du récepteur d'antigène chimérique (CAR) a considérablement amélioré les activités antitumorales des cellules immunitaires T ou tueuses naturelles (NK) . Cependant, leur efficacité dans les tumeurs solides est encore limitée en partie en raison de leur capacité de trafic et de pénétration tumorale relativement faible. La présence de BBB et BBTB physiologiques entrave encore davantage l’efficacité de ces thérapies émergentes contre le GBM dans le cerveau. Nous avons émis l’hypothèse que la combinaison de l’ingénierie CAR et de neutrophiles hautement mobiles pourrait maintenir leur phénotype anti-tumoral N1 et produire une excellente efficacité thérapeutique dans le traitement du GBM. Les neutrophiles primaires ont une durée de vie courte et résistent à l'édition du génome28, limitant leur application en immunothérapie dirigée par CAR. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), qui sont plus accessibles à l'édition génétique et capables de se différencier massivement en neutrophiles, pourraient fournir une source illimitée de neutrophiles CAR de haute qualité pour une immunothérapie ciblée dans des conditions chimiquement définies et sans xéno29. Les neutrophiles phagocytent également préférentiellement les agents pathogènes microbiens présentant des surfaces rugueuses ou longues, tels que S. aureus et E. coli30, qui doivent être pris en compte pour la conception de nanoparticules dans l'administration de médicaments médiée par les neutrophiles. En effet, Safari et al. ont récemment rapporté la phagocytose préférée de particules allongées administrées par voie intraveineuse, sans modification compliquée de la surface, par les neutrophiles circulants30. Une telle conception simple et bioinspirée de nanoparticules chargées de médicaments pourrait maximiser la charge de médicament dans les neutrophiles et permettre des niveaux thérapeutiques d'administration de médicament sur des sites ciblés.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20 % des nanomédicaments administrés sont délivrés aux tumeurs cérébrales par les neutrophiles CAR, contre 1 % par les nanomédicaments libres. En résumé, notre système biomimétique d’administration de médicaments CAR-neutrophiles est une plate-forme sûre, puissante et polyvalente pour traiter le GBM et d’autres maladies dévastatrices.

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Résultats

Criblage des structures CAR spécifiques aux neutrophiles pour des activités antitumorales améliorées

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90 % et la majorité des clones ciblés sont hétérozygotes (Fig. Supplémentaire 1a – d). L'expression de CAR sur des hPSC modifiées a été confirmée par RT-PCR et analyse par cytométrie en flux de CLTX-IgG4 (Fig. 1e – g supplémentaire). Comme prévu, les hPSC exprimant CAR ont conservé des niveaux d'expression élevés de marqueurs pluripotents, notamment OCT4, SSEA4 et SOX2 (Fig. 1f supplémentaire).

Pour produire des neutrophiles CAR de novo, les hPSC exprimant CAR ont d'abord été différenciées en progéniteurs hématopoïétiques multipotents, puis myéloïdes, avec un traitement par cytokines spécifiques à un stade (Fig. 2c). L’utilisation ultérieure du G-CSF et de l’agoniste de l’acide rétinoïque AM580 a favorisé une production robuste de neutrophiles36. Semblables à leurs homologues du sang périphérique (PB), les neutrophiles CLTX-CAR dérivés de hPSC présentaient une morphologie typique des neutrophiles et des marqueurs de surface CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b et CD18 (Fig. 2 supplémentaire). Nous avons ensuite déterminé les effets de l'expression de CAR sur la cytotoxicité antitumorale des neutrophiles dérivés de hPSC en les co-cultivant avec des cellules U87MG de glioblastome (GBM) in vitro. Comme prévu, les neutrophiles CLTX-CAR dérivés de hPSC présentaient une capacité améliorée de destruction des tumeurs par rapport aux neutrophiles PB (Fig. 2d), ce qui concorde avec les observations précédentes dans les cellules CLTX CAR-T . Parmi ces différents CAR, le CAR #1 a médié des activités supérieures de destruction des tumeurs dans les neutrophiles hPSC. Notamment, le CAR n ° 4 basé sur la chaîne est le moins efficace pour déclencher la destruction des tumeurs médiée par les neutrophiles, ce qui peut être dû à la copie inférieure de l'ITAM dans la sous-unité ζ et à l'expression plus faible des CAR porteurs de - à la surface cellulaire . Les neutrophiles libèrent des espèces réactives de l'oxygène (ROS) cytotoxiques et du facteur de nécrose tumorale (TNF-) pour tuer les cellules cibles. La production de ROS et de TNF- (Fig. 2e, f) à partir de différents neutrophiles a bien coïncidé avec leur cytolyse accrue. Comme prévu, la production de ROS et de TNF- à partir de différents neutrophiles après coculture avec des cellules gliales SVG p12 normales est restée aussi faible que celle du groupe témoin négatif (Fig. 3a, b supplémentaires). De plus, une cytotoxicité antitumorale accrue des neutrophiles CAR n'a été observée qu'en co-incubation avec des cellules GBM, notamment U87MG, GBM43 adulte primaire et des cellules pédiatriques SJ-GBM2 (Fig. 3c supplémentaire), démontrant la haute spécificité de notre CLTX. -VOITURE. Notamment, les neutrophiles CAR présentaient une biocompatibilité élevée avec les cellules gliales SVG p12 normales, les hPSC et les cellules dérivées de hPSC (Fig. 3d supplémentaire), ce qui concorde avec une observation précédente selon laquelle les neutrophiles primaires inactivés ne tuent pas les cellules saines . Collectivement, les neutrophiles CAR dérivés de hPSC, en particulier les neutrophiles CAR portant CD3ζ, ont présenté une cytotoxicité antitumorale améliorée et ont produit plus de ROS et de TNF in vitro, soulignant leur potentiel en immunothérapie ciblée.

Figure 1|Schéma d’une efficacité anti-glioblastome améliorée grâce à l’immunothérapie combinatoire de neutrophiles CAR et de nano-médicaments sensibles au microenvironnement tumoral. Les cellules souches pluripotentes humaines ont été conçues avec des CAR et différenciées en CAR-neutrophiles chargés de nanoparticules de silice brute (SiO2 NP) contenant de la tirapazamine ciblant l'hypoxie (TPZ) ou d'autres médicaments, en tant que double immunochimiothérapie. b CAR-neutrophile@R-SiO2- Les NPZ TPZ administrés par voie systémique attaquent d'abord les cellules tumorales normoxiques externes en formant des synapses immunologiques et tuent les cellules tumorales par phagocytose. Après l'apoptose, les neutrophiles CAR pourraient alors libérer des NP R-SiO2-TPZ, qui sont dépassées par les cellules tumorales. Ensuite, les nano-promédicaments répondent au microenvironnement hypoxique de la tumeur et tuent efficacement les cellules tumorales. Orthosilicate de tétraéthyle TEOS, bis[3-(triéthoxysilyl) propyl] tétrasulfure de BTES, tirapazamine TPZ, benzotriazinyle BTZ.

Les neutrophiles CAR ont maintenu des activités antitumorales supérieures dans des microenvironnements tumoraux immunosuppresseurs

Semblables aux macrophages, des phénotypes anti-tumoraux N1 et pro-tumoraux N2 de neutrophiles associés à la tumeur ont été trouvés dans le microenvironnement tumoral immunosuppresseur17. Les neutrophiles pro-tumoraux N2 jouent un rôle essentiel dans l'angiogenèse tumorale, les métastases et l'immunosuppression, mais le ciblage thérapeutique de ce type de cellule s'est avéré difficile.

Plutôt qu’une stratégie de déplétion systémique22, nous avons évalué ici le potentiel de l’ingénierie CAR pour maintenir le phénotype anti-tumoral des neutrophiles. Les neutrophiles dérivés de CAR hPSC et PB ont été traités avec de l'hypoxie (3% O2) et du TGF, qui contribuent à l'immunosuppression du microenvironnement tumoral 37,38, afin d'évaluer leur activité soutenue de destruction des tumeurs. Alors que les neutrophiles PB présentaient une cytolyse significativement réduite contre les cellules GBM dans des conditions immunosuppressives, les neutrophiles CAR maintenaient des activités de destruction des tumeurs élevées (Fig. 4a supplémentaire). Des observations similaires ont également été faites dans la libération de TNF et la génération de ROS (Fig. 4b, c supplémentaires) à partir de neutrophiles PB ou CAR dans des conditions immunosuppressives et normales. Pour confirmer davantage le phénotype des neutrophiles dans des conditions hypoxiques et TGF, nous avons mesuré l'expression de l'iNOS spécifique de N1- et de l'arginase spécifique de N2- N2- sur les neutrophiles isolés par cytométrie en flux (Fig. 4d–f). Par rapport à la normoxie, l'hypoxie immunosuppressive et le TGF ont significativement diminué les niveaux d'expression d'iNOS et augmenté les niveaux d'arginase dans les neutrophiles PB, alors que les neutrophiles CAR ont conservé des niveaux d'expression élevés d'iNOS. Des études antérieures indiquent que l'activation de la voie de signalisation Syk-Erk conduit à la production de ROS39-42. Par conséquent, nous avons détecté et comparé l'activation de Syk-Erk dans les neutrophiles non modifiés et les neutrophiles CAR, et nos résultats suggèrent une activation significativement plus élevée de la voie Syk-Erk dans les neutrophiles CAR sous hypoxie (Fig. Supplémentaire 5a – d), ce qui peut soutenir la production inchangée de ROS de neutrophiles CAR sous hypoxie. Pris ensemble, les CAR-neutrophiles ont conservé un phénotype antitumoral et ont maintenu des activités antitumorales élevées dans des conditions imitant le microenvironnement tumoral in vitro, soulignant leur potentiel en immunothérapie ciblée.

Figure 2|Criblage des structures de récepteurs d'antigènes chimériques (CAR) spécifiques aux neutrophiles avec des activités antitumorales améliorées médiées par les neutrophiles. un schéma de diverses structures de la RCA. b Schéma de la construction CAR #1 et de la stratégie d'activation ciblée au locus refuge AAVS1 des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). La flèche verticale indique l’AAVS1 ciblant le sgRNA. Les flèches horizontales rouges et bleues indiquent respectivement les amorces permettant de tester l’efficacité du ciblage et l’homozygotie. HDR : réparation par recombinaison homologue. c Schéma de différenciation optimisée des neutrophiles à partir des hPSC dans des conditions chimiquement définies. d Des tests de cytotoxicité contre des cellules de glioblastome U87MG ont été réalisés à différents rapports neutrophiles/cible tumorale en utilisant les neutrophiles indiqués. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type de cinq répétitions biologiques indépendantes, test t de Student bilatéral. La génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) (e) et l'analyse ELISA de la libération de TNF (f) de différents neutrophiles après coculture avec des cellules U87MG ont été déterminées. n=5 échantillons biologiquement indépendants. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type, test t de Student bilatéral. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données sources.

Préparation et caractérisation de neutrophiles CAR hPSC chargés de nanoparticules de SiO2 contenant de la tirapazamine (TPZ)

Les neutrophiles PB ont été utilisés comme porteurs cellulaires pour administrer des médicaments d'imagerie et thérapeutiques dans des tumeurs cérébrales8-10, bien que l'infiltration ciblée de neutrophiles nécessite une intervention chirurgicale ou une inflammation induite par la lumière et que l'administration de médicaments hors cible puisse être un problème11. Pour améliorer encore les activités antitumorales des neutrophiles CAR, nous avons préparé des nanoparticules de silice (SiO2-NP) avec une surface rugueuse ou lisse pour charger des médicaments chimiothérapeutiques ou radioactifs dans les neutrophiles. Les images au microscope électronique à transmission (TEM) ont démontré que les deux nanoparticules de SiO2 étaient bien dispersées et présentaient une morphologie sphérique de taille uniforme (Fig. 3a, Fig. 6a supplémentaire). L'analyse de la distribution de la composition par balayage TEM (STEM) avec spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDS) a montré que l'élément soufre (S) était uniformément réparti dans l'ensemble des nanoparticules brutes de SiO2 (R-SiO2) (Fig. 3b). En utilisant les isothermes d'adsorption-désorption de l'azote (N2) et l'analyse correspondante de la distribution de la taille des pores, les tailles des pores des NP R- et SSiO2 ont été mesurées à 25 nm et 35 nm (Fig. 3c, Fig. 6b supplémentaire), respectivement. Compte tenu de la surface élevée et de la grande taille des pores, les médicaments thérapeutiques pourraient être chargés efficacement dans les NP R- et S-SiO2, comme en témoigne la tirapazamine (TPZ), un pro-médicament sensible à l'hypoxie (Fig. 3d, Fig. 6c supplémentaire). . Après le chargement de TPZ, aucun changement significatif n'a été observé dans la dispersion, la morphologie et la taille du R-SiO 2- TPZ en utilisant l'analyse TEM et par diffusion dynamique de la lumière (Fig. Supplémentaire 6d, e). Les liaisons tétra-sulfure incorporées dans les NP R-SiO2 sont sensibles aux environnements réducteurs et peuvent être rapidement dégradées par la grande quantité de glutathion (GSH) présente dans les cellules tumorales43. Nous avons ensuite déterminé la dégradabilité sensible au GSH des NP R-SiO2 – TPZ en présence de 10 mM, 1 mM et 10 μM de GSH, qui étaient identiques aux conditions intracellulaires des cellules cancéreuses, des cellules normales et des environnements extracellulaires, respectivement. Lors d'un traitement au GSH 10 mM, la structure sphérique initiale des NP R-SiO2 – TPZ a été gravement détruite après 24 heures (Fig. Supplémentaire 6f, g). Les nanoparticules ont été complètement désintégrées en petits débris après 48 h, entraînant la libération de TPZ en réponse au GSH (Fig. 3e). Les débris de NP R-SiO2 n'ont provoqué aucune cytotoxicité significative pour les cellules testées in vitro (Fig. 6h supplémentaire), ce qui indique la sécurité relative des NP R-SiO2.

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Nous avons ensuite évalué la faisabilité de l'utilisation de NP SiO2 – TPZ pour charger des médicaments thérapeutiques dans les neutrophiles CAR en tant que chimio-immunothérapie combinatoire afin d'obtenir une efficacité thérapeutique accrue. Après centrifugation, nous avons mesuré l'absorption cellulaire des NP SiO2 – TPZ par les neutrophiles à l'aide d'un microscope à fluorescence et d'une analyse par cytométrie en flux (Fig. 3f, g), et avons détecté une absorption cellulaire plus significative des NP R-SiO2 – TPZ que celle des NP S-SiO2 –. TPZ NP par les neutrophiles. La teneur en Si cellulaire dans les neutrophiles a été mesurée à 11,3 et 19,1 ng Si/ug de protéine pour les NPs@TPZ de SiO2 lisses et rugueuses (Fig. 3h), respectivement, par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS). Compte tenu de leur capacité de charge élevée en neutrophiles, les NP R-SiO2 – TPZ ont été utilisées pour des expériences ultérieures. Nous avons ensuite cherché à tester les fonctions physiologiques des neutrophiles CAR après chargement de NP R-SiO2 – TPZ. Aucun changement n'a été observé dans la viabilité cellulaire (Fig. 3i, Fig. 6i supplémentaire), la capacité de migration transwell (Fig. 3j), la chimiotaxie et la vitesse correspondante (Fig. 3k, l) des neutrophiles CAR avant ou après le chargement de R-SiO2. –TPZ NPs, démontrant leur haute biocompatibilité. Une analyse de la charge de nano-médicament en fonction du temps a également été réalisée et le contenu de charge maximal a été atteint 1 heure après l'incubation des NP cellulaires (Fig. 7a supplémentaire). Plus de 95 % des neutrophiles CAR ont été chargés avec succès avec des NP R-SiO2 – TPZ (Fig. 7b supplémentaire). Le niveau d'expression de CD11b, une protéine de surface des neutrophiles qui assure la fonction d'adhésion et de migration lors de la stimulation d'une molécule inflammatoire, n'a pas été modifié sur les neutrophiles CAR avec ou sans charge R-SiO 2- TPZ (Fig. Supplémentaire 7c, d). Le superoxyde ou les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont libérés par les neutrophiles actifs pour tuer les microbes et les cellules tumorales44. Comme prévu, la génération de ROS par les neutrophiles CAR a été significativement augmentée après le traitement par N-Formylméthionine-leucyl-phénylalanine (fMLP), et aucune différence significative n'a été observée dans la production de ROS par les neutrophiles CAR avant et après le chargement de R-SiO2- TPZ (Fig. 3m). Prises ensemble, nos données ont démontré que les neutrophiles CAR chargés de R-SiO2-TPZ maintenaient les activités physiologiques des neutrophiles de type sauvage et pouvaient migrer activement vers des stimuli inflammatoires, soulignant leur potentiel dans la chimio-immunothérapie ciblée du cancer.

Les neutrophiles CAR chargés de nanoparticules R-SiO2-TPZ tuent efficacement les cellules de glioblastome

Nous avons ensuite évalué l'effet du R-SiO2-TPZ sur la capacité de destruction des tumeurs des neutrophiles CAR. L’interaction intime effecteur-cible était une condition préalable à la cytolyse médiée par les neutrophiles. Comme prévu, CAR-neutrophiles@R-SiO2-TPZ ont formé des synapses immunitaires avec des cellules tumorales en 2 h et ont présenté des nombres d'interactions effecteur-cible similaires à ceux des CAR-neutrophiles sans médicament (Fig. 4a, Fig. 8 supplémentaire) . Notamment, aucune interaction observable n'a été trouvée entre CAR-neutrophiles@RSiO2-TPZ et les cellules somatiques non cancéreuses (Fig. 8 supplémentaire), soulignant la spécificité du CLTX-CAR contre les tumeurs cérébrales. De plus, les NP R-SiO2 – TPZ ont été libérées par les neutrophiles dans le milieu de culture (Fig. 9a, b supplémentaires) 12 h après la co-culture et sont entrées dans les cellules tumorales restantes (Fig. 4a). Vingt-quatre heures après la co-incubation de neutrophiles CAR chargés de SiO2 – TPZ NP avec des cellules tumorales, jusqu'à 95 % des cellules tumorales contenaient des NP R-SiO2 – TPZ (Fig. 4a, Fig. 9c supplémentaire), indiquant une réussite cascade de transport impliquant des neutrophiles porteurs qui exercent leur fonction de cellule effectrice et subissent l'apoptose, libérant ainsi passivement des NP R-SiO2 – TPZ vers les cellules tumorales cibles . Nous avons également validé la fonction de réponse hypoxique et la cytotoxicité du pro-médicament TPZ dans les cellules tumorales par analyse par spectroscopie par résonance paramagnétique électronique (RPE) de la génération de radicaux à partir du TPZ (Fig. 9d supplémentaire) et analyse par cytométrie en flux de TOPRO-3 sur la tumeur. cellules (Fig. 9e supplémentaire) sous hypoxie et normoxie. Pour déterminer la cytolyse des neutrophiles CAR chargés de R-SiO2 – TPZ NP, nous avons mis en œuvre un modèle de relance de tumeur de normoxie-hypoxie in vitro (Fig. 4b). Vingt-quatre heures après la coculture normoxique, les neutrophiles CAR chargés ou non de NP R-SiO 2- TPZ présentaient une cytotoxicité anti-tumorale similaire (Fig. 4c), et les deux étaient supérieurs à ceux des neutrophiles PB chargés de R. -SiO2-TPZ NPs ou non et R-SiO2- TPZ NPs seuls. La cytotoxicité accrue est principalement due à la capacité accrue des neutrophiles à cibler les tumeurs après l’ingénierie CAR. Après une coculture hypoxique supplémentaire de 12 et 24- h avec des cellules tumorales, les neutrophiles CAR chargés de R-SiO2-TPZ NP ont montré une capacité antitumorale supérieure à celle des autres groupes (Fig. 4d, e). De plus, les neutrophiles CAR chargés de NP R-SiO 2- TPZ ont présenté une excellente cytolyse contre les cellules tumorales fraîches réensemencées (Fig. 4f), indiquant la capacité anti-tumorale du R-SiO 2- TPZ libéré. nanoparticules après l'apoptose des neutrophiles.

Nous avons ensuite effectué une analyse de séquençage d'ARN (RNA-seq) sur des cellules tumorales pour élucider le mécanisme moléculaire potentiel sous-jacent à la cytolyse antitumorale améliorée des neutrophiles par l'expression de CAR et les NP R-SiO2-TPZ. L'analyse de l'expression génique a démontré que, par rapport aux NP témoins et R-SiO2-TPZ, les neutrophiles CAR chargés avec ou sans R-SiO2-NPZ TPZ diminuaient significativement l'expression des gènes du cytoplasme et de la membrane dans les cellules tumorales ( Fig. 10a supplémentaire, Fig. 4g), renforçant davantage leur phagocytose des cellules tumorales lors d'une coculture. Alors que tous les groupes expérimentaux augmentaient le stress oxydatif cellulaire dans les cellules tumorales, les neutrophiles CAR chargés de R-SiO2-TPZ ont surpassé les autres groupes pour déclencher la signalisation du stress oxydatif. De plus, les neutrophiles CAR chargés de R-SiO2-TPZ favorisaient de manière significative l'apoptose et diminuaient la prolifération des cellules tumorales. Pour mieux comprendre les activités antitumorales améliorées des neutrophiles CAR chargés de R-SiO2-TPZ, nous avons appliqué un inhibiteur de phagocytose, la cytochalasine D, et un piégeur d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), la N-acétyl-cystéine (NAC) et un inhibiteur de ROS GSK2795039 à la coculture tumeur-neutrophile. La cytolyse des cellules tumorales par les neutrophiles CAR a été significativement réduite par 5 μM de cytochalasine D, 5 mM de NAC et 100 nM de GSK2795039 (Fig. Supplémentaire 10b, c), indiquant le rôle prédominant de la phagocytose et des ROS dans les cellules tumorales médiées par les neutrophiles CAR. meurtre. Les 40 % -50 % restants de lyse des cellules tumorales en présence de neutrophiles et de NAC ou GSK2795039 indiquent l'implication d'un mécanisme indépendant des ROS dans la destruction des tumeurs médiée par les neutrophiles, qui mérite une enquête plus approfondie.

Figure 3|Préparation et caractérisation de neutrophiles CAR hPSC chargés de nanoparticules de SiO2 contenant de la tirapazamine (TPZ). a – e Des images de cartographie élémentaire au microscope électronique à transmission (TEM) (a) et par spectroscopie à dispersion d'énergie (EDS) (b) de nanoparticules brutes de SiO2 sont présentées. c L'isotherme d'adsorption-désorption d'azote des nanoparticules brutes de SiO2 ainsi que le tracé de distribution de la taille des pores de Barrett-JoynerHalenda (BJH) sont présentés. Des triples biologiques ont été réalisés indépendamment. La teneur en charge de TPZ en nanoparticules de SiO2 (d) et la libération de TPZ sensible au glutathion (GSH) -- (e) ont été mesurées à l'heure indiquée. n=3 échantillons biologiquement indépendants. Analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) pour (e). Images de fluorescence (f) et analyse par cytométrie en flux (g) de neutrophiles chargés de SiO2-TPZ lisse et rugueux. Des triples biologiques ont été réalisés indépendamment. h La teneur en SiO2 cellulaire dans les neutrophiles CAR dérivés de hPSC a été mesurée. n=5 échantillons biologiquement indépendants, test t de Student bilatéral. Viabilité cellulaire (i), n=3 échantillons biologiquement indépendants, transmigration (j), n=5 échantillons biologiquement indépendants, capacités de chimioattraction (k, l), n=20 échantillons biologiquement indépendants, et La capacité de génération de ROS (m) de neutrophiles CAR dérivés de hPSC chargés avec ou sans SiO 2-TPZ brut a été démontrée, n=5 échantillons biologiquement indépendants, test t de Student bilatéral. PMA : acétate de myristate de phorbol. Toutes les données de cette figure sont représentées en moyenne ± SD. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données sources.

Évaluation fonctionnelle des neutrophiles CAR chargés de nanomédicaments à l'aide de modèles biomimétiques de glioblastome in vitro

Pour évaluer plus en détail les activités des neutrophiles CAR chargés de R-SiO 2- TPZ NP, nous avons mis en œuvre un modèle de tumeur de barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​basé sur Transwell utilisant des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (Fig. 5a, Fig supplémentaire .11a). Comme prévu, les neutrophiles CAR chargés de R-SiO 2- TPZ NP ont présenté une excellente capacité de transmigration dans le modèle BBB in vitro (Fig. 5b), tuant efficacement les cellules tumorales ciblées après transmigration dans des conditions normoxiques et hypoxiques (Fig. 5c). , d) et en libérant davantage de cytokines inflammatoires (Fig. 5e) qui peuvent attirer d'autres cellules effectrices pour tuer les cellules tumorales. De plus, les neutrophiles CAR n'ont pas affecté de manière significative la viabilité des cellules endothéliales après transmigration (Fig. 11b supplémentaire). Les neutrophiles CAR chargés de R-SiO 2- TPZ NP ont conservé une excellente capacité de transmigration au cours de la deuxième expérience de transmigration (Fig. 5f) et une capacité antitumorale supérieure par rapport aux autres groupes (Fig. 5g). Un modèle sphéroïde de tumeur tridimensionnel (3D) a ensuite été utilisé pour évaluer la capacité de pénétration tumorale des neutrophiles CAR chargés de R-SiO 2- TPZ NP (Fig. 5h). Les neutrophiles CAR ont progressivement migré vers le centre du sphéroïde tumoral et se sont répartis uniformément dans le sphéroïde après 8 h d'incubation (Fig. 5i). Un degré élevé de colocalisation entre les neutrophiles CAR et les NP R-SiO 2- TPZ a été observé (Fig. 12a – c supplémentaire), démontrant que les NP R-SiO 2- TPZ étaient encapsulés de manière stable dans le CAR. -les neutrophiles lors de l'infiltration tumorale avant leur cytolyse. Sans délivrance médiée par les neutrophiles, les NP R-SiO2-TPZ n'ont été trouvées que sur la couche externe des sphéroïdes tumoraux. Comparés aux NP R-SiO2-TPZ et aux neutrophiles CAR, les neutrophiles CAR chargés de R-SiO2-TPZ NP présentaient une cytolyse anti-tumorale supérieure dans le modèle de tumeur 3D (Fig. 5j). Les NP CAR-neutrophiles@R-SiO2 peuvent également être utilisées pour administrer d'autres médicaments, notamment le témozolomide clinique (TMZ) et le JNJ- 64619187, dans des modèles de tumeurs 3D et tuer efficacement les cellules GBM (Fig. 12d – f supplémentaire). Pris ensemble, les neutrophiles CAR combinatoires et les nanomédicaments ont présenté d’excellentes activités antitumorales dans le microenvironnement tumoral biomimétique imitant des conditions in vitro, soulignant le potentiel thérapeutique de la chimio-immunothérapie combinatoire à base de neutrophiles.

cistanche tubulosa-améliorer le système immunitaire

Distribution in vivo des nanoparticules R-SiO2-TPZ délivrées par les neutrophiles CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20 % des nanomédicaments administrés ont été administrés aux tumeurs cérébrales par les neutrophiles CAR, contre 1 % par les nanomédicaments libres, ce qui concorde avec les rapports précédents6. L'administration ciblée de NP R-SiO 2- TPZ au cerveau hôte à travers la BBB par les neutrophiles CAR a également été confirmée par analyse histologique (Fig. 6d). Au contraire, les NP R-SiO2-TPZ seuls se sont principalement accumulés dans le foie et la rate. Collectivement, nos données ont démontré une délivrance ciblée améliorée de NP R-SiO2-TPZ par les neutrophiles CAR sans qu'il soit nécessaire d'induire une inflammation supplémentaire au niveau du site de la tumeur, soulignant la faisabilité et la sécurité de la chimio-immunothérapie à base de neutrophiles dans le traitement du cancer.

La chimio-immunothérapie combinée des nanoparticules CAR-neutrophiles et R-SiO2-TPZ a présenté d'excellentes activités anti-glioblastome in vivo

Pour déterminer l'efficacité thérapeutique des neutrophiles CAR chargés de R-SiO2-TPZ NP, un modèle de xénogreffe in situ de glioblastome a été établi chez les souris NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) en utilisant des cellules U87MG exprimant la luciférase. Des souris porteuses de tumeurs ont reçu par voie intraveineuse 5 × 106 neutrophiles par semaine (Fig. 7a), et la charge tumorale chez les hôtes a été mesurée et quantifiée (Fig. 7b, c). Comparé aux souris traitées au PBS ou aux neutrophiles PB, le traitement avec les neutrophiles CAR et les NP CAR neutrophile@R-SiO2 – TPZ a effectivement ralenti la croissance tumorale. Les neutrophiles CAR@R-SiO2 – TPZ NP présentaient une cytotoxicité antitumorale beaucoup plus élevée que tout autre groupe expérimental. Au contraire, les neutrophiles PB ont favorisé de manière significative la croissance tumorale dans le cerveau, entraînant la mort de souris porteuses de tumeurs dès le 23e jour (Fig. 7d), ce qui suggère que les neutrophiles non modifiés peuvent présenter des risques supplémentaires. Nous avons ensuite mesuré la libération de cytokines humaines dans le plasma de différents groupes expérimentaux de souris (Fig. 7e). Tous les groupes expérimentaux non PBS ont produit du TNF et de l'IL -6 détectables dans le plasma du jour 5 au jour 26, suggérant l'activation des neutrophiles humains lors de la stimulation de la tumeur. Conformément au taux de croissance tumorale plus élevé observé, les neutrophiles non modifiés ont progressivement libéré davantage d'IL-6 et de TNF, ce qui peut conduire à un syndrome de libération de cytokines chez les patients et nécessiter des études d'innocuité plus approfondies avec les inhibiteurs de l'IL-646,47. . Notamment, les NP CAR-neutrophiles @ RSiO2 – TPZ ont présenté une diminution de la capacité de production de cytokines à des moments ultérieurs (jour 19 et jour 26), suggérant un risque potentiellement faible de syndrome de libération de cytokines chez les patients traités par chimio-immunothérapie à base de neutrophiles CAR. La biocompatibilité des neutrophiles CAR-neutrophiles combinatoires et des NP R-SiO2 – TPZ a été évaluée par la mesure hebdomadaire du poids corporel et la surveillance des changements pathologiques dans les principaux organes de souris. Aucune différence de poids corporel n'a été observée entre les souris traitées par neutrophiles CAR @ R-SiO2 – TPZ NP et tout autre groupe expérimental (Fig. 7f), indiquant une toxicité systémique minimale et une excellente biocompatibilité des neutrophiles CAR @ R-SiO2 – TPZ NP dans 28 jours de traitement. L'analyse histologique des principaux organes prélevés sur des souris au jour 30 a montré que les souris traitées avec CAR-neutrophiles@R-SiO2–TPZ NP ne provoquaient pas d'anomalie notable ni de lésions organiques au niveau du cœur, du foie, de la rate, des poumons et des reins (Fig. 13), confirmant en outre l’innocuité des neutrophiles CAR-neutrophiles combinatoires et des NP R-SiO2 – TPZ.

Figure 4|Les neutrophiles CAR chargés de nanoparticules R-SiO2-TPZ tuent efficacement les cellules de glioblastome. Des images représentatives de synapses immunologiques indiquées par une accumulation polarisée de F-actine à l'interface entre les neutrophiles CAR et les cellules tumorales à 6, 12 et 24 h ont été présentées. Les nanoparticules R-SiO2-TPZ libérées par les neutrophiles CAR lors de la phagocytose des cellules tumorales ont été absorbées par les cellules tumorales. Des triples ont été réalisés indépendamment. b Schéma du test de cytotoxicité antitumorale médiée par les neutrophiles. La cytotoxicité contre les cellules de glioblastome U87MG a été réalisée à différents rapports neutrophiles/cible tumorale en utilisant les neutrophiles indiqués à 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e) et 72 h (f). n=3 échantillons biologiquement indépendants. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD, analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). g Une analyse de séquençage d'ARN en masse a été réalisée sur des cellules U87MG dans diverses conditions. La carte thermique montre les niveaux d'expression de gènes sélectionnés du cytoplasme, de la membrane, du stress oxydatif, de l'apoptose et de la prolifération dans les cellules de glioblastome indiquées. n=2 échantillons biologiquement indépendants. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données sources.

Figure 5|Évaluation fonctionnelle des neutrophiles CAR chargés de nanoparticules R-SiO2-TPZ à l'aide de modèles de glioblastome biomimétique (GBM) in vitro. un schéma de notre modèle de tumeur in vitro de GBM avec barrière hémato-encéphalique (BBB), composée de cellules endothéliales sur la membrane de l'insert cellulaire et de cellules tumorales au fond du même transwell. b L'analyse de migration Transwell des neutrophiles à 12 h est présentée. La cytotoxicité anti-GBM des neutrophiles indiqués à 24 h (c) et 36 h (d) a été mesurée et quantifiée. L'analyse ELISA de l'IL-6 et du TNF libérés par les neutrophiles indiqués à 36 h a été réalisée. f La deuxième migration de différents neutrophiles à 48 h est affichée. g La cytotoxicité anti-GBM des neutrophiles indiqués à 60 h a été mesurée et quantifiée. h – j Un schéma d'un modèle de tumeur tridimensionnelle (3D) infiltré par des neutrophiles in vitro a été présenté en (h). Des images fluorescentes représentatives de neutrophiles infiltrés dans les modèles de tumeurs 3D ont été présentées. Le DAPI a été utilisé pour colorer le noyau cellulaire et le CD45 pour colorer les neutrophiles. Barres d'échelle, 200 μm. Des triples biologiques ont été réalisés indépendamment. j La capacité correspondante de destruction des tumeurs des neutrophiles indiqués a été mesurée et quantifiée à l'aide d'un kit de cytotoxicité. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type de cinq répétitions biologiques indépendantes, analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données sources.

Alors que les NP CAR-neutrophile@R-SiO2 – TPZ ont considérablement ralenti la croissance tumorale chez les souris xénogreffes, la différence de survie des animaux dans les groupes expérimentaux de neutrophiles CAR, de NP SiO2 – TPZ et de NP CAR-neutrophile@R-SiO2 – TPZ est insignifiante. (p > 0.05), ce qui est probablement dû à la mort des neutrophiles de courte durée lors de la préparation et de l'injection des cellules. Nous nous sommes ensuite concentrés sur ces trois groupes et avons déterminé si une réduction du temps de préparation des cellules et une augmentation des doses de neutrophiles CAR et de nanomédicaments feraient une différence dans la survie des animaux (Fig. 7g). Lorsqu'ils ont été administrés par voie systémique 6 fois, les NP CAR-neutrophile@R-SiO2 – TPZ ont surpassé les deux autres groupes en prolongeant la durée de vie des souris porteuses de tumeurs (Fig. 7h), alors que la différence de survie des animaux dans les groupes de neutrophiles CAR et SiO2– Les NP TPZ sont restés insignifiants. Bien qu'une courbe de survie similaire du groupe R-SiO2- TPZ ait été observée entre ces deux études indépendantes sur des animaux, le temps d'isolement cellulaire et de préparation à l'injection a été réduit d'un total d'environ 4 heures à 1 heure au cours des 4 premiers neutrophiles. les doses ont conduit à une amélioration de la survie des animaux dans les groupes CAR-neutrophiles avant le 32e jour. Collectivement, nos données ont démontré l'importance de la préparation des neutrophiles et de l'optimisation du dosage dans les futures applications cliniques des thérapies neutrophiles.

Discussion

Il a été démontré que les neutrophiles de souris constituent un puissant vecteur permettant d’administrer efficacement des nanomédicaments aux tumeurs cérébrales postopératoires enflammées8,9. Pourtant, la faisabilité et la sécurité de l’utilisation de neutrophiles humains pour l’administration de médicaments restent insaisissables. La grande quantité de neutrophiles de souris (10 fois supérieure au nombre total de neutrophiles en circulation chez la souris11) utilisée dans ces études pour obtenir un bénéfice thérapeutique peut encore entraver leur application clinique puisque l'extraction d'un grand nombre de neutrophiles chez des patients atteints de cancer peut conduire à une neutropénie et poser d'autres risques. Pour relever ces défis, nous avons exploité le pouvoir des hPSC auto-renouvelées pour obtenir un nombre illimité de neutrophiles humains de novo29. Nous avons développé un puissant système d'administration de médicaments bioinspiré par les neutrophiles avec l'ingénierie CAR29 et utilisé des neutrophiles CAR humains modifiés comme nanosupport doté d'activités antitumorales frappantes. Les NP SiO2 rugueuses fonctionnent mieux que les NP SiO2 lisses chez les porteurs de neutrophiles CAR, ce qui concorde avec les observations précédentes selon lesquelles les neutrophiles phagocytent préférentiellement les agents pathogènes microbiens rugueux . Il a été rapporté que les neutrophiles favorisaient la prolifération et la progression des cellules de gliome48. Nous avons observé un effet pro-tumoral similaire des neutrophiles non modifiés dans notre étude animale, soulignant la nécessité de l'ingénierie CCAR ou d'autres modifications des neutrophiles pour garantir leur sécurité dans l'administration de médicaments et d'autres applications thérapeutiques. Notamment, notre administration de médicaments médiée par les neutrophiles CAR dépend uniquement de la capacité chimio-attractive native du GBM, mais pas des signaux inflammatoires post-chirurgicaux amplifiés, ce qui suggère la haute spécificité et le potentiel thérapeutique de notre système d'administration de médicaments pour éradiquer les gliomes profondément infiltrés. qui ne peut être enlevé par chirurgie. Étant donné que la résection chirurgicale et la chimiothérapie/radiothérapie adjuvante sont les principales interventions cliniques pour le GBM12, un traitement combiné avec des nanoporteurs de neutrophiles CAR et une chirurgie/radiothérapie peut atteindre une efficacité thérapeutique optimale et mérite une étude plus approfondie. Les constructions CAR spécifiques aux cellules T et NK ont été largement utilisées pour améliorer les activités antitumorales des cellules T et NK, mais les CAR spécifiques aux neutrophiles qui améliorent les fonctions antitumorales des neutrophiles n'ont pas été décrits. Il a déjà été rapporté que les récepteurs immunitaires chimériques CD4ζ et CD4 améliorent la cytolyse des neutrophiles contre les cellules transfectées par HIVenv in vitro. Pourtant, l’efficacité de la lyse n’était que d’environ 10 % avec un rapport effecteur/cible (E : T) de 10 : 128. Le Fc RIIA (CD32a) est un récepteur transmembranaire à chaîne unique de faible affinité pour les IgG monomères qui est fortement exprimé dans les neutrophiles (30,000 à 60,000 molécules/cellule31), et sa ligature induit du Fc - fonctions dépendantes des neutrophiles, telles que la libération du contenu des granules, la mobilisation du Ca2+, la cytotoxicité anti-tumorale et la phagocytose49. Compte tenu du rôle prédominant du CD32a dans l’activation et la fonction des neutrophiles, nous avons conçu et testé des constructions CAR basées sur le CD32a. Cependant, nos résultats ont démontré que CD3ζ assure une cytolyse significativement meilleure que CD32a lorsqu'il est exprimé dans des neutrophiles dérivés de hPSC, ce qui peut être en partie dû aux copies plus élevées d'ITAM dans CD3ζ que dans CD32a : trois et une copies, respectivement, et des niveaux d'expression plus élevés de ζ qu’à la surface cellulaire des neutrophiles28. Comme CD32a, Fc RIII (CD16b) est un autre récepteur de faible affinité pour les IgG monomères et est exprimé à un niveau beaucoup plus élevé que CD32a sur les neutrophiles31. Bien que la réticulation de CD16b n'induit que la mobilisation et la dégranulation du Ca2+, mais pas la phagocytose ni la cytolyse des neutrophiles28,50, il sera toujours intéressant dans les études futures d'effectuer une comparaison systématique des capacités de CD3ζ- et CD16b. -CARs dans le déclenchement et l’amélioration des fonctions antitumorales des neutrophiles.

Figure 6|Distribution in vivo des nanoparticules R-SiO2-TPZ (NP) délivrées par les neutrophiles CAR. un schéma des neutrophiles CAR marqués au Cy5- et des NP R-SiO2 et R-SiO2 administrés par voie intraveineuse pour une étude de suivi cellulaire in vivo. 5 × 105 cellules U87MG exprimant la luciférase (Luci) ont été implantées par stéréotaxie dans le cerveau antérieur droit de souris NRG. Après 4 jours, les souris ont été traitées par voie intraveineuse avec du PBS, 5 × 106 Cy5-neutrophiles CAR marqués @R-SiO2 NP et R-SiO2 NP. b La biodistribution en fonction du temps des neutrophiles Cy5+ dans tout le corps, le cerveau et d'autres organes a été déterminée et quantifiée par imagerie par fluorescence aux heures indiquées. c La biodistribution des NP neutrophiles CAR@R-SiO2 et des NP R-SiO2 chez la souris 24 h après l'injection a été analysée par spectrométrie d'émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES) basée sur l'élément Si, et les données ont été exprimées en pourcentage. de dose injectée par gramme de tissu (%ID/g). n=5 échantillons biologiquement indépendants. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données sources. d Des images de fluorescence représentatives de CD45 et de SiO2 dans les xénogreffes de glioblastome indiquées, isolées de souris porteuses de tumeurs, ont été présentées. Barres d'échelle, 100 μm. Des triples biologiques ont été réalisés indépendamment.

Figure 7|Les activités antitumorales in vivo des nanoparticules combinatoires CAR-neutrophiles et des nanoparticules R-SiO2-TPZ (NP) ont été évaluées par injection intraveineuse. un schéma des NP PBS, PB-neutrophiles, CAR-neutrophiles et CAR-neutrophiles @ R-SiO2-TPZ administrés par voie intraveineuse pour une étude in vivo de destruction des tumeurs. 5 × 105 cellules U87MG exprimant la luciférase (Luci) ont été implantées par stéréotaxie dans le cerveau antérieur droit de souris NRG. Après 4 jours, les souris ont été traitées par voie intraveineuse avec les neutrophiles indiqués chaque semaine pendant un mois. La charge tumorale en fonction du temps a été déterminée (b) et quantifiée (c) par imagerie bioluminescente (BLI) aux jours indiqués. Les données sont moyennes ± SD pour les souris dans (b) (n=5), analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). d La courbe de Kaplan-Meier démontrant la survie des groupes expérimentaux indiqués (n=5) a été affichée. Le facteur de nécrose tumorale humaine (TNF) et l'IL-6 libérés dans le sang périphérique (e) et le poids corporel (f) de différents groupes de souris ont été mesurés aux jours indiqués. Les données sont des moyennes ± SD, n=5 échantillons biologiquement indépendants. g, h L'activité antitumorale des fréquences de dosage accrues des neutrophiles CAR et des NP RSiO 2- TPZ a été évaluée. g Schéma des neutrophiles CAR administrés par voie intraveineuse, des NP R-SiO 2- TPZ et des NP CAR-neutrophile @ R-SiO 2- TPZ pour une étude de destruction des tumeurs in vivo. h La courbe de Kaplan-Meier démontrant la survie des groupes expérimentaux indiqués a été affichée (n=5). Les courbes de Kaplan – Meier ont été analysées par le test du log-rank. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données sources.

Nous avons également présenté ici une plateforme modulaire et polyvalente d'administration de médicaments pour les neutrophiles hPSC qui pourrait être repensée et ajustée à l'avenir pour soutenir d'autres efforts basés sur les neutrophiles pour traiter d'autres maladies humaines. Premièrement, l’ingénierie CAR est plus accessible dans les hPSC que dans les cellules T immunitaires primaires et les neutrophiles. Cela ne nécessite qu’une édition unique du génome pour obtenir une expression stable et homogène de divers CAR29. En plus des CAR CLTX, nous avons également construit des lignées hPSC stables qui expriment un CAR52 anti-fluorescéine (FITC) universel ou anti-PD-L1, qui pourraient tous deux être exploités pour obtenir des neutrophiles CAR nanoporteurs universels ciblant les tumeurs solides. D’autres modifications génétiques, telles que la fibrose ciblant les CAR anti-FAP53, peuvent également être réalisées pour diriger les nanoporteurs de neutrophiles vers le traitement des maladies dégénératives mortelles, notamment les traumatismes cérébraux et la fibrose cardiaque. En outre, les hPSC exprimant CAR pourraient également être facilement adaptées pour produire des cellules CAR-T ou CAR-NK , et des combinaisons de ces immunothérapies avec des nanoporteurs de neutrophiles CAR pourraient obtenir des avantages thérapeutiques anti-tumoraux optimaux. Enfin, notre système de nanomédicaments bioinspirés sensibles au glutathion tumoral (GSH) est une plate-forme modulaire et polyvalente permettant de charger des médicaments chimiothérapeutiques ou radioactifs prometteurs dans des neutrophiles CAR pour une administration ciblée de médicaments, comme l'illustre le TMZ clinique, le JNJ64619187 et le pro-médicament TPZ. De futures études sur le test d'autres nanoparticules pourraient permettre d'optimiser la charge de médicament dans les neutrophiles et d'atteindre une efficacité thérapeutique in vivo maximale.

Bien que nous ayons démontré le concept thérapeutique consistant à utiliser les neutrophiles CAR pour administrer spécifiquement et efficacement des médicaments chimio aux tumeurs cérébrales de l'ensemble du BBB, cette étude présente quelques limites. Premièrement, l'inoculation de cellules tumorales pendant 4- jours pourrait ne pas suffire à établir des tumeurs qui imitent le scénario clinique pour l'investigation thérapeutique, et des travaux futurs avec différentes périodes d'inoculation de tumeurs sont nécessaires pour récapituler les différents stades de développement du glioblastome et la réponse thérapeutique dans différents patients54,55. Deuxièmement, les souris immunodéficientes que nous avons utilisées ici manquent d’immunité adaptative et d’autres modèles précliniques dotés d’un système immunitaire intact, tels que les chiens de compagnie atteints de gliome spontané56, sont nécessaires pour mieux évaluer l’innocuité et l’efficacité des neutrophiles CAR produits in vitro. En particulier, le profilage de la toxicité hors cible des neutrophiles CAR avec ou sans chargement de nanomédicaments chez les animaux perfusés, y compris le syndrome de libération de cytokines, la neurotoxicité et les toxicités hors tumeur ciblées observées dans les cellules CAR-T57, est nécessaire, malgré la courte durée de vie. des neutrophiles. Bien que des approches réalisables, telles que l'ingénierie de hPSC de donneurs universels hypoimmunogènes58-61 et la banque de bibliothèques de hPSC homozygotes d'antigène leucocytaire humain (HLA)62, soient facilement disponibles pour éviter le risque potentiel de maladie du greffon contre l'hôte (GvHD), des modèles animaux précliniques avec un un système immunitaire intact sont encore nécessaires pour évaluer le potentiel translationnel de nos thérapies neutrophiles. Enfin, une cytotoxicité antitumorale limitée et une prolongation de la durée de vie des animaux grâce aux nanomédicaments CAR-neutrophiles ont été observées. Par conséquent, l’exploration future de médicaments de chimiothérapie ou de radiosensibilisants plus efficaces, ainsi que de thérapies combinatoires avec CAR-T classique et résection chirurgicale, est essentielle pour obtenir une efficacité antitumorale maximale des thérapies CAR-neutrophiles. Par exemple, une étude récente sur la conception basée sur les mécanismes a conduit à un médicament KL-50 plus efficace qui surmonte la résistance acquise comme observé dans le médicament clinique TMZ63 et peut ainsi être incorporé dans notre plateforme modulaire de nanomédicaments CAR-neutrophiles pour un potentiel potentiel. meilleure efficacité thérapeutique. L'extension de la durée de conservation des neutrophiles à 5 jours via un traitement CLON-G (caspases-perméabilisation de la membrane lysosomale-oxydation-nécroptose plus facteur de stimulation des colonies de granulocytes64) et/ou l'utilisation d'un système de libération contrôlée de médicament à plus long terme dans les neutrophiles CAR peut également obtenir une efficacité antitumorale in vivo soutenue après l'apoptose des neutrophiles. Collectivement, nos résultats ont clairement démontré que les neutrophiles CAR chargés de R-SiO2 – TPZ pouvaient maintenir le phénotype anti-tumoral N1 et tuer efficacement les cellules tumorales dans diverses conditions de type niche tumorale in vitro. Des neutrophiles CAR fonctionnels pourraient également être produits en grande quantité à partir de hPSC modifiées pour administrer avec précision des nanomédicaments sensibles au microenvironnement tumoral afin de cibler le GBM in vivo, conduisant à une chimio-immunothérapie combinée avec des activités anti-GBM robustes et spécifiques et une administration minimale de médicaments hors cible qui durée de vie prolongée chez les souris porteuses de tumeurs.

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