Autophagie médiée par un chaperon dans les maladies neurodégénératives et les agressions neurologiques aiguës du système nerveux central, partie 2

4. Outils de recherche expérimentale pour évaluer l'activité de la CMA

Dans cette section, nous décrivons les outils de recherche expérimentale disponibles pour tester l’activité CMA in vitro et in vivo. Les méthodes couramment utilisées pour obtenir des informations corrélées à l'activité du CMA ainsi qu'aux tests fonctionnels du CMA.

CMA (Certified Management Accountant) est une certification professionnelle de comptable en management, qui vise à certifier des personnes possédant des compétences opérationnelles et des connaissances professionnelles suffisantes dans le domaine de la comptabilité de gestion. La mémoire, une capacité du cerveau humain, fait référence à la capacité de se souvenir d'informations, de connaissances ou d'expériences.

Il existe une certaine relation entre CMA et mémoire. Tout d'abord, l'examen CMA exige que les candidats mémorisent un grand nombre de points de connaissances et de concepts, et exigent en même temps que les candidats maîtrisent les compétences nécessaires pour appliquer ces points de connaissances. Par conséquent, une excellente mémoire jouera un rôle très important dans l’obtention de bons résultats à l’examen CMA.

Deuxièmement, la mémoire peut être améliorée grâce à l’apprentissage et à la pratique, ce qui aide également à préparer l’examen CMA. Par exemple, en révisant à plusieurs reprises les points de connaissances, en apprenant et en mémorisant les informations de différentes manières et en utilisant des techniques de mémoire, vous pouvez améliorer la mémoire et aider les candidats à mieux maîtriser les points de connaissances et les compétences requises pour l'examen CMA.

Enfin, étudier CMA n’est pas seulement un examen, mais aussi une amélioration de la qualité professionnelle. En évolution de carrière, si vous souhaitez mieux exercer vos capacités professionnelles, vous avez naturellement besoin d'une certaine capacité de mémoire pour vous aider à mieux accomplir vos tâches de travail.

Bref, il existe une relation étroite entre CMA et mémoire. Essayer d'améliorer votre mémoire vous aidera non seulement à obtenir de bonnes notes, mais également à mieux accomplir vos tâches professionnelles et à réaliser votre valeur personnelle et vos réalisations professionnelles au fur et à mesure que votre carrière évolue. On peut voir que nous devons améliorer notre mémoire, et Cistanche deserticola peut améliorer considérablement la mémoire car elle a des effets antioxydants, anti-inflammatoires et anti-âge, qui peuvent aider à réduire l'oxydation et l'inflammation dans le cerveau, protégeant ainsi la santé de le système nerveux. De plus, Cistanche deserticola peut également favoriser la croissance et la réparation des cellules nerveuses, améliorant ainsi la connectivité et le fonctionnement du réseau neuronal. Ces effets peuvent contribuer à améliorer la mémoire, la capacité d’apprentissage et la vitesse de réflexion, et peuvent également prévenir l’apparition de dysfonctionnements cognitifs et de maladies neurodégénératives.

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4.1. Analyses utiles pour le suivi de l'activité de la CMA

L'évaluation des changements dans les quantités des principaux composants moléculaires du CMA peut être utilisée comme moyen indirect d'évaluer l'activité du CMA (46). De plus, le nombre et la répartition des lysosomes actifs en CMA peuvent être analysés pour déduire des changements dans l'activité du CMA (46).

Toutefois, ces analyses ne fournissent que les données corrélées au statut de RMR. Ainsi, ces analyses doivent être complétées par des tests fonctionnels [47]. L'immunotransfert et l'imagerie pour évaluer les modifications des principaux composants du CMA sont les méthodes les plus couramment utilisées pour évaluer l'activité du CMA.

Étant donné que les niveaux lysosomals de LAMP2A sont limités pour le CMA (48), les changements dans l'abondance de la protéine LAMP2A dans les lysosomes sont généralement en corrélation avec l'activité du CMA. Par conséquent, lors des évaluations par imagerie, la présence de LAMP2A au niveau de la membrane lysosomale doit être analysée (47).

L'immunotransfert pour LAMP2A utilisant des fractions enrichies en lysosomes ou au moins une fraction de cellules membranaires est plus informatif que celui utilisant des lysats totaux de cellules entières (46). Les niveaux de lysosomal-hsc70 sont également liés à l'activité CMA (49).

Cependant, hsc70 est l’un des chaperons cellulaires les plus abondants, et la fraction située dans les lysosomes est faible. Par conséquent, l’immunotransfert pour hsc70 dans les lysats cellulaires totaux n’est pas informatif pour le CMA (46). La colocalisation de hsc70 avec des marqueurs lysosomal (par exemple, LAMP1) peut être utilisée pour détecter les lysosomes actifs dans le CMA (49).

Le nombre de ces lysosomes colocalisés avec hsc70 proportionnellement à l'ensemble du pool lysosomal augmente lorsque le CMA est activé (12). De plus, une analyse au microscope électronique utilisant la coloration immunogold pour hsc70 peut également fournir des informations sur le pool de lysosomes actifs au CMA (49).

Dans les analyses utilisant des lysosomes isolés de cellules ou de tissus, des niveaux accrus de substrats bien connus du CMA (par exemple, GAPDH) peuvent indiquer une diminution de l'activité du CMA (46).

En général, les substrats CMA sont rapidement dégradés après translocation [6]. Ainsi, une comparaison des niveaux lysosomals de substrats CMA dans des cellules ou des animaux entre des modèles traités ou non traités avec des inhibiteurs de protéases lysosomales (c'est-à-dire la leupeptine) permet de mesurer le flux des valeurs CMA [24].

4.2. Tests fonctionnels

Plusieurs tests fonctionnels permettent de suivre l’activité du CMA au fil du temps dans les cellules, les tissus et les organites isolés.

4.2.1. Évaluation de la dégradation des protéines intracellulaires

Environ 30 % des protéines cytosoliques totales peuvent être dégradées par le CMA [9]. Cependant, la fraction réelle de protéine cytosolique dégradée par le CMA varie en fonction du type de cellule et des conditions cellulaires [6].

Par conséquent, la mesure du pool de protéines cellulaires qui subissent une dégradation par la CMA est une méthode courante pour déterminer l'activité globale de la voie CMA (46).

Des expériences d'impulsion et de poursuite utilisant un acide aminé radiomarqué et des inhibiteurs des protéases lysosomales ou d'autres voies autophagiques peuvent être utilisées pour distinguer les protéines subissant une dégradation par le CMA de celles gérées par d'autres voies (50).

4.2.2. Reporters CMA photoconvertibles

De plus, une méthode de surveillance de l'association lysosomale des rapporteurs CMA fluorescents artificiels serait également utile pour suivre la livraison et la dégradation du substrat à travers la CMA (51).

En utilisant des rapporteurs fluorescents photoconvertibles [51], il est possible de suivre l'association de la protéine photoconvertie avec des lysosomes dans un canal de fluorescence différent. Une augmentation du nombre de points fluorescents par cellule serait un bon indicateur de l'activation du CMA [46].

4.2.3. Analyses in vitro de CMA utilisant des lysosomes isolés

Les interactions entre les différentes voies autophagiques rendent difficile l'évaluation précise de l'activité du CMA dans les cellules intactes (41). Par conséquent, nous devons analyser séparément toutes les étapes fonctionnelles impliquées dans le processus de dégradation dynamique des voies CMA (46, 49).

L'approche la plus fiable pour analyser l'activité du CMA est obtenue par reconstitution in vitro du CMA avec des lysosomes isolés [52]. L'isolement de la fraction spécifique des lysosomes actifs dans le CMA permet une analyse du contenu des substrats endogènes du CMA dans les compartiments du CMA [47].

Les lysosomes isolés permettent également la reconstitution du CMA in vitro pour suivre les étapes impliquées dans la liaison processus-substrat du CMA, l'absorption lysosomale et la dégradation lysosomale (50).

Un traitement avec des inhibiteurs de protéase lysosomale suivi d'une incubation avec le substrat CMA permettra de mesurer la quantité liée au substrat et transloquée dans les lysosomes (liaison et absorption) [39].

En ne tenant pas compte de la quantité de substrat lié aux lysosomes dans laquelle la protéolyse n'a pas été empêchée, il serait alors possible de calculer l'absorption [39, 53].

Les fractions lysosomales isolées permettent également la comparaison directe des changements dans le contenu, les modifications post-traductionnelles et l'organisation des composants CMA au niveau de la membrane lysosomale. Les réductions des niveaux lysosomal de LAMP2A ou de lys-hsc70 dans les lysosomes isolés indiquent une diminution de l'activité du CMA (54, 55), tandis que les augmentations des niveaux de LAMP2A suggèrent une régulation positive de l'activité du CMA (56).

De plus, le rapport de LAMP2A lysosomal assemblé en un complexe multimère à un moment donné peut être déterminé par électrophorèse bleuenative de lysosomes isolés et immunoblot pour LAMP-2A (57).

5. Maladies neurodégénératives et CMA

Les neurones sont des cellules post-mitotiques et nécessitent un mécanisme efficace de dégradation des protéines pour maintenir l'homéostasie cellulaire dans des conditions de stress [58,59]. L'altération du processus de dégradation des protéines dans le SNC provoque l'agrégation de protéines aberrantes ou endommagées, ce qui constitue une caractéristique distincte de nombreuses maladies neurodégénératives.

Des preuves substantielles ont été recueillies selon lesquelles le dysfonctionnement du CMA est associé à différentes pathologies dans diverses maladies neurodégénératives affectant le SNC [1,14].

Dans ces maladies, diverses protéines pathogènes ont été identifiées comme substrats de la CMA, telles que la -synucléine dans la MP [60], la Tauprotéine dans la MA [61], la huntingtine (Htt) dans la HD [62,63] et le TDP{{5} } dans la SLA et le FTLD [64,65].

5.1. Maladie de Parkinson

La MP est l’un des troubles neurodégénératifs les plus courants. Les principales caractéristiques pathologiques de la MP sont la perte progressive des neurones dopaminergiques au sein de la substance noire et l'agrégation de la protéine synucléine dans les corps de Lewy.

De nombreuses études ont montré que la déficience de la CMA est liée à la pathogénie principale de la MP [4,66]. Chez les patients atteints de MP, le niveau de protéine LAMP2A est diminué dans le cerveau, indiquant que l'activité CMA est atténuée [67,68].

De nombreuses études antérieures ont suggéré que l'inhibition de la voie de dégradation du CMA provoque l'accumulation de -synucléine, associée à la perte progressive des neurones dopaminergiques [8].

Il est important de noter que les formes mutantes A53T et A30P de la -synucléine identifiées dans la MP familiale ne peuvent pas être dégradées par la CMA. De plus, ces formes mutantes se lient étroitement à LAMP2A au niveau de la membrane lysosomale et inhibent par conséquent la dégradation normale d'autres substrats du CMA in vitro [60, 69]. La mutation G2019S dans la protéine kinase 2 répétée riche en leucine (LRRK2) peut être une cause pathologique de la MP familiale. [70].

Le mutant G2019S inhibe l'assemblage dynamique du complexe de translocation CMA au niveau de la membrane lysosomale, provoquant le dysfonctionnement du CMA dans un modèle murin de MP et dans le cerveau de patients PD mutants LRRK2 [25]. De plus, les formes mutantes pathogènes de LRRK2 se lient à Hsc70 cytosolique et interagissent anormalement avec les composants du CMA, bloquant la dégradation d'autres substrats du CMA et l'homéostasie des protéines neuronales in vitro (25, 71).

L'hydrolase L1 C-terminale de l'ubiquitine (UCH-L1) interagit physiquement avec LAMP-2A, Hsc70 et Hsp90 et est impliquée dans le mécanisme de régulation de la voie CMA (72). Dans une étude précédente, la forme mutante I93M de l'UCH-L1 a été identifié dans une seule famille PD (73).

Il a également été rapporté que la mutation I93M dans UCH-L1 augmentait anormalement l'interaction avec la région cytosolique de LAMP2A, inhibant la voie CMA in vitro (74). De plus, l'expression de la forme mutante I93M des cellules de mammifères UCH-L1 a induit l'augmentation de la quantité de synucléine associée à l'inhibition du CMA (74).

Ces résultats suggèrent qu'une interaction aberrante de la forme mutante I93M d'UCH-L1 avec la machinerie CMA pourrait être à l'origine de la pathogenèse de la maladie de Parkinson associée à l'agrégation de la -synucléine. La protéine 7 de la maladie de Parkinson (PARK7), également connue sous le nom de DJ-1, est un protéine multifonctionnelle impliquée dans diverses activités cellulaires, y compris la résistance à l'oxydation (75).

PARK7/DJ-1joue un rôle important dans le maintien de l'homéostasie mitochondriale [75]. Il a été rapporté qu'une mutation du gène DJ-1 est médiatrice des formes autosomiques récessives et précoces de MP [76]. Le déficit en DJ-1 a accéléré la dégradation de LAMP2A dans les lysosomes, conduisant à l'agrégation de -synucléine [77 ].

En revanche, DJ-1 était capable d'inhiber l'accumulation de -synucléine en régulant le CMA (78). Dans l'ensemble, divers mécanismes moléculaires provoquant un dysfonctionnement du CMA sont considérés comme étant à la base de la pathogenèse de la MP.

Cependant, les mécanismes pathologiques associés à la CMA restent largement flous. Des recherches supplémentaires seront nécessaires pour clarifier la relation entre le processus CMA et les pathologies réelles de la MP.

5.2. La maladie d'Alzheimer

La MA est la maladie neurodégénérative la plus courante chez les personnes âgées. La principale pathogenèse de la MA est la formation de plaques amyloïdes et l'agrégation de Tau causées par une altération de l'homéostasie des protéines. Plusieurs protéines liées à la MA ont été identifiées comme substrats du CMA. Il a été démontré que la dégradation du CMA de ces substrats protéiques est altérée chez les patients atteints de MA [45,61,79].

L’accumulation progressive d’oligomères amyloïdes est un événement toxique central dans la MA [80,81]. Une étude récente a montré que le marquage des oligomères amyloïdes avec plusieurs motifs KFERQ favorisait leur entrée dans les endosomes et les lysosomes, protégeant ainsi les neurones corticaux primaires cultivés humains de la neurotoxicité (82). La protéine précurseur amyloïde (APP) est une molécule pathogène importante dans la MA car elle peut être traitée pour produire amyloïde- [83].

APP contient un motif de type KFERQ à son extrémité Cterminus. Ce motif est important pour le traitement normal et la dégradation de l'APP afin d'empêcher l'accumulation de fragments APP-C-terminaux (84). Une étude récente a révélé que l'APP est un substrat CMA qui se lie à Hsc70 (85).

L'inhibition de la dégradation de l'APP par le CMA améliore sa cytotoxicité. De plus, l'activation du CMA par la surexpression de Hsc70 ou la metformine a réduit les niveaux accumulés de plaque amyloïde dans le cerveau et inversé les phénotypes moléculaires et comportementaux de la MA dans un modèle murin de MA (85). Tau est une protéine cytosolique qui stabilise normalement les microtubules dans les cellules neuronales.

La tauproteine ​​possède des motifs ciblant le CMA et peut être dégradée par la voie CMA (79). L'agrégation de protéines Tau mutantes entraînant une hyperphosphorylation de Tau et la formation d'enchevêtrements neurofibrillaires est une caractéristique de la MA et des tauopathies associées [86, 87].

De plus, les protéines Tau mutantes peuvent interagir anormalement avec LAMP2A et inhiber la translocation dans la lumière du lysosome, altérant ainsi l'activité du CMA (79). Le régulateur de la calcineurine 1 (RCAN1) est un substrat du CMA [45] et est élevé chez les patients atteints de MA [88].

RCAN1 est un inhibiteur de la déphosphorylation des protéines Tau dépendante de la calcineurine. Il est important de noter que l'activité du CMA peut être inhibée en augmentant le niveau de RCAN1, altérant ainsi la dégradation des autres substrats du CMA (45).

5.3. La maladie de Huntington

La MH est une maladie neurodégénérative d’apparition tardive caractérisée par des mouvements incontrôlés, une démence et des troubles émotionnels. La MH est une maladie héréditaire dominante causée par l’accumulation et l’agrégation de la protéine Htt mutante dans les neurones striataux et corticaux.

Htt contient un tractus polyglutamine (polyQ) N-terminal anormalement élargi [62, 63, 89]. Un dysfonctionnement de la dégradation de Htt est suggéré comme la principale pathogenèse de la MH.

Des études antérieures ont montré que le CMA est impliqué dans la dégradation du mutant Htt dans des modèles cellulaires et murins de MH [62]. Htt héberge un motif KFERQ putatif et interagit avec les composants clés de CMA, Hsc70 et LAMP2A. De plus, le mutant Htt présentant une expansion du tractus polyQ présente une absorption altérée par le CMA in vitro (89).

Non seulement la CMA mais la macroautophagie sont impliquées dans la dégradation de Htt (90). Htt peut se lier à la fois à LAMP2A et à la protéine Atg7 liée à la macroautophagie dans le processus de dégradation (89, 91, 92).

L'activité de la CMA serait régulée positivement dans les modèles cellulaires et animaux de la MH au stade initial de la maladie. Cependant, l'activité du CMA diminue au stade avancé de la maladie [91]. Ces résultats suggèrent que l'augmentation précoce de l'activité de la CMA pourrait constituer une régulation compensatoire en réponse à l'inefficacité de la macroautophagie. La diminution du taux de LAMP2A lysosomale indique qu'il existe une perte de la fonction CMA dans la phase tardive de la MH [91].

5.4. Sclérose latérale amyotrophique et dégénérescence lobaire frontotemporale

La SLA et la FTLD sont des maladies neurodégénératives présentant de nombreuses caractéristiques cliniques et pathologiques similaires (93). Réponse à la transactivation La protéine de liaison à l'ADN 43 kDa (TDP-43) est une protéine ribonucléaire régulant de nombreux aspects du métabolisme de l'ARN.

L'accumulation de fragments C-terminaux de TDP-43 dans les cellules neuronales est fréquemment détectée chez les patients atteints de SLA et de FTLD [65]. Ainsi, l’accumulation de TDP-43 est largement considérée comme une caractéristique de ces maladies.

La protéine TDP-43 contient un motif de type KFERQ se liant à Hsc70 et peut être dégradée par le processus CMA (94,95). L'expression de Hsc70 aurait été réduite dans les lymphomonocytes de patients SLA sporadiques et aurait contribué à l'accumulation de TDP -43 (64).

Une mutation du motif de type KFERQ dans TDP-43 peut perturber sa dégradation via le CMA, induisant l'accumulation de TDP-43 et l'inhibition du CMA dans les cellules en culture (94). La CMA peut aider à contrôler le renouvellement des formes physiologiques et pathologiques du TDP-43 [94].

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