Caractérisation des proanthocyanidines naturelles et alcalines oxydées dans les extraits de plantes par UHPLC-MS/MS à ultra-haute résolution

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Résumé: Dans cette étude, nous avons analysé la composition en proanthocyanidines (PA) de 55 extraits végétaux avant et aprèsoxydationpar UHPLC-MS/MS ultra haute résolution. Nous avons caractérisé en détail les structures de PA naturelles et étudié les changements sophistiqués dans les structures de PA modifiées et les schémas et modèles typiques de réactions au sein de différentes classes de PA dues à l'oxydation. Les AP naturels étaient des PC de type A et B, des PD et des mélanges PC/PD. De plus, nous avons détecté des PA galloylés. Les PC de type B dans différents extraits de plantes étaient plutôt stables et n'ont montré aucune modification ou une modification mineure en raison de laoxydation alcaline. Pour certains échantillons, nous avons détecté les réactions intramoléculaires des PC produisant des liaisons éther de type A. Les PC de type A étaient également plutôt stables sans modification ou avec des modifications mineures, mais dans certaines plantes, la formation d'éther supplémentaireliensa été détecté. Les AP contenant des unités PD étaient plus réactifs. Après oxydation alcaline, ces PA ou leurs produits d'oxydation n'étaient plus détectés par MS alors qu'un bossage de PA de type différent et/ou retardé était toujours détecté par UV à 280 nm. Les PA galloylés étaient plutôt stables sous oxydation alcaline s'ils étaient à base de PC, mais nous avons détecté la conversion intramoléculaire du type B au type A. Les PD galloylés étaient plus réactifs et réagissaient de la même manière que les PD non galloylés.

Mots clés: spectrométrie de masse haute résolution ; orbitrap;oxydation; tanins; UHPLC-DAD-MS/MS

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1. Introduction

Proanthocyanidines(AP, syn. tanins condensés) sont des oligomères et des polymères constitués d'unités monomères flavan-3-ol (Figure 1). La diversité des structures PA découle principalement de leurs schémas d'hydroxylation, de l'ordre séquentiel des unités flavan-3-ol et du degré de polymérisation (DP), en plus des différences de stéréochimie en C2 et C3 et de la variation de l'emplacement et la stéréochimie des interflavonoïdeobligations [1]. Les AP les plus courants sont les procyanidines (PC) constituées d'unités (épi)catéchine et les prodelphinidines (PD) constituées d'unités (épi)gallocatéchine (Figure 1). Les structures PA présentées dans la figure ont les liaisons C4 → C8. Cependant, les PA peuvent également être liés par des liaisons C4 → C6, et nous ne pouvons pas séparer ces deux liaisons l'une de l'autre par spectrométrie de masse.

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>plusieurs 100-kilo tonnes par an), et sont chimiquement et économiquement plus attrayants en tant que biopolymère [2-5]. Actuellement, seules quelques ressources, telles que les écorces ou les bois d'acacia, de mimosa, de quebracho, de chêne, de châtaignier, de palétuvier, de sumac, de myrobalans et de tara, sont utilisées pour leur production et principalement pour les exigences du tannage du cuir, du vin, des minéraux industries de flottation et de forage pétrolier, pour la préparation d'adhésifs, en plus de la nutrition animale [4,6,7]. Cependant, même les déchets ou les sous-produits de la manipulation et de la transformation des fruits, des légumes et des ressources forestières des applications industrielles énumérées ci-dessus pourraient être une source potentielle d'AP naturels [8-11]. Les AP pourraient également être modifiés davantage afin d'améliorer leur utilisabilité et leurs bioactivités [12,13].

Les propriétés chimiques des PA peuvent être modifiées par des réactions de dérivatisation [12]. Ces réactions comprennent, par exemple, la O-acylation par une réaction avec des chlorures ou des anhydrides d'acide ou une alkylation avec des halogénures d'alkyle. La dérivatisation modifie les propriétés physicochimiques des AP pour leurs applications commerciales et leurs technologies de purification. Cependant, pour vraiment comprendre les réactions réelles qui se produisent, plusieurs paramètres, tels que les réactifs et les solvants utilisés, la température, le pH et le temps de réaction doivent être régulés [12]. Un moyen simple et rapide d'améliorer l'utilisabilité des AP végétaux est de les oxyder pour créer de nouveaux AP aux structures moléculaires altérées. Même si les conditions de réaction de l'oxydation sont bien connues et que différents mécanismes de réaction ont été suggérés, les changements structurels correspondants sont principalement connus pour les petits AP individuels [14-18]. Par exemple, les réactions d'oxydation et de réarrangement de différents flavan-3-ols monomères et dimères ont été élégamment discutées il y a déjà 30 ans, montrant que la chimie de ces PA à pH alcalin est régulée par la formation de A-et/ou Les quinone-méthides à cycle B en tant qu'intermédiaires hautement réactifs provoquant les réactions de réarrangement et la conversion oxydative des AP de type B en A [15]. Au lieu de cela, le comportement des mélanges de PA dans les extraits de plantes n'est pas connu, et cela est très probablement dû à des difficultés à analyser des PA initiaux structurellement différents, qui sont encore plus contestés après l'oxydation. Dans notre étude précédente, nous avons testé si différents types d'AP naturels pouvaient être modifiés chimiquement pour produire de nouveaux types d'AP et étudié les effets de l'oxydation alcaline non spécifique imitant le processus d'extraction alcaline souvent utilisé pour les déchets d'écorce [19-23] sur 102 extraits de plantes contenant des AP [13]. Les résultats ont indiqué des réactivités différentes pour les PC et les PD. Le résultat a suggéré que les AP végétaux pouvaient être modifiés à pH élevé et que la présence de groupes PD augmentait considérablement la probabilité de réactions de modification. La principale voie de réaction a été conclue comme étant intramoléculaire, mais pour les PA riches en PD et gallovlés, des réactions intra- et intermoléculaires ont été indiquées [13]. De plus, d'autres études ont montré que l'oxydation des AP comprend à la fois des réactions intramoléculaires et intermoléculaires [14,15,24,25].

La caractérisation et la compréhension détaillées des AP naturels et oxydés sont difficiles, mais les progrès récents de l'instrumentation de spectrométrie de masse en tandem chromatographique liquide ultra-haute performance (UHPLC-MS/MS) avec des analyseurs de masse à haute résolution ont permis la caractérisation de nombreux AP végétaux différents. [18,26-28]. Les analyseurs de masse populaires pour la caractérisation des AP ont été orbitrap [27,28] et quadripôle

temps de vol (OTOF)[29,30] en raison de leurs propriétés de haute résolution, qui permettent la détermination des masses exactes et des formules moléculaires correspondantes des AP étudiés dans les extraits végétaux. Les PA trouvés dans la nature contiennent généralement un mélange de différentes structures oligo et polymères, ce qui produit des ions à charges multiples dans l'ionisation par électrospray, élargissant la plage de masse utilisée [30-32]. De plus, les PA ont des schémas de fragmentation caractéristiques bien connus, qui peuvent être utilisés pour leur identification : ceux-ci incluent le clivage quinone-méthide (QM), la fission du cycle hétérocyclique (HRF) et la fragmentation rétro-Diels-Alder (RDA) [27, 31-33]. Les mêmes schémas de fragmentation sont généralement présents pour les AP de type A et de type B, et les valeurs m/z observées pour les AP de type A avec une liaison éther diffèrent de 2 Da des AP de type B correspondants [26,{{ 19}}].

Dans cette étude, nous avons utilisé l'UHPLC combinée à la spectrométrie de masse en tandem à ultra-haute résolution afin (a) d'étudier en détail les structures PA naturelles dans 55 échantillons de plantes riches en PA, (b) de voir les changements sophistiqués dans les structures PA modifiées après l'oxydation aérienne dans des conditions alcalines et (c) reconnaître les schémas et modèles typiques de réactions au sein des différentes classes d'AP dues à l'oxydation.

2. Résultats et discussion

Nous avons sélectionné 55 échantillons de plantes riches en AP contenant des mélanges intéressants mais complexes d'AP naturels sur la base de notre étude précédente [13]. Ces échantillons de plantes ont été oxydés de la même manière par oxydation aérienne dans des conditions alcalines comme dans [13] et après l'oxydation, les AP étaient encore plus complexes. Ces AP naturels et modifiés ont été étudiés ici par UHPLC-DAD connecté à un Q-orbitrap MS/MS à ultra haute résolution afin de détecter les changements sophistiqués dans les structures des AP. Les AP ont été identifiés sur la base de leurs ions à charge unique et/ou multiple avec leurs masses exactes et leur formule moléculaire correspondantes. Les analyses ont été effectuées par LC en phase inversée et, par conséquent, les PA oligomères et polymères étaient principalement présents sous forme de bosses non résolues dans les chromatogrammes UV à 280 nm, voir l'extrait de feuille de Ruprechtia salicifolia sur la figure 2A pour un exemple. Dans le chromatogramme d'ions totaux, l'ionisation d'autres composés phénoliques était plus intensive que celle des PA, et par conséquent, la bosse de PA n'était pas si apparente (figure 2B). Cependant, la précision d'orbitrap facilite l'interprétation des résultats MS car les schémas isotopiques des ions à charges multiples sont clairement définis et le chevauchement possible des pics peut être détecté, permettant ainsi la détermination des masses exactes et des formules moléculaires de différents oligo- et les PA polymères. Par exemple, la catéchine galloylée (épi) à m/z 441, la PCat dimère galloylée m/z729 et la PC trimère galloylée à m/z 1017 présentent des pics bien séparés dans les chromatogrammes ioniques extraits (EIC) dans la figure 2C-E, et ils peuvent être facilement détectés sur la base de leurs spectres UV et de masse, y compris les masses exactes et la formule moléculaire correspondante. Les résultats obtenus ici étaient cohérents avec les résultats précédents obtenus par MS / MS, montrant que les feuilles de Ruprechtia salicifolia contenaient 24 mg / g d'AP, dont seulement 3% étaient des AP contenant du PD, certains d'entre eux étaient galloylés et le mDP a été trouvé avoir 7 ans [13].

2.1.PC de type B dans les extraits végétaux non oxydés initiaux

Les PC de type B dans les extraits de plantes ont été détectés sur la base de leurs ions moléculaires à charge unique et multiple en plus des schémas de fragmentation caractéristiques. Par exemple, les PC de Begonia bower sont des extraits "Nigra" présentant une série distincte d'ions [MH] séparés par 288 Da de m/z289 à m/z 1729 correspondant aux PC de type B du monomère à l'hexamère et de [M{{ 6}}H]' ions séparés par 144 Da de m/z 1008 à m/z 1296 correspondant aux PC de type B des heptamères aux nonamères (tableau S1). Les spectres de masse des PC monomères, c'est-à-dire la catéchine et l'épicatéchine flavan-3-ols, présentaient un ion fragment caractéristique à m/z 245, comme indiqué précédemment [3132,36].

En général, la MS/MS des dimères PC de type B a montré les schémas de fragmentation caractéristiques produisant des ions à m/z 287 et 289 (clivage QM), m/z 425 et 407 (fragmentation RDA et élimination séquentielle de l'eau) et m /z 451(HRF; Figure 3). La fragmentation RDA est considérée comme le modèle de fragmentation le plus important pour la caractérisation des dimères PC de type B et la fragmentation sur l'unité d'extension a été considérée comme énergétiquement plus favorable car elle produit des ions fragments avec un système π-πhyperconjugué plus grand que le Fragmentation RDA sur le terminal [31-33].

2.2.PC de type A dans les extraits végétaux non oxydés initiaux

La présence d'AP de type A dans les extraits végétaux initiaux a été confirmée par leurs schémas de fragmentation caractéristiques similaires aux AP de type B. À titre d'exemples, les voies de fragmentation caractéristiques et les données MS/MS du dimère et du trimère PC de type A ayant une liaison de type A sont présentées et discutées en détail (figures 4 et 5). La fragmentation du dimère PC de type A a produit quatre ions fragments (Figure 4). La fragmentation RDA de l'unité terminale a produit un ion à m/z 423, ce qui confirme la présence d'une liaison de type A [26, 34, 35]. De plus, nous suggérons que la fragmentation RDA de l'unité d'extension et la perte séquentielle d'eau pourraient produire l'ion à m/z 407. L'ion à m/z 449 est la production de HRF, c'est-à-dire le résultat de la perte de l'unité phloroglucinol [26]. Les ions à m/z 285 et 289 correspondaient au clivage QM. De même, le trimère PC de type A présentait un ion moléculaire à m/z 863 et des ions fragmentaires caractéristiques en MS/MS à m/z 711,693,573,559,451,411 et 289 comme précédemment rapporté par Sui et al.(2016 )[26]. La fragmentation RDA du trimère PC de type A a produit un ion à m/z 711, ce qui confirme à nouveau la présence d'une liaison de type A selon l'étude précédente [26] et suggère que la liaison de type A pourrait être entre deux extensions unités. Nous suggérons que l'ion à m/z 693 correspond à la perte séquentielle d'eau et soutient la position de la liaison de type A, comme le montre la figure 5. De plus, nous suggérons que le RDA supplémentaire du cycle C hétérocyclique du l'unité flavan-3-ol terminale présente l'ion à m/z559. Cet ion était mineur dans nos études. Les ions à m/z573 et 289 correspondaient au clivage QM de la liaison inter flavonoïde inférieure [26]. Nous avons également détecté des ions à m/z 575 et 287. Nous proposons que les ions à m/z 451 et 411 pourraient correspondre au HRF du cycle C hétérocyclique de l'unité flavan-3-ol médiane supportant l'emplacement de Liaison de type A entre les unités d'extension selon la figure 5.

2.3.Modifications des PC de type B dans les extraits de plantes dues à l'oxydation alcaline

Après l'oxydation, les PC de type B dans différents extraits de plantes ont été modifiés différemment. Certains des échantillons n'ont montré aucune modification ou des modifications mineures; voir Figure 6A, B, par exemple, pour les oligomères PC de type B plus courts dans l'extrait de feuille de Begonia bower sont "Nigra" avant et après oxydation. Lorsque ces types d'extraits de plantes ont été oxydés, les spectres de masse totaux des extraits de plantes initiaux et oxydés étaient similaires. Cependant, de minuscules différences ont été détectées dans les données détaillées de spectrométrie de masse. Par exemple, le dimère PC à m/z 577 était accompagné de m/z575 et le trimère PC à m/z865 avec m/z 863, respectivement. Lorsque les quantités de PC étaient faibles avant l'oxydation, après l'oxydation, leurs signaux ont presque disparu des spectres de masse, laissant entendre qu'ils étaient devenus non identifiables ou dégradés en raison de l'oxydation. Ce phénomène a été observé, par exemple, pour les extraits de feuilles de Combretum Indicum et d'Euphorbia characias contenant de faibles quantités de quelques oligomères de PC courts et soutenu par les données MS/MS précédentes qui ont montré que la teneur en PA diminuait de 4 mg/mL à 1 mg /mL et 7 mg/mL à 1 mg/mL, respectivement, en raison de l'oxydation [13]. Ce phénomène pourrait être lié aux conditions expérimentales utilisées, c'est-à-dire qu'elles étaient plus sévères lorsque les teneurs initiales en AP étaient faibles. Dans certains échantillons, une partie des PC de type B a été modifiée davantage, voir Figure 6C, D, par exemple, pour des PColigomères de type B plus courts dans l'extrait de feuillet de Cyperus owoaii avant et après oxydation. Lorsque ces types d'extraits de plantes ont été oxydés, des différences visibles ont été détectées dans les spectres de masse totaux montrant la différence de masse de 2 Da par rapport aux PC initiaux (figure 6C, D, tableau S2).

Il est bien connu que l'oxydation des o-dihydroxy polyphénols, c'est-à-dire le cycle catéchol B des PC, donne généralement des o-quinones avec une différence de masse de 2 Da. En fait, nous avons remarqué que ce type d'oxydation peut également se produire dans les analyses par spectrométrie de masse. Il peut y avoir des signaux mineurs dans les spectres de masse ayant des valeurs m/z 2 Da inférieures aux valeurs m/z des PC correspondant à l'éventuelle oxydation ou formation de formes quinones des PC lors de l'ionisation (données non publiées). Il est possible qu'ici, dans l'oxydation alcaline, les polyphénols o-dihydroxylés forment les premières o-quinones. Cependant, les formes 0-quinoniques formées sont instables et réagissent très probablement rapidement. Un résultat possible pourrait être la conversion oxydative des PC de type B en PC de type A, comme précédemment rapporté dans la littérature [15]. La transformation des PC de type B en PC de type A implique l'élimination oxydative de l'ion hydrure en C2 du cycle C comme première étape : les conditions basiques dominantes induisent l'oxydation de la fonctionnalité o-dihydroxy du cycle B. à une o-quinone, qui sert ensuite deoxydantpour la conversion du dimère de procyanidine de type B en dimère de type A [15] (Figure 7). Ce mécanisme de quinone méthide a également été mis en évidence à différentes températures, pH et conditions catalytiques [37], par oxydation radicalaire à l'aide de radicaux 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle en conditions neutres [38] et par la laccase ( EC1.10.3.2) [39].

Lorsque nous avons étudié les PC modifiés avec une différence de masse de 2 Da dans les extraits oxydés et leurs productions obtenues par MS/MS, il a été conclu qu'ils étaient similaires aux PC de type A et à leurs ions fragments (comme discuté ci-dessus dans la section 2.2), montrant les schémas de fragmentation caractéristiques produisant des ions à m/z 285 et 289 (clivage QM), m/z 423 (fragmentation RDA) et m/z449 (HRF). A titre d'exemple, nous montrons la conversion des dimères PC de type B de l'extrait de feuillet de Microgramma Mauritanie en dimères PC de type A sur la figure 8. Dans lenon oxydéextrait, nous avons détecté quatre dimères PC de type B avec des valeurs m/z de 577 (Figure 8A) mais aucun dimère PC de type A avec des valeurs m/z de 575 (Figure 8B). Les minuscules pics de l'EIC à m/z575 correspondaient vraisemblablement à l'oxydation des PC de type B dans la source d'ions, car les temps de rétention sont exactement les mêmes que pour les PC de type B. Dans l'extrait oxydé, nous n'avons détecté que des traces des PC de type B initiaux à m/z 577 (Figure 8C), mais à la place, nous avons détecté des pics intensifs à des temps de rétention ultérieurs correspondant aux PC de type A à m/z 575 (Figure 8). 8D). Les minuscules pics de l'EIC à m/z577 ayant les mêmes temps de rétention correspondaient aux signaux isotopiques du m/z 575. Il faut noter que cette étude était qualitative, ce qui signifie que les abondances des ions ne peuvent pas être comparé comme tel. De plus, il faut noter que la conversion de PC de type B en PC de type A n'a pas toujours été aussi complète que dans cet exemple et que tous les PC de type B n'ont pas été convertis en PC de type A ; grossièrement estimé que les abondances des ions des oligomères PC de type A et de type B étaient égales. En revanche, dans certains échantillons, nous avons détecté plus de différences de 2 Da ; par exemple, l'heptamère PC à m/z 2017 pourrait être accompagné d'ions à m/z2015 et 2013, suggérant la formation d'une et deux liaisons de type A, respectivement.

Même si la conversion des PC de type B en PC de type A semblait être le principal mécanisme de réaction, nous ne pouvons pas totalement exclure d'autres réactions de modification. Les PA étaient présents sous forme de mélanges complexes dans les extraits non oxydés initiaux, et ces mélanges étaient encore plus complexes après l'oxydation alcaline produisant une énorme quantité de données MS. Par exemple, des études antérieures sur les réactions d'oxydation et de réarrangement des PA catalysées par des bases ont montré que les dimères de PC peuvent se transformer en différents produits d'isomérisation du cycle C, y compris les tétrahydroxypyranochromènes, également appelés phlorotannins [15]. Ces produits présenteraient des valeurs m/z très similaires à 577 mais des temps de rétention différents en LC et des schémas de fragmentation différents en MS. Sur la base des EIC à m/z 577, nous n'avons pas détecté de réarrangements de ce type dans les conditions de réaction utilisées. Les réarrangements et l'ouverture du cycle C hétérocyclique pourraient également produire d'autres produits via la régio-isomérisation, l'épimérisation ou la migration 13-aryle [15]. L'épimérisation a principalement été liée aux procédés de fabrication et, par exemple, les températures élevées liées à la torréfaction du cacao entraînent des pertes de flavan-3-ol, mais aussi l'épimérisation des flavan-3-ol monomères, dimères , et les trimères [40]. De plus, il a été rapporté que la polyphénol oxydase dans la chair des bananes provoquait l'épimérisation de la (-)-épigallocatéchine en (-)-gallocatéchine[41]. Nous avons examiné l'épimérisation possible des flavan-3-ols à l'aide d'EIC à m/z289 et, en général, nous n'avons pas détecté d'épimérisation significative causée par l'oxydation alcaline utilisée. Cependant, nous ne pouvons pas totalement exclure l'épimérisation car nous avons détecté des quantités plus élevées de (plus)-catéchine par rapport à (-)-épicatéchine dans l'extrait oxydé de fleurs de chou-fleur de Pavonia que dans l'extrait initial non oxydé (Figure S1). Il faut également noter que les extraits oxydés ont été neutralisés avant l'UHPLC-MS/MS, ce qui peut avoir provoqué des réactions redox. Dans les formes oxydées, les quinones sont des électrophiles qui peuvent réagir avec l'eau nucléophile présente, ce qui pourrait simplement entraîner la réaction de réduction produisant des PC de type B, ce qui pourrait également expliquer pourquoi certains des PC de type B ne semblaient pas affectés.

2.4.Modifications des PC de type A dans les extraits de plantes dues à l'oxydation alcaline

Les PC de type A dans différents extraits de plantes ont réagi différemment en raison de l'oxydation alcaline. Certains des échantillons n'ont montré aucune modification ou des modifications mineures. Lorsque ces types d'extraits de plantes ont été soumis à une oxydation alcaline, aucune différence significative n'a été détectée dans les spectres de masse totaux (par exemple, voir le tableau S3 pour les principaux ions observés dans l'extrait de feuille d'Aglaonema commutatum var. maculatum avant et après oxydation). Cependant, de minuscules différences ont pu être détectées dans les données détaillées de spectrométrie de masse ayant une différence de masse de 2 Da et suggérant que des liaisons éther de type A supplémentaires pourraient être formées. Ce phénomène était plus évident pour certains des échantillons avec des PC de type A ; il a été remarqué que ces PC de type A formaient des liaisons éther de type A supplémentaires en raison de l'oxydation alcaline (Figure 9). Lorsque ces types d'extraits de plantes ont été oxydés, des différences distinctes ont été détectées dans les spectres de masse totaux montrant la différence de masse de 2 Da par rapport aux PC de type A initiaux. L'ion [MH] à m/z 863 correspondait à un trimère PC ayant une liaison éther de type A et l'ion à m/z 861 pour un trimère PC ayant deux liaisons éther (Figure 9A ). De même, les PC tétramères ayant une, deux et trois liaisons éther ont été détectés par les ions [M -H] à m/z 1151, 1149 et 1147, respectivement (Figure 9B). En proportion, les PC pentamères et hexamères ayant une , deux et trois liaisons éther ont été détectées par les ions [M -H]- à m/z 1439, 1437 et 1435 et à m/z 1727,1725 et 1723, respectivement (Figure 9C, D ; cependant, le L'ion [M -2H]2-à m/z 861 d'un hexamère PC était explicitement plus abondant que l'ion [MH] à m/z 1723 et, par conséquent, montré dans le chiffre).

La formation de liaisons supplémentaires de type A a également affecté les temps de rétention de ces oligomères. Le nombre de liaisons éther supplémentaires semble augmenter dans une certaine mesure à mesure que les degrés de polymérisation des PC augmentent, ce qui est attendu car il y a plus de positions pour les liaisons supplémentaires. Cependant, il faut également remarquer qu'il peut y avoir des signaux mineurs avec la différence de masse de 2 Da correspondant à l'éventuelle oxydation ou formation de formes quinones de PC lors de l'ionisation, comme discuté ci-dessus. Ces pics sont également visibles dans les spectres de masse de la figure 9 avant les pics principaux correspondant aux PC de type A. Les abondances des ions, les formes des motifs isotopiques et les ions fragments caractéristiques obtenus par MS/MS ont confirmé l'observation de liaisons éther de type A supplémentaires. Il est également important de noter que ces réactions intramoléculaires observées ne semblaient pas affecter le degré moyen de polymérisation car les oligomères ou polymères de PA supérieurs n'étaient pas détectés dans les extraits oxydés par rapport aux extraits non oxydés. L'observation est appuyée par Mouls et Fulcrand (2012) [14].

2.5.Extraits de plantes avec des AP ayant à la fois des sous-unités PC et PD et leurs modifications dues à l'oxydation alcaline

De nombreux échantillons contenaient des AP avec à la fois des unités (épi)catéchine et (épi)gallocatéchine, c'est-à-dire que les AP étaient des mélanges PC/PD. Le sort de ces mélanges PC/PD dû à la modification par oxydation alcaline était différent de celui des PC. Les mélanges PC/PD ont été clairement détectés dans les extraits de plantes avant l'oxydation à la fois par UV et MS ; voir, par exemple, les petits oligomères de PA dans l'extrait de feuille initial de Podocarpus macrophyllus (Figure 10A et Tableau S4). Après l'oxydation, les PA modifiés étaient toujours détectés par UV à 280 nm comme un type différent et/ou une bosse retardée (Figure S2), mais ils n'étaient plus détectés par MS, voir, par exemple, les oligomères de PA manquants dans la feuille oxydée. extrait de Podocarpus microphallus (Figure 10B et Tableau S4). Nous n'avons détecté aucun autre signal pouvant correspondre aux mélanges PC/PD modifiés ni à leurs éventuels produits de dégradation. Par exemple, pour le dimère PC à m/z 577, nous avons pu détecter le dimère PC de type A correspondant à m/z 575 dans l'extrait oxydé, mais des observations distinctes similaires n'ont pas pu être faites pour les dimères ou trimères PC/PD (Figure 10B). La raison de la perte d'oligomères PC/PD détectables dans l'ESI-MS peut être, par exemple, des réactions intermoléculaires entre les AP [13-15,24,25]. Les réactions intermoléculaires sont connues pour aboutir à la formation de PA modifiés par la connexion de deux chaînes oligomériques distinctes, et typiquement, elles conduisent à une augmentation du degré moyen de polymérisation [14]. Par exemple, Vernhet et al. (2014) ont remarqué par des expériences de diffusion de rayons X aux petits angles que si les PA sont oxydés dans des solutions concentrées, les PA modifiés sont des hauts polymères à longues chaînes linéaires ou ramifiées [25]. Une oxydation supplémentaire peut également conduire à une cyclisation entre les cycles A et B de différents PA [24]. De plus, il a été noté que ces nouvelles liaisons et structures sont résistantes au clivage catalysé par un acide et, par conséquent, l'augmentation du degré moyen de polymérisation ne peut être estimée que par des méthodes non dépolymérisantes [14,24. Cependant, nos résultats ont montré que ces AP modifiés ne sont pas non plus détectés dans les conditions ESI-MS standard utilisées pour les AP (Figure 10). Dans notre étude précédente, nous avons utilisé une méthode basée sur le suivi de la réaction sélectionnée par triple quadripôle pour détecter les PA dans des échantillons non oxydés et oxydés et avons remarqué que la composition des sous-unités changeait en raison de l'oxydation alcaline, de sorte que la méthode n'était plus capable de détecter les AP modifiés [13]. Les résultats MS à haute résolution actuels confirment nos observations précédentes par triple quadripôle selon lesquelles les PA modifiés dans les extraits oxydés sont beaucoup plus complexes que les PA initiaux dans les extraits non oxydés et qu'ils ne sont pas détectés dans des conditions UPLC-MS/MS similaires. [13].

Les méthodes utilisées pour l'oxydation des PA dans la littérature sont assez différentes de notre méthode, et par conséquent, les résultats peuvent ne pas être directement comparables [14,24,25]. Dans des études antérieures, l'oxydation a été réalisée dans de l'eau acidifiée avec de l'acide trifluoroacétique à pH 3,5 afin de mimer le pH du vin, et l'oxydation proprement dite a été obtenue en agitant l'échantillon en présence d'air pendant plusieurs jours [14,24, 25]. Nous avons utilisé une oxydation alcaline par un tampon carbonate à pH 10 pendant une heure seulement.

La plupart des extraits de plantes impliquaient des AP avec des sous-unités PC et PD, et seulement dans deux échantillons, les AP pouvaient être considérés comme presque purs PD. Ces deux échantillons étaient les extraits de Callisia gentlei varelegans et Pellaea ooata. Les PD de type B ont été détectés dans la Callisia douce var. extrait d'elegans avant l'oxydation; voir, par exemple, les petits oligomères PD dans le tableau S5, mais après l'oxydation, ces PD n'ont plus été détectés par MS. Nous n'avons détecté aucun autre signal pouvant correspondre aux PD modifiés ni à leurs éventuels produits de dégradation. Cependant, certains des PA modifiés étaient toujours détectés par UV à 280 nm sous forme de bosse inférieure et retardée (Figure S3). Fait intéressant, avant l'oxydation, des PD trimériques de type A ont été détectés dans l'extrait de données de Pellaea, et après l'oxydation, ces signaux étaient toujours présents, mais leurs intensités étaient nettement inférieures.

par MS et, en outre, les valeurs m/z correspondant à la formation de liaisons de type A supplémentaires dans les trimères PD ont été détectées de la même manière que les PC de type A (tableau S6). Cela peut indiquer qu'en plus des réactions intermoléculaires observées pour les PD homo et hétérogènes de type B, les PD de type A pourraient également avoir des réactions intramoléculaires similaires qui ont été détectées pour les PC de type A.

2.6. Les AP galloulés dans les extraits végétaux et leurs modifications dues à l'oxydation alcaline

Certaines plantes contenaient des AP galloylés. La présence de PC, PD et PC/PD alloués dans les extraits de plantes a été confirmée par leurs schémas de fragmentation caractéristiques. En général, la fragmentation des PA gallovlés dans l'analyse MS s'est produite de la même manière via les mécanismes RDA, HRF et QM, comme indiqué ci-dessus [31-33]. À titre d'exemple, la voie de fragmentation caractéristique et les données MS/MS d'un dimère de PC galloylé dans l'extrait de feuille de Ruprechtia salicifolia sont présentées et discutées en détail (Figure 11). La position du groupe galloyle n'est qu'indicative, et il pourrait être attaché à n'importe quel autre groupe hydroxyle libre dans l'unité terminale. L'ion à m/z603 est la production HRF. Les ions à m/z 287 et 441 correspondaient au clivage QM. De plus, nous avons détecté le clivage du groupe galloyle résultant en l'ion correspondant au dimère PC à m/z577 et la fragmentation RDA ultérieure avec un ion à m/z425 et le clivage supplémentaire de l'eau avec un ion à m/z 407. Le HRF de m/z 577 a produit l'ion fragment à m/z 451. De plus, nous avons détecté de petits ions fragments à m/z 109, 123 et 125, correspondant aux cycles aromatiques. Les PA galloylés pourraient contenir plusieurs groupes galloyle dans leurs structures (tableau S7).

Les différents PA galloylés se sont comportés différemment lors de l'oxydation aérienne en conditions alcalines. Les PC galloylés étaient plutôt stables et réagissaient de la même manière que les PC non galloylés. Par exemple, aucun changement notable n'a été détecté pour les PC galloylés ayant un groupe galloyle dans leurs structures dans l'extrait de feuille oxydé de Nepenthes maxima (tableau S7). Cependant, il faut noter que les intensités des ions pour les PC galloylés ayant deux groupes galloyles ou plus étaient plus faibles dans l'extrait oxydé de Nepenthes maxima et, par exemple, les PC pentamères galloylés avec plusieurs groupes galloylés n'étaient plus détectables (tableau S7). Les valeurs entières m/z pour certains PC galloylés sont similaires aux valeurs m/z pour les PC/PD et, par conséquent, la MS ultra-haute résolution est requise. Par exemple, m/z 881 correspond à un PA trimère composé de deux unités PC et d'une unité PD (C4sH3 ; O19, mcalculé 882,20074) et à un dimère PC galloylé ayant deux groupes galloyle (C44H34O20, mcalculé,882,16435). Dans certains échantillons, comme dans l'extrait de feuille oxydé de Coccoloba uvifera, les PC galloylés ont été convertis en PC galloylés de type A en raison de l'oxydation, même si les PA galloylés dans l'extrait initial semblaient être similaires à ceux de Nepenthes maxima. Par exemple, le dimère PC attribué ayant un groupe galloyle et présentant un ion m/z 729 (tableau S7) était stable lors de l'oxydation alcaline dans l'extrait de feuille de Nepenthes maxima mais partiellement modifié dans l'extrait de feuille de Coccoloba ugifera présentant des ions à la fois à m /z 727 et 729. L'ancien ion correspondait à un PCdimère de type A galloylé (m/z727.13148, C37H2O16) et présentait des fragments MS/MS caractéristiques soutenant la liaison de type A : m/z601 (produit HRF de m/z 727),575(PCdimère de type A), 557 (clivage de l'eau de m/z575),449 (HRF de m/z575, voir Figure 4),423(RDA de m/z 575, voir Figure 4),285 (QM de m/z575, voir Figure 4), 169 (acide gallique), 125 (voir Figure 11) et 109 (voir Figure 11). L'une des raisons de ces différences d'AP similaires entre les extraits de plantes pourrait être les autres composés présents dans les extraits et affectant les réactions des AP.

Les mélanges PC/PD galloylés et les PD étaient réactifs et modifiés de la même manière que les mélanges PC/PD et PD non galloylés. Après oxydation, ces PA n'ont pas été détectés par MS alors qu'ils étaient encore visibles aux UV à 280 nm. Nous n'avons détecté aucun autre signal pouvant correspondre à ces PA modifiés ni à leurs éventuels produits de dégradation. Dans un échantillon, à savoir dans les feuilles d'Acacia karroo, les PD modifiés galloylés et non galloylés n'ont pas non plus été détectés par UV à 280 nm.

Dans notre étude précédente [13], où les AP dans les extraits non oxydés et oxydés ont été analysés par des méthodes de surveillance de réaction sélectionnées, nous avons remarqué qu'une bosse de galloyle claire a été détectée avec la méthode MS/MS spécifique au galloyle dans les échantillons oxydés, mais la forme de la bosse avait changé et s'était décalé en conséquence de la bosse observée dans le chromatogramme UV. Les PA gallovlés d'origine avaient été modifiés de manière à ce que le groupe galloyle puisse toujours être détecté avec la méthode de surveillance de la réaction sélectionnée [13]. Des études antérieures sur le gallate de (-)-épigallocatéchine et la (-)-épigallocatéchine ont montré que le cycle B trihydroxyphényle est le principal site d'action de l'oxydation et qu'il n'y a pas de produits détectables résultant de l'oxydation du groupement galloyle [42]. Cependant, les conditions de réaction utilisées et les produits d'oxydation obtenus étaient assez différents par rapport à notre étude car l'oxydation a été réalisée avec des radicaux peroxyle générés par la thermolyse de l'initiateur azoïque 2,2'-azobis(2,4-diméthylvaléronitrile) [42].

En plus des AP galloylés, deux échantillons, à savoir Cephalotaxus harringtomia subsp. les folioles drupacées et les feuilles de Laurus nobilis semblaient contenir des PC glycosylées ayant une unité de sucre attachée à une structure de PC. Certaines de ces PC glycosylées de type B se sont converties en PC glycosylées de type A lors de l'oxydation alcaline sans clivage de l'unité sucre. De plus, la formation de liaisons éther supplémentaires avec les PC de type A a été détectée.

3. Matériels et méthodes

La collecte de matières végétales, leur traitement et leur extraction, en plus de l'oxydation à pH 1{{10}}, ont été effectués comme indiqué précédemment [13]. L'étude initiale contenait 102 échantillons, dont nous avons analysé 55 autres échantillons au total (tableau S8). Pour l'oxydation aérienne, 20μL de chaque extrait ont été oxydés avec 18{{40}}uL de tampon pH 1{{60}} pendant 1 h à température ambiante. L'oxydation a été arrêtée en ajoutant 100 ul de HCOOH aqueux à 0,6 %. De plus, 280 μL d'eau ont été ajoutés à 20 μL du non oxydé initial avant l'analyse afin d'obtenir le volume final de 300 μL pour les échantillons non oxydés et oxydés. L'analyse par spectrométrie de masse à ultra haute résolution a été réalisée par un UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS/MS. L'instrument consistait en un système Acquity UPLC (Waters Corp., Milford, MA, USA) couplé à un spectromètre de masse quadripôle-Orbitrap (QExactiveTM, Thermo Fisher Scientific GmbH, Brême, Allemagne). La colonne utilisée était une colonne Acquity UPLC BEH Phenyl (2,1 x 100 mm, 1,7 um, Waters Corp., Wexford, Irlande). Les éluants étaient A= acétonitrile et B=0.1 % HCOOH. Un débit de 0,5 mLmin-1 a été utilisé et le profil d'élution était le suivant :0-0. 5 min, 0,1 % A dans B (isocratique) ; 0,5-5 min, 0,1-30 % A dans B (gradient linéaire) ;5-6 min, 30 % {{44} } pourcentage A dans B (gradient linéaire) ;6-6.1 min, 35-90 pourcentage A dans B (gradient linéaire) ; 6.1-9.5 min, lavage de la colonne et rééquilibrage. Le volume d'injection était de 5μL. Les données UV （λ=190-500nm） et MS ont été enregistrées tout au long de l'analyse. L'ionisation négative a été utilisée dans une source ESI chauffée avec une tension de pulvérisation de -3.0 kV, un débit de gaz gaine (N2) de 60, un débit de gaz auxiliaire (N2) de 20, un débit de gaz de balayage de 0, la température capillaire de plus de 380 degrés et la dissociation induite par collision (CID) dans la source de 30 eV. Pour la SM à balayage complet, la plage de masse de l'orbitrap était m/z150-2250, la résolution 35,000 et le contrôle automatique du gain 3×10*. Pour les analyses MS/MS, à savoir dd-MS2(TopN), les paramètres étaient les suivants : TopN 3 ; les énergies de collision normalisées étagées 20, 50 et 80 eV, la résolution 17 500 et le contrôle automatique du gain 1 × 105. L'étalonnage a été effectué par Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution (Thermo Fisher Scentific Inc., Waltham, MA, USA). Les données ont été traitées avec le logiciel Thermo Xcalibur Oral Browser (Version 3.0.63, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Comme les échantillons oxydés ont été obtenus à l'aide d'un tampon de carbonate de sodium (pH 10), le sodium a formé des ions en grappe avec de l'acide formique lors de l'analyse UHPLC-MS/MS. Par conséquent, au début de chaque chromatogramme d'ions totaux d'échantillons oxydés, un fort pic d'amas de formiate de sodium a été détecté (tableau S9). Le modèle a été facilement détecté et n'a pas affecté l'analyse des AP. Les ions fragments MS/MS de petits oligomères PA sont présentés dans le tableau S10.

4. Conclusions

Dans cette étude, nous avons analysé la composition en AP de 55 extraits de plantes avant et après oxydation alcaline par UHPLC-MS/MS à ultra haute résolution (tableau S8). Les structures PA naturelles contenaient des PC, des PD et des mélanges PC/PD de type A et B en plus de ceux alloués. Les compositions de PA étaient complexes et la SM à ultra haute résolution était nécessaire pour mesurer les masses exactes et les formules moléculaires correspondantes de divers PA. Les PC de type B dans différents extraits de plantes étaient plutôt stables et n'ont montré aucune modification ou une modification mineure due à l'oxydation alcaline. Pour certains échantillons, nous avons détecté les réactions intramoléculaires des PC produisant des liaisons éther de type A. Les PC de type A étaient également plutôt stables sans modification ou avec une modification mineure, mais, dans certaines plantes, la formation de liaisons éther supplémentaires a été détectée. Les extraits de plantes contenant des unités PD dans les AP (soit des PD purs, soit des mélanges PC/PD) étaient plus réactifs. Après oxydation alcaline, ces PA ou leurs produits d'oxydation n'étaient plus détectés par SM alors qu'un bossage de PA de type différent et/ou retardé était toujours détecté par UV à 280 nm. Les réactions intermoléculaires entre les PA ont probablement modifié ces PA de sorte qu'ils n'étaient pas détectés dans les conditions standard ESI-MS. Des études antérieures ont montré que ces AP modifiés ne peuvent pas non plus être étudiés par des méthodes de dégradation. Par conséquent, une nouvelle méthode analytique serait nécessaire pour leur identification et leur caractérisation. Les PA galloylés étaient relativement stables sous oxydation alcaline s'ils étaient à base de PC, mais des liaisons éther supplémentaires se sont formées pour soutenir la conversion des PA galloylés de type B en PA galloylés de type A. Les AP contenant deux groupes galloyle ou plus étaient plus réactifs que ceux contenant un seul groupe. Les mélanges PC/PD gallovlés et les PD étaient plus réactifs et réagissaient de la même manière que les mélanges non galloylés. Cependant, il faut noter que les réactions intra- et intermoléculaires n'étaient pas exclusives et que ces réactions pouvaient se produire simultanément. De plus, la matrice végétale et les autres composés présents ont affecté ces interactions.