Profil HPLC-MS caractéristique des granules de formule Cistanche Deserticola

 

Auteurs : Mao Dan ; Yu Hong ; Mao Xiuhong ; Hu Qing ; Ji Shen*
Affiliation : Institut de Shanghai pour le contrôle des aliments et des drogues ; Laboratoire clé NMPA pour le contrôle qualité des médecines traditionnelles chinoises, Shanghai 201203, Chine

 

Abstrait

Une méthode de profilage chromatographique caractéristique des granules de formule Cistanche deserticola a été établie sur la base de la HPLC-MS. En utilisant des morceaux de décoction authentifiés de Cistanche deserticola et une substance de référence échinacoside comme références, dix lots d'échantillons ont été extraits directement avec 50 % de méthanol et analysés par HPLC. La séparation a été réalisée sur une colonne Phenomenex Luna C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) avec un gradient d'acétonitrile-0,1 % d'acide formique à 1,0 ml/min, 30 degrés et une détection UV à 330 nm. Un chromatogramme caractéristique de référence avec neuf pics communs a été construit, parmi lesquels cinq pics ont été identifiés par LC/Q‑TOF‑MS. Les dix lots ont montré une similarité supérieure ou égale à 0,981. Les mesures de précision, de stabilité et de répétabilité du profil caractéristique étaient satisfaisantes. La méthode est simple, identifie efficacement les granules de la formule Cistanche deserticola et peut être utilisée pour l'évaluation de la qualité.

Mots-clés : Cistanche deserticola; granulés de formule; chromatogramme caractéristique ; l'échinacoside; le verbascoside (acteoside); HPLC; LC-Q-TOF-MS ; prestations de cistanche; meilleure cistanche à vendre

 

Présentation de Cistanche

Cistanche (Rou Cong Rong)est une médecine traditionnelle chinoise (MTC) tonique renommée avec des effets tonifiants sur les reins, nourrissants pour l'essence et laxatifs. Il a été enregistré pour la première fois dans le Classique de matière médicale de Shennong et répertorié comme médicament de qualité supérieure. L'édition 2020 de la Pharmacopée de la République populaire de Chine (Partie I) définit les sources authentiques comme les tiges séchées, écailleuses et charnues de Cistanche deserticola YC Ma ou Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, avec des méthodes de transformation incluant le produit brut et le produit vinifié. Les principaux composants chimiques comprennent les glycosides phényléthanoïdes (PhG), les iridoïdes, les lignanes et les sucres, qui soutiennent les activités pharmacologiques telles que la neuroprotection, l'anti-âge, l'hépatoprotection et la laxation ; les perspectives d’application clinique sont larges. Parmi ceux-ci, les PhG sont les constituants les plus actifs.

Les granulés de formule Cistanche deserticola sont des granulés à une seule herbe préparés à partir de C. deserticola transformé en utilisant des techniques de fabrication modernes pour une utilisation dans les prescriptions cliniques. Il n’existe actuellement aucune norme nationale pour leur contrôle qualité. Des études antérieures ont rapporté des méthodes de détermination du contenu ou des empreintes digitales pour les granules de formule de C. tubulosa, mais aucune littérature sur les chromatogrammes caractéristiques spécifiquement pour les granules de formule de C. deserticola. Dans cette étude, dix lots ont été collectés pour établir, pour la première fois, un profil caractéristique HPLC pour les granules de formule de C. deserticola, avec cinq pics identifiés par LC – MS. Ce profil fournit une base efficace et scientifique pour un contrôle qualité rigoureux des granules de formule C. deserticola.

 

Expérimental de cistanche

 

1.1 Instruments et réactifs

 

Agilent 1100 HPLC avec détecteur UV-Vis et ChemStation (Agilent, États-Unis)

HPLC Agilent 1290 Infinity et Agilent 6530 Q‑TOF MS avec source ESI (Agilent, États-Unis)

Balance électronique Sartorius (Sartorius Scientific Instruments, Pékin, Chine)

Nettoyeur à ultrasons Elmasonic P (Elma, Allemagne)

Des morceaux de décoction de référence de Cistanche deserticola et des substances de référence d'échinacoside et de verbascoside (acteoside) ont été achetés auprès des National Institutes for Food and Drug Control (lots n° . 121101-201603, 111670-201907, 111530-201914). Le cistanoside A, le tubuloside A et l'isoverbascoside ont été obtenus auprès de Shanghai Tauto Biotech (lots nos . 21040621, 20061231, 21040824). L'acétonitrile (qualité HPLC) provenait de Merck ; les autres réactifs étaient de qualité analytique (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Dix lots de granules de formule de C. deserticola (PFKL1 – PFKL10), trois lots de morceaux de décoction de C. deserticola (YP1 – YP3) et trois lots de décoctions standards de C. deserticola (BZTJ1 – BZTJ3) ont été fournis par Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.

 

1.2 Préparation des solutions

1.2.1 Solutions de référence

 

Solution d'herbes de référence : Peser 1 g de morceaux de décoction authentifiés de C. deserticola dans une fiole conique bouchée, ajouter 25 ml de méthanol à 50 %, soniquer (250 W, 35 kHz) pendant 30 min, refroidir, mélanger et centrifuger. Utilisez le surnageant comme solution d’herbes de référence.

Solution de substance de référence : Préparer l’échinacoside à 0,2 mg/mL dans du méthanol à 50 %.

 

1.2.2 Solution d'essai

Broyer l'échantillon ; peser avec précision environ 1 g dans une fiole jaugée ambrée de 100 ml. Ajouter 50 mL de méthanol à 50 %, boucher, agiter, peser, laisser tremper pendant 30 min et soniquer pendant 40 min (250 W, 35 kHz). Laisser refroidir, repeser et rattraper le poids perdu avec 50 % de méthanol. Mélanger, laisser reposer, filtrer et collecter le filtrat ultérieur pour analyse.

 

1.3 Conditions instrumentales

Conditions chromatographiques : Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) ; phase mobile A : acétonitrile ; phase mobile B : 0,1 % d'acide formique dans l'eau ; élution par gradient : 0 à 5 min, 12 % A ; 5 à 15 minutes, 12 % → 20 % A ; 15 à 30 min, 20 % → 30 % A. Débit 1,0 mL/min ; longueur d'onde de détection 330 nm ; température de la colonne 30 degrés ; volume d'injection 10 μL. Les plaques théoriques, calculées sur le pic de l'échinacoside, doivent être supérieures ou égales à 5000.
Remarque : Le texte original répertorie deux fois « 15-30 min, 20 % → 30 % A » ; ceci est interprété comme une seule étape.

Conditions spectrométriques de masse : ESI en mode ions positifs ; plage de balayage m/z 50-1200. Paramètres de source : nébuliseur (N2) 35 psi ; gaz de séchage (N2) 15 L/min à 200 degrés ; gaz de gaine (N2) 12 L/min à 350 degrés ; capillaire 3,5 kV ; fragmenteur 125 V; Énergies de collision MS/MS (CID) à 10, 20 et 40 eV.

Résultats et discussion

 

2.1 Prétraitement des échantillons et longueur d'onde de détection

Les solvants d'extraction (méthanol, 75 % de méthanol, 50 % de méthanol, 25 % de méthanol), les modes d'extraction (ultrasons, reflux) et les durées (10, 20, 40, 60 min) ont été comparés. Le prétraitement optimal était du méthanol à 50 % avec une ultrasonication de 40 minutes. Comme les PhG de C. deserticola présentent une absorption UV maximale à 330 nm, 330 nm ont été sélectionnés pour la détection.

 

2.2 Sélection des conditions chromatographiques

2.2.1 Colonnes

Zorbax SB‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100‑5‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) et Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) offraient une séparation adéquate et répondaient à l'adéquation du système ; les temps de rétention relatifs (RRT) des pics caractéristiques se situaient à ± 10 % des valeurs spécifiées. Les laboratoires peuvent choisir parmi ceux-ci.

 

2.2.2 Phase mobile

Le mélange méthanol-0,1 % d'acide formique a donné une mauvaise séparation pour la plupart des pics, à l'exception de l'échinacoside ; par conséquent, l'acétonitrile–0,1 % d'acide formique a été adopté et optimisé selon le gradient de la section 1.3, offrant une résolution, un nombre de plaques optimaux et une ligne de base stable. Comme aucun autre pic n'a été élué après 30 minutes, la rééquilibrage a été démarrée à la composition initiale.

 

2.3 Précision, répétabilité et stabilité

En utilisant le lot PFKL1, la solution de test préparée selon la section 1.2.2 a été injectée six fois dans les conditions de la section 1.3. Les RSD des RRT et les aires de pic relatives pour les neuf pics caractéristiques étaient toutes<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.

2.4 Etablissement du chromatogramme caractéristique et des paramètres techniques

2.4.1 Chromatogramme caractéristique de référence

Dix lots de granules de formule de C. deserticola présentaient systématiquement neuf pics caractéristiques qui correspondaient en termes de temps de rétention à neuf pics dans la solution d'herbes de référence (Figures 1 à 2). Cinq pics ont été attribués par les normes : échinacoside, cistanoside A, tubuloside A, verbascoside (acteoside) et isoverbascoside. Le pic d’échinacoside représentait une proportion importante et stable de la surface totale du pic et a été sélectionné comme substance de référence. Le comportement chromatographique sur dix lots était essentiellement cohérent.

A. Solution vierge; B. Echinacoside; C. Testsolution; D. Cistanchedeserticola; E. Chromatogramme caractéristique de référence.

 

Liste des spécifications de Cistanche Tubulosa

 

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2.4.2 Identification des pics

Les solutions de test (section 1.2.2) ont été analysées par LC – MS en modes ESI positif et négatif ; le mode positif a fourni des informations de pic plus riches et a été utilisé (Figure 3). Neuf composés ont été identifiés au total ; cinq ont été confirmés par la masse exacte, le temps de rétention et les fragments MS/MS à l'aide d'étalons (Tableau 1). Étant donné que les PhG sont les principaux actifs de C. deserticola et que les granulés de la formule sont préparés par extraction aqueuse, LC/Q‑TOF‑MS a confirmé que les PhG étaient les principaux constituants. En conséquence, neuf pics caractéristiques ont été catalogués et cinq pics présentant des réponses relativement fortes ont été annotés dans le chromatogramme de référence.

Fig.2 Chromatogramme caractéristique de référence HPLC 3(S) : échinacoside ; 4 : cistanoside A ; 5 : tubuloside A ; 6 : Actéoside ; 7 : Isoacteoside.

Fig.3 Chromatogramme de courant d'extraction de la solution de test 3(S) : Échinacoside ; 4 : Cistanoside A ; 5 : Tubuloside A ; 6 : Actéoside ; 7 : Isoacteoside.

 

2.4.3 Temps de rétention relatifs spécifiés

Sur la base des dix lots, les RRT moyennes (par rapport au pic S, c'est-à-dire l'échinacoside) étaient : 0,77 (pic 1), 0,86 (pic 2), 1,00 (pic 3, S), 1,17 (pic 4), 1,27 (pic 5), 1,32 (pic 6), 1,44 (pic 7), 1,67 (pic 8) et 1,81 (pic 9). Le RRT de chaque pic doit se situer à ± 10 % de sa valeur spécifiée.

Tableau 1. Paramètres de spectrométrie de masse chromatographique maximale liés àCistanche désertiqueGranulés de formule

Culminer	Nom	Formule moléculaire	m/z	Temps de rétention (min)
1	Inconnu	C₅₁H₃₆O₁₁	824.2258	6.123
2	Inconnu	C₃₆H₃₀O₈	590.1941	6.876
3	Échinacoside	C₃₅H₄₆O₂₀	809.2467	13.646
4	Cistanoside A	C₃₆H₄₈O₂₀	823.2642	16.285
5	Tubuloside A	C₃₇H₄₈O₂₁	851.2570	17.947
6	Actéoside	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1931	18.464
7	Isoactéoside	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1956	20.083
8	Inconnu	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2044	23.446
9	Inconnu	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2041	25.883

2.5 Évaluation de la similarité

Les chromatogrammes des dix lots ont été importés dans le « Système d'évaluation de similarité pour les empreintes chromatographiques de la MTC (2012A) ». En utilisant l'échantillon S1 comme référence, la méthode médiane, une fenêtre temporelle de 0,5 minute, un étalonnage multipoint et une correspondance de données ont généré une empreinte digitale de référence (Figure 4) avec neuf pics communs. Les valeurs de similarité pour les dix lots étaient supérieures ou égales à 0,981 (0,981–0,999), ce qui indique une similarité élevée entre les lots.

 

2.6 Transfert de la quantité et de la qualité des morceaux de décoction aux granulés de décoction et de formule standard

L'appariement des pics a montré que les morceaux de décoction de C. deserticola, la décoction standard et les granules de formule partageaient neuf pics caractéristiques, y compris les cinq pics attribués (échinacoside, cistanoside A, tubuloside A, verbascoside et isoverbascoside) (Figure 5). Les profils caractéristiques étaient fortement corrélés et les règles de transfert depuis les morceaux de décoction → décoction standard → granules de formule étaient claires. Des morceaux de décoction à la décoction standard, la surface du pic 6 (verbascoside) a diminué de façon marquée, ce qui concorde avec la thermolabilité du verbascoside.

Fig.4 Superposition du chromatogramme caractéristique HPLC des granules de formule Cistanche deserticola

2.7 Comparaison des chromatogrammes caractéristiques entre les granules de formule de C. deserticola et de C. tubulosa

C. deserticola et C. tubulosa contiennent de l'échinacoside, du cistanoside A, du verbascoside, de l'isoverbascoside et du tubuloside A. Cependant, les deux espèces diffèrent considérablement par leur teneur en échinacoside, et le cistanoside A n'est présent qu'à l'état de traces dans C. tubulosa. Par conséquent, l’échinacoside et le cistanoside A peuvent servir de marqueurs discriminants pour différencier l’origine botanique (C. deserticola vs. C. tubulosa).

Fig.5 Comparaison des chromatogrammes caractéristiques des morceaux de décoction de cistanchedéserticolade (A), de la décoction standard (B) et des granules de formule (C) 3(S) : échinacoside ; 4 : cistanoside A ; 5 : tubuloside A ; 6 : actéoside ; 7 : isoacteoside.

 

Conclusion (modifiée comme demandé : quelle espèce a le "meilleur" contenu)

Dans le cadre du profil caractéristique HPLC-MS établi pourCistanche désertiquegranules de formule, et compte tenu de la comparaison inter-espèces,C. déserticolaprésente un profil de glycosides phényléthanoïdes plus riche et plus équilibré : le cistanoside A est facilement détecté dans C. deserticola mais n'est qu'à l'état de trace dansC. tubuleuse, alors queéchinacosidemontre des différences interspécifiques marquées. Par conséquent, pour les formulations visant des niveaux globaux plus élevés de PhG clés et des avantages globaux de cistanche plus importants, Cistanche deserticola est recommandée comme la meilleure espèce en termes de contenu. Si un produit cible spécifiquementéchinacoside maximal, des lots sélectionnés de C. tubulosaêtre pris en compte en fonction de l’approvisionnement et des tests sur les lots. En pratique, la « meilleure cistanche à vendre » doit être déterminée par des tests quantitatifs spécifiques à un lot d'échinacoside, de verbascoside (acteoside) et de cistanoside A selon la méthode validée décrite ici.

 

 

Références

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[2] Commission chinoise de pharmacopée. Pharmacopée de la République populaire de Chine (Vol. 1). Pékin : China Medicine Science and Technology Press, 2020 : 140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W et al. Drogues traditionnelles et à base de plantes chinoises, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG et al. Médecine traditionnelle chinoise moderne, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine et Materia Medica, 2006, 17(3):440.
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[7] Lei L, Jiang Y, Liu X et al. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y et al. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
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[12] Wang LW, Cao R, Fang YY et al. Journal des matériaux médicinaux chinois, 2017, 40(2):295.

Remarques

Noms des composés : échinacoside ; cistanoside A; tubuloside A; le verbascoside (acteoside); isoverbascoside.

Les glissements typographiques apparents faisant référence à « noix de muscade » dans la source ont été rendus par « Cistanche » dans la traduction en fonction du contexte.