Accessibilité de la chromatine et expression des microARN dans les cellules progénitrices du néphron pendant le développement du rein

Pour plus d'informations :ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, Andrew Bodnar^2,3, Débora Malte Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6,Alyssa Lawler^8,9,10, Kristy Boggs⁷, Andreas Pfenning^8,10,Jacqueline Ho^2,3*et Denis Kostka^1,4*

¹Département de biologie du développement, École de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis²Centre de recherche de Rangos, Hôpital pour enfants UPMC de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis³Département de pédiatrie, Division de néphrologie, École de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis⁴Département de biologie computationnelle et des systèmes et Pittsburgh Center for Evolutionary Biology and Medicine, Université de Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis⁵Division de médecine génétique et génomique, Département de pédiatrie, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, États-Unis⁶Département de pathologie, Laboratoire de génétique biochimique clinique, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, États-Unis⁷Département de pédiatrie, Division de gastroentérologie, d'hépatologie et de nutrition, École de médecine de l'Université de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, États-Unis.⁸Biologie computationnelle,⁹sciences biologiques, et¹⁰Institut des neurosciences, Université Carnegie Mellon, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis

Résumé

Les néphrons de mammifères proviennent d'une population decellules progénitrices du néphron, et des changements dans les transcriptomes de ces cellules contribuent à l'arrêt de la néphrogenèse, un déterminant important du nombre de néphrons. Pour caractériser l'expression des microARN (miARN) et identifier les régions régulatrices cis putatives, nous avons collecté des cellules progénitrices de néphron de souris.reinsau jour embryonnaire 14,5 et au jour postnatal zéro et analysé l'expression du petit ARN et la chromatine accessible à la transposase. Nous avons détecté l'expression de 1 104 miARN (114 avec des changements d'expression) et de 46 374 régions accessibles à la chromatine (2 103 avec des changements d'inaccessibilité). À l'échelle du génome, nos données mettent en évidence des processus tels que la différenciation cellulaire, la migration cellulaire, les interactions avec la matrice extracellulaire et les voies de signalisation développementales. De plus, ils identifient de nouveaux éléments candidats cis-régulateurs pour Eya1 et Pax8, deux gènes jouant un rôle dans la différenciation des cellules progénitrices du néphron. Enfin, nous associons des miARN qui modifient l'expression, notamment let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p et miR{{ 20}}p, avec des éléments candidats cis-régulateurs et des gènes cibles. Ces analyses mettent en évidence de nouveaux locus cis-régulateurs putatifs pour les miARN chez les progéniteurs du néphron.

Introduction

L'unité fonctionnelle de laun reinest le néphron, qui sert à filtrer les déchets et à maintenir l'homéostasie normale de l'eau, de l'acide-base et des électrolytes dans le corps. Le nombre de néphrons varie considérablement chez l'homme (généralement entre deux cent mille et plus d'un million de néphrons (Hughson et al., 2003)) et est établi avant la naissance chez l'homme (environ le jour postnatal 2-3 chez la souris (Hartman et al. ., 2007 ; Hinchliffe et al., 1991)). Les néphrons ne peuvent pas se régénérer après la naissance, et une diminution de la dotation en néphrons est associée à un risque accru de maladie rénale chronique et d'hypertension (Bertram et al., 2011). Le nombre de néphrons, à son tour, est en grande partie déterminé par une population de cellules appeléescellules progénitrices du néphron(Cebrian et al., 2014b). Dans les dernières étapes deun reindéveloppement, les progéniteurs des néphrons augmentent leur propension à se différencier, ce qui épuise progressivement leur population et marque l'arrêt à terme de la néphrogénèse (Hartman et al., 2007 ; Rumballe et al., 2011 ; Volovelsky et al., 2018). Comprendre les mécanismes qui régulent l'arrêt de la néphrogenèse a des implications importantes pour la détermination de la dotation en néphrons et du risque de maladie rénale ultérieure.

Durantun reindéveloppement, les progéniteurs de néphrons Cited1 plus /Six2 plus auto-renouvelables sont amenés à devenir des progéniteurs Cited1-/Six2 plus amorcés, puis à se différencier en vésicules rénales exprimant Wnt4-en réponse à Wnt9b/ -caténine (McMahon et al., 2016 ; Rumballe et al., 2011). Les modifications transcriptionnelles intrinsèques des progéniteurs précoces et tardifs du néphron comprennent des gènes et des voies qui influencent le vieillissement des cellules souches, en particulier mTor et son répresseur hamartin (S. Chen et al., 2015 ; Volovelsky et al., 2018). En effet, on pense que l'hamartin désensibilise les progéniteurs du néphron aux signaux d'auto-renouvellement, et contribue ainsi à l'arrêt de la néphrogénèse (S. Chen et al., 2015). L'observation selon laquelle l'accessibilité de la chromatine est enrichie pour les sites de liaison des principaux facteurs de transcription des cellules progénitrices du néphron, y compris Six2 et Wt1, par rapport aux progéniteurs tardifs du néphron (Hilliard et al. , 2019). Il a été démontré que ces facteurs de transcription se lient à des séquences activatrices situées dans des « points chauds régulateurs » du génome (O'Brien et al., 2018). L'induction de progéniteurs de néphron se produit en raison de l'augmentation des niveaux de -caténine, qui entraînent l'activation des complexes Lef1/Tcf7 au niveau des gènes prêts à activer le programme de néphrogenèse (Park et al., 2012), et il a été suggéré de se complexer avec Tcf7l1 et Tcf7l2 pour établir et maintenir des boucles régulatrices de la chromatine qui facilitent l'activation des gènes (Guo et al., 2021).

Cliquez pourPoudre de Cistanche tubulosa pour le traitement des maladies rénales

Des études récentes ont impliqué des microARN (miARN) dans la régulation de l'arrêt de la néphrogénèse. Les miARN sont de courtes molécules d'ARN non codantes qui ciblent les transcrits d'ARN messager (ARNm) pour une traduction réduite ou une dégradation accrue via le complexe de silençage induit par l'ARN (RISC) (Bartel, 2009). La protéine Lin28b est un répresseur connu de la famille let-7des miARN (Heo et al., 2008). L'expression de Lin28b diminue chez les progéniteurs du néphron au fur et à mesure de la néphrogenèse, ce qui coïncide avec une augmentation de l'expression de la famille des miARN let-7 (Yermalovich et al., 2019). De plus, l'induction conditionnelle de l'expression de Lin28b dans la lignée Wt1- entraîne la répression du miARN let-7, ce qui est suffisant pour prolonger la néphrogénèse (Yermalovich et al., 2019). On ne sait pas si d'autres miARN régulent le moment de la néphrogénèse. De plus, alors que des activateurs qui régulent l'expression des ARN longs non codants au cours de la néphrogenèse ont été identifiés (Nishikawa et al., 2019), aucun n'a été démontré pour réguler l'expression des miARN dans les progéniteurs du néphron.

Dans cette étude, nous avons cherché à identifier simultanément de nouveaux miARN qui contribuent à l'arrêt de la néphrogénèse, ainsi que des caractéristiques potentielles cis-régulatrices. Par conséquent, pour observer les changements dans l'expression des miARN et l'accessibilité de la chromatine entre le jour embryonnaire 14,5 (E14,5) et le jour postnatal zéro (P0), nous avons produit des ensembles de données appariés d'ARNm-seq et d'ATAC-seq à partir de données primaires et non passées.cellules progénitrices du néphronà ces deux moments. Nous avons identifié 114 miARN qui sont différentiellement exprimés danscellules progénitrices du néphronentre ces deux points temporels, ainsi que 2 103 régions d'accessibilité changeante de la chromatine que nous appelons régions différentiellement accessibles (DAR). Les analyses d'enrichissement des cibles génétiques prédites des miARN qui changent de manière significative ainsi que parmi les emplacements génomiques des DAR impliquent des voies qui affectent la différenciation des cellules épithéliales, la migration cellulaire, les interactions avec la matrice extracellulaire et les principales voies de signalisation du développement telles que Wnt, Notch et la signalisation TGF. . Nous observons des changements significatifs dans l'accessibilité de la chromatine et présentons plusieurs sources de preuves impliquant deux régions génomiques en tant qu'amplificateurs putatifs pour les gènes Eya1 et Pax8 dans les cellules progénitrices du néphron. Enfin, nous avons identifié des modifications cohérentes de l'accessibilité de la chromatine et de l'expression des miARN pour 33 paires de miARN et de DAR, y compris let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p et miR-9-3p, et présentent des gènes cibles putatifs exprimés dans des progéniteurs de néphron pour des miARN exprimés de manière différentielle.

Résultats

Isolement des populations de cellules progénitrices du néphron à partir de E14.5 et P0reins

Cellules progénitrices de néphronont été isolés par sélection positive pour Itg 8 à E14.5 ou à P0, et chaque échantillon a été divisé pour effectuer l'ARNm-seq, l'ATAC-seq et le contrôle qualité (Figure supplémentaire 1 AB). La PCR quantitative (qRT-PCR) a confirmé que les gènes marqueurs de progéniteurs de néphron Six2 et Cited1 (Huang et al., 2016) sont fortement exprimés dans des échantillons de progéniteurs de néphron isolés par rapport à l'ensembleun rein, plus que les marqueurs d'autres types de cellules (dont le bourgeon urétéral (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), les cellules endothéliales (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), stroma rénal (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) et vésicule rénale (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (Figure supplémentaire 1 C). En ce qui concerne le sexe, la portée utilisée pour les échantillons E14.5 variait de 27 % à 50 % de femelles, et les portées pour les échantillons P0 variaient de 31 % à 75 % de femelles. En moyenne, les échantillons E14.5 étaient de 38 % de femelles et les échantillons de P0 étaient de 49 % de femelles (Figure supplémentaire 1 D). -les populations de cellules progénitrices de néphrons appariées nous ont permis d'analyseraccessibilité de la chromatineet expression de petit ARN aux mêmes stades de développement à deux moments (E14.5 et P0).

Les progéniteurs précoces et tardifs des néphrons ont des profils transcriptionnels de miARN distincts

Le séquençage de petits ARN a détecté 1,104 transcrits de miARN connus et identifié 114 miARN qui montrent un changement significatif d'expression entre les échantillons E14.5 et P{{10}} (taux de fausse découverte ( FDR)=0.05 ; Tableau supplémentaire 1). La moitié des miARN exprimés de manière différentielle montrent une expression accrue à P0 par rapport à E14.5, et l'analyse des composants principaux met en évidence une plus grande homogénéité dans l'expression des miARN parmi les échantillons E14.5 par rapport à P0 (Figure 1A). Le regroupement hiérarchique révèle un regroupement clair des miARN dans ceux d'expression croissante et décroissante entre E14.5 et P0, respectivement (figure 1B). Les membres de la famille des miARN let-7 sont parmi les miARN les plus exprimés détectés, et nous notons que tous les membres de la famille présentant des changements significatifs présentent une expression accrue à P0 (données non présentées). Ceci est conforme aux résultats montrant qu'une réduction de l'expression de Lin28b entraîne une large augmentation de l'expression de la famille let-7 au cours de la néphrogénèse (Yermalovich et al., 2019). D'autres miARN avec une expression significativement plus élevée à P0 incluent miR-429-3p, un membre de la famille miR-200 connu pour affecter la différenciation des podocytes (Z. Li et al., 2016), et les deux miR{{30 }}a-5p et miR-125b-5p. Ces deux derniers sont connus pour réprimer les transcrits de Lin28 dans différents environnements cellulaires (Chaudhuri et al., 2012 ; Potenza et al., 2017). miARN avec une expression significativement plus faible à P0 comprend le miR-126 favorisant l'angiogenèse (S. Wang et al., 2008) et la prolifération (Schober et al., 2014).

L'outil DIANA miRPath permet l'analyse de la voie KEGG des miARN en fonction de leurs gènes cibles respectifs, comme prédit par le micro T-CDS (Vlachos et al., 2015). Nous constatons que les miARN avec les plus grands changements d'expression entre E14.5 et P 0 (haut ou bas) sont ceux qui régulent les voies jouant un rôle clé dans la néphrogenèse (Figure 1C, Figure supplémentaire 2). Par exemple, Tgf- est sécrété par les cellules stromales environnantes pour favoriser la différenciation des progéniteurs du néphron (Rowan et al., 2{{50}}18), et nous notons une expression réduite parmi les miARN progéniteurs du néphron ciblant les effecteurs en aval de la "voie de signalisation TGF" (voie KEGG mmu04350, p-value 1,45e- 6). La "voie de signalisation MAPK" (mmu04010) influence l'organisation et l'amorçage des progéniteurs du néphron pour la différenciation, et elle régule leurs interactions avec la matrice extracellulaire (ECM) via Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). Nous notons un nombre important de miARN régulés à la hausse et à la baisse qui ciblent différents gènes dans cette voie de signalisation MAPK (valeurs p de 3,5e- 6 et 3,0e- 4 pour les listes ascendantes et descendantes, respectivement) . Enfin, la voie KEGG "Extracellular matrix (ECM) receptor interaction" (mmu04512) est la voie la plus significativement enrichie identifiée, et ses gènes constitutifs sont bien plus significativement ciblés par les miARN dont l'expression augmente avec le temps (valeur p de 7,4e{ {32}} parmi les miARN croissants contre 1.1e-2 parmi les décroissants). Les gènes associés à l'ECM sont ciblés par certains des miARN les plus exprimés et en augmentation significative que nous détectons, notamment miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p, et soit-7f-5p. En particulier, miR-196a-5p est le miARN le plus exprimé dans nos échantillons, et il est multiplié par 8- entre E14,5 et P0. Les transcrits de gènes qui étaient les cibles prédites des miARN (à l'aide de TargetScan (Agarwal et al., 2015)) avec une expression accrue à P0 incluent Bach2, un lien moléculaire proposé entre les voies MAPK/AP1 et Six2/-caténine pour l'auto-renouvellement et la différenciation chez les progéniteurs du néphron, respectivement (Hilliard et al., 2019).

Pour identifier les cibles putatives des miARN exprimés de manière différentielle dans les progéniteurs du néphron, nous avons utilisé l'annotation informatique des miARN fournies dans miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) et les interactions miARN-ARNm expérimentales annotées à partir de la base de mortier (HY Huang et al., 2020), en combinaison avec notre ensemble de données de séquençage d'ARN unicellulaire E14.5 précédemment généré (Bais et al., 2020). Ainsi, nous avons généré une liste d'interactions potentielles miARN-ARNm basées sur l'expression différentielle du miR entre E14.5 et P0 dans les progéniteurs de néphron avec un changement correspondant dans l'expression du gène cible entre les progéniteurs de néphron auto-renouvelables et amorcés, ainsi que les progéniteurs amorcés et différencier les progéniteurs de néphron (Figure 2). Notre analyse suggère que Meis2 et Hmga2 sont des cibles potentielles de la famille let-7 de miARN chez les progéniteurs de néphrons (Figure 2), avec une diminution de l'expression de Meis2 et Hmga2 associée à une expression accrue des membres de la famille let-7 dans la différenciation ou le vieillissement des progéniteurs de néphrons. Le facteur de transcription Meis2 est fortement exprimé dans les progéniteurs des néphrons et le stroma rénal au cours deun reindéveloppement (Lam et al., 2014), et est lié à la régulation de la prolifération cellulaire dans d'autres contextes (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 est une protéine de liaison à la chromatine non histone, elle est fortement exprimée dans les cellules souches et a été associée à diverses tumeurs mésenchymateuses (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). De même, il y a une expression croissante de Jag1 associée à une expression décroissante de miR-34b-5p, miR-983p et miR-200a-3p dans la différenciation ou des progéniteurs de néphrons vieillissants (Figure 2). Jag1 est un ligand clé de la signalisation Notch dont l'expression augmente à mesure que les progéniteurs des néphrons se différencient (Chung et al., 2016). Toutes les cibles de miARN prédites ou annotées pour les gènes présentant des changements d'expression entre les progéniteurs de néphrons auto-renouvelables, amorcés et différenciés sont disponibles dans Supplémentaire.

Figure 1. Changements substantiels dans l'expression des miARN entre les progéniteurs de néphrons E14.5 et P0. A) L'analyse en composantes principales montre que le moment du développement est un contributeur majeur à la variation de l'expression des miARN. B) Heatmap illustrant l'expression relative de tous les miARN qui changent de manière significative. Les colonnes contenant des échantillons E14.5 à gauche sont annotées en vert clair et les colonnes avec des échantillons P0 à droite sont annotées en vert foncé. C) Enrichissement des gènes des voies KEGG spécifiques parmi les cibles génétiques prédites des miARN régulés à la hausse et à la baisse (barres rouges et bleues, respectivement). La valeur p minimale incluse est 1e-5.

Figure 2. Interactions miARN-ARNm avec un rôle possible dans le vieillissement et la différenciation des cellules progénitrices du néphron. Les miARN (cercles) et les ARNm (carrés) sont affichés. Les miARN avec une expression accrue entre E14.5 et P0 sont représentés en rouge, les miARN qui diminuent sont représentés en bleu. Gènes cibles annotés (de mirDB et mir TarBase) avec une expression croissante entre l'auto-renouvellement, l'amorçage ou la différenciationcellules progénitrices du néphron(Bais et al., 2020) sont représentés en rouge, les ARNm avec une expression décroissante en bleu. Les bords de mirDB et mirTarDB qui sont incompatibles avec les changements d'expression observés ont été omis mais sont inclus dans le tableau supplémentaire 2.

Les progéniteurs des néphrons précoces et tardifs ont des environnements de chromatine distincts

Les données ATAC-seq des progéniteurs de néphrons E14.5 et P0 nous ont permis d'identifier 46 374 régions de chromatine accessible (avec un taux de découverte irréductible (Boleu et al., 2015) seuil de {{ 22}}.1, voir (Figure supplémentaire 3 C, Tableau supplémentaire 3), combinés à travers les échantillons et les points temporels. Nous notons que nos données sont conformes aux directives ATAC-seq du projet ENCODE (ENCODE, nd) (Figure supplémentaire 3 A, B) et que nous observons des taux de conservation accrus parmi les pics d'IDR par rapport aux témoins randomisés (Figure supplémentaire 3 D). Parmi les IDR que nous rapportons, 3 576 contiennent des amplificateurs documentés dans le VISTA (Visel et al., 2007) et/ou Les bases de données d'enhancer FANTOM5 (de Rie et al., 2017) et 13 495 contiennent des séquences d'ADN avec des rôles régulateurs prédits dans au moins un tissu ou type de cellule de souris selon EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

L'analyse en composantes principales (ajustée pour les différences de sexe entre les échantillons) a révélé un regroupement clair des échantillons par point de temps de développement (figure 3A). Pour identifier les locus génomiques avec des changements dans l'accessibilité de la chromatine, nous avons comparé le signal ATAC-seq entre les échantillons E14.5 et P0. Nous avons observé 2,103 DAR, contrôlant le FDR à 10 % . Parmi ceux-ci, 1 323 (55 %) ont montré une accessibilité accrue à P0 par rapport à E14.5, et le regroupement hiérarchique a révélé une distinction claire entre les DAR qui s'ouvrent et se ferment entre E14.5 et P0, respectivement (Figure 3B).

Les empreintes des facteurs de transcription ont été identifiées à l'aide de HINT et appariées aux protéines de liaison à l'ADN à l'aide de motifs de la base de données HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018). Parmi les 431 motifs testés, les DAR contenant des empreintes pour plusieurs protéines facteurs de transcription associées à la néphrogenèse montrent une augmentation de l'accessibilité entre E14.5 et P0. Parmi les empreintes résidant dans les DAR dont l'accessibilité augmente en moyenne, les six premières appartiennent aux empreintes de facteurs de transcription correspondant à Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), Jun (0.12) et Fos (0.11). Les empreintes annotées dans les DAR de clôture incluent les facteurs de transcription E2F2 et E2F4, qui sont connus pour influencer la progression du cycle cellulaire (Gaudet et al., 2011) et pour favoriser la prolifération cellulaire (D. Wang et al., 2000) dans d'autres contextes cellulaires (Figure supplémentaire 4).

Pour évaluer le contexte biologique de l'ouverture et de la fermeture des DAR, nous avons utilisé l'outil d'enrichissement des régions génomiques d'annotations (GREAT) (McLean et al., 2010) pour mettre en évidence des ensembles de gènes avec enrichissement des régions de chromatine changeantes associées. Avec cette approche, nous identifions les processus biologiques Gene Ontology (GO) étroitement liés au développement des progéniteurs du néphron : en particulier, le processus le plus enrichi parmi les DAR ouvrants est la « régulation de la différenciation des cellules épithéliales » (GO : 0030856, valeur Q binomiale {{3 }}.5e-5), et "Régulation positive de la différenciation des cellules épithéliales" (GO:0030858, Valeur Q binomiale=5e-3) fait partie des 10 éléments les plus significativement enrichis ( Figure supplémentaire 5). Les deux sont compatibles avec une augmentation de la propension des progéniteurs du néphron à subir des transitions mésenchymateuses à épithéliales (MET) à mesure qu'ils se différencient (S. Chen et al., 2015). D'autres voies significativement enrichies incluent la "Régulation positive de la voie de signalisation Notch" (GO:0045747, valeur Q binomiale=2e-5), qui est cohérente avec le rôle que joue la signalisation Notch dans la promotion de la différenciation des progéniteurs du néphron ( Chung et al., 2016). Les 10 083 DAR de clôture détectés n'ont pas révélé de termes GO significatifs sur la base des critères de signification par défaut du GREAT (voir la figure supplémentaire 5).

Figure 3. Les différences d'accessibilité de la chromatine caractérisent E14.5 par rapport à P0cellules progénitrices du néphron.A) L'analyse en composantes principales des échantillons ATAC-seq met en évidence les points de temps de développement comme une source majeure de variation. B) Carte thermique montrant des régions IDR considérablement changeantes dans les échantillons ATAC-seq. Les échantillons/colonnes E14.5 sont annotés en vert clair et les échantillons/colonnes P0 sont annotés en vert foncé. C) Termes de processus biologique GO enrichis pour les régions génomiques qui s'ouvrent entre E14.5 et P0 selon GREAT, classés par valeur P binomiale, FDR inférieur ou égal à 0.001.

Ensuite, nous avons exploréaccessibilité de la chromatinedans les régions du génome contenant des promoteurs et des amplificateurs pour les gènes ayant des rôles publiés dans la différenciation des cellules progénitrices du néphron. Parmi ceux-ci, le facteur de transcription Six2 est essentiel pour maintenir la multipotence decellules progénitrices du néphron(Self et al., 2006), et dans tous les échantillons, nous avons observé une chromatine accessible entourant son promoteur et un amplificateur Six2 connu ~ 50 kb en amont du site de début de transcription Six2 (TSS) (O'Brien et al., 2018) (Figure 4A, B, zones ombrées en bleu). Nous notons également des régions de chromatine accessible sur le promoteur et un activateur publié pour la protéine Gdnf (Figure 4D, E), qui est sécrétée par les progéniteurs du néphron pour favoriser la ramification des bourgeons urétéraux (Sanchez et al., 1996 ; Vega et al., 1996 ). Cet activateur est situé à environ 113 kb en amont du promoteur du gène et est connu pour être sensible à la signalisation Wnt dans le contexte du développement de progéniteurs de néphron (Park et al., 2012). Alors que le promoteur de Gdnf ne change pas de manière significative au fil du temps, l'amplificateur annoté augmente considérablement l'inaccessibilité. Nous notons également des régions de chromatine accessible entourant un activateur publié actif dans les progéniteurs du néphron pour Eya1 situé à environ 325 kb en amont du TSS du gène (Park et al., 2012) (Figure 6 supplémentaire). Eya1 est un facteur de transcription qui interagit avec Six2 pour maintenir la multipotence des progéniteurs du néphron (J. Xu et al., 2014).

Nous observons plusieurs DAR qui ne chevauchent pas les caractéristiques réglementaires connues, mais englobent des régions censées avoir une activité activatrice pour des gènes spécifiques dans une variété de types de cellules de souris, comme indiqué dans EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). En plus de l'amplificateur publié d'Eya1 (Park et al., 2012) (Figure supplémentaire 6), un DAR de fermeture dans l'un des introns d'Eya1 (Figure 5A-B) englobe une région censée avoir une activité d'amplificateur sur le gène Eya1 chez la souris. cellules progénitrices neurales et cellules progénitrices granulocytes-monocytes (Gao & Qian, 2020). Conformément à une réduction de l'activité de l'amplificateur, nous avons précédemment observé que l'expression d'Eya1 est diminuée dans la différenciation des progéniteurs de néphrons à l'aide des données E14.5 scRNA-seq (Figure supplémentaire 7) (Bais et al., 2020). Ceci est cohérent avec les données ChIP-seq publiées dans les progéniteurs primaires du néphron E16.5 qui montrent un manque de la marque d'amplificateur actif, H3K27ac, et un manque de liaison de Ctnnb1, Lef1, Six2 et Tcf7 (Figure 5) (Guo et al ., 2021). Cet activateur potentiel contient également des empreintes de facteur de transcription pour Hoxd10 dans son pic, un facteur de transcription qui est essentiel pour la différenciation et l'intégration des progéniteurs du néphron lors des transitions mésenchymateuse-épithéliale (MET) (Yallowitz et al., 2011).

Un DAR qui augmente l'inaccessibilité sur le chromosome 24 chevauche une région de chromatine avec une activité activatrice prévue pour le facteur de transcription Pax8 dans des cellules cultivées à partir de rein de souris, d'épithélium intestinal et d'utérus (Gao & Qian, 2020). Pax8 est partiellement redondant avec Pax2, mais au moins un de ces deux facteurs de transcription est requis dans les progéniteurs du néphron pourun reindéveloppement (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). Nous avons précédemment observé que l'expression de Pax8 augmente dans les progéniteurs de néphron différenciés et différenciés (Figure 7 supplémentaire), et nous notons une augmentation significative de l'accessibilité dans un DAR qui englobe cette caractéristique de régulation. Cette région est également associée à une marque d'amplificateur actif, H3K27ac, et à la liaison de Ctnnb1, Lef1, Six2 et Tcf7 dans les données ChIP-seq publiées des progéniteurs primaires du néphron E16.5 (Figure 5) (Guo et al., 2021). Nous observons un certain nombre d'empreintes de facteurs de transcription qui se situent dans le pic d'accessibilité hautement conservé de ce DAR, dont deux pour Sall1, un facteur nucléaire connu pour affecter la néphrogénèse (Kanda et al., 2014), et sept empreintes étroitement groupées pour le doigt de zinc associé à MYC. protéine (Maz), un facteur de transcription dont il a été démontré qu'il a des effets dose-dépendants surun reindéveloppement chez l'homme et la souris (Haller et al., 2018). Le tableau supplémentaire 3 contient une liste complète des régions accessibles que nous trouvons ainsi que leurs statistiques d'accessibilité différentielle respectives, des annotations pour les gènes, les exons et les promoteurs qu'ils chevauchent, et des listes d'empreintes de facteurs de transcription clés liées à la néphrogénèse identifiées.

Figure 4. Profils ATAC-seq aux locus régulateurs connus et putatifs. Pour chaque panneau de haut en bas, les facettes indiquent l'enrichissement en plis deaccessibilité de la chromatinedans les échantillons E14.5 et P0, avec les IDR et les DAR identifiés comme surlignés en bleu (IDR inchangé) et en vert (DAR d'ouverture). et rouge (fermeture DAR). La facette suivante représente les annotations géniques, les positions nucléosomales (gris) et les régions sans nucléosomes (rouge) mesurées dans des échantillons groupés E14.5 et P0, et les scores de conservation PhastCon60 (le noir indique 1{{ 12}} 0 % de conservation, blanc 0 % conservé A) Promoteur et corps du gène du facteur de transcription Six2. B) Enhancer for Six2publié par Park et. Al. C) Enhancer différentiellement accessible pour Gdnf avec une accessibilité accrue à P0. D)Promoteur pour Gdnf.

Figure 5. DAR chevauchant de nouveaux amplificateurs potentiels pour les gènes liés à la néphrogénèse. A et C) Les panneaux représentent une carte de la région de 1 Mo entourant un gène d'intérêt, avec les gènes codant pour les protéines en vert et l'interaction amplificateur/promoteur proposée sous forme de boucle noire . B et D) De haut en bas, les panneaux illustrent l'enrichissement en plis deaccessibilité de la chromatinemesuré dans les échantillons E14.5 et P0, avec les IDR surlignés en vert (ouverture) et rouge (fermeture), suivis de mesures ChIP-seq dans ces régions mesurées par Guo et. Al. dans le progéniteur primaire du néphroncellules(Guo et al., 2021). Le troisième panneau représente les annotations génétiques (bleu) et les éléments régulateurs prédits de Enhancer Atlas 2.0 (rouge), et le quatrième panneau indique les empreintes de facteur de transcription identifiées dans les données ATAC-seq. Le cinquième panneau représente les nucléosomes (gris) et les NFR (rouge), et le panneau inférieur indique la conservation. A) Région 1MB contenant le corps du gène pour Eya1 et un activateur Eya1 potentiel environ 325kb en amont. B) Une région de 4,5 kb contenant l'amplificateur Eya1 potentiel. C) Région de 1 Mo contenant le locus du gène Pax8 et un activateur prédit. D) Une région de 4,5 kb contenant l'amplificateur prédit et son DAR qui se chevauche.

Les domaines topologiquement associés aident à identifier les relations potentielles entre les amplificateurs et les miARN

Les domaines topologiquement associés (TAD) sont des régions à l'échelle de la mégabase de l'organisation de la chromatine d'ordre supérieur qui résultent de l'empaquetage de la chromatine dans le noyau dans un espace tridimensionnel (Dixon et al., 2012), et les interactions activateur-promoteur sont généralement limitées à éléments au sein d'un même TAD (Symmons et al., 2014). Nous avons approximé les TAD des progéniteurs de néphrons à l'aide d'annotations générées à partir de cellules souches embryonnaires de souris (ESC) (Y. Wang et al., 2018). Pour dépister d'éventuelles régions cis-régulatrices du miARN, nous avons corrélé les changements dansaccessibilité de la chromatineavec des miARN différentiellement exprimés dans le même TAD. Dans l'ensemble, 42 778 régions accessibles uniques (environ 92 %) sont situées à l'intérieur des TAD annotés, et sur ces 3 626 0 (environ 72 %) ne chevauchent pas un promoteur connu. Cela comprend 2 103 DAR, avec respectivement 1 180 et 923 ouvertures et fermetures dans le temps. Quinze DAR d'ouverture partagent un TAD avec un ou plusieurs miARN avec une expression accrue entre E14.5 et P0, et neuf DAR de fermeture partagent un TAD avec un ou plusieurs miARN avec une expression diminuée. La figure 6 résume cette approche et illustre les distances entre les DAR et leurs miARN correspondants, qui vont de 27 kb à plus de 1 mb (moyenne : 447 kb). Le tableau 1 détaille les ensembles de relations DAR - miARN possibles, avec un DAR répertorié par miARN apparié.

Parmi les paires miRNA-enhancer annotées, on en note trois particulièrement intéressantes. Tout d'abord, un DAR d'ouverture a été identifié à 120 kb en aval de let-7c-5p et à 73 kb en aval de miR-125b-5p, qui est associé à un Six2 site de liaison dans un ensemble de données ChIP-seq progéniteur de néphron E16.5 précédemment publié (figure 7A) (Guo et al., 2021). Let-7c-5p est l'un des miARN let-7 les plus exprimés que nous détectons, et la famille let-7 est connue pour réprimer également les transcriptions Lin28b (Slack & Ruvkun, 1997 ; Zhu et al., 2011). Nous notons que Hmga2 et Meis2 sont également identifiés comme de nouvelles cibles potentielles de la famille let-7 chez les progéniteurs du néphron (Figure 2). Il a également été démontré que miR-125b-5p réprime les transcrits de Lin28 dans les types de cellules hématopoïétiques et progénitrices de souris (Chaudhuri et al., 2012). Deuxièmement, miR-9-3p est le complément inverse de miR-9-5p, un miARN dont il a récemment été démontré qu'il protège contreun reinfibrose en ciblant les voies métaboliques (Fierro‐Fernández et al., 2020). Nous détectons une diminution supérieure à 10- fois des transcrits miR -9-3 ptranscripts entre les progéniteurs de néphron E14.5 et P0, et nous avons identifié un élément régulateur potentiel à environ 249 kb (figure 7B). Nous observons des empreintes de facteurs de transcription pour Snai1 et Snai2 dans le DAR associé, qui favorisent les transitions épithéliales-mésenchymateuses (EMT) (Sundararajan et al., 2019). Enfin, nous avons apparié miR-181a-2-3p à un éventuel locus intergénique cis-régulateur 131kb en amont sur le chromosome 2, où nous notons une empreinte de facteur de transcription pour le facteur de transcription Wt1, un régulateur clé du progéniteur du néphron la survie (Kreidberg et al., 1993) et la liaison Six2 dans un ensemble de données publié sur le progéniteur du néphron E16.5 ChIP-seq (Figure 7C)) (Guo et al., 2021).

Tableau 1. Modifications de l'expression des miARN, appariées à un ou plusieurs DAR dans le même TAD.

Figure 6. Trouver des paires d'activateur candidat-cible-miARN. A) Organigramme indiquant comment les régions d'accessibilité ont été priorisées pour une éventuelle régulation de l'expression des miARN. B) Emplacements génomiques de chaque miARN projeté par rapport à leur activateur candidat (bande verticale orange). L'échelle de leur changement de pli log2 est indiquée sur l'axe des y, et les miARN avec une expression croissante ou décroissante sont mis en évidence en vert et en rouge, respectivement.

Figure 7. Quatre paires potentielles de miARN activateur-cible. Les TAD sont surlignés en gris, alignés par des points de départ et dessinés à la même échelle pour illustrer la taille relative. Les gènes connus d'Ensembl sont représentés en violet et les régions plus sombres indiquent les exons. L'accessibilité relative à E14.5 et P0 est représentée sous forme de diagrammes à barres au-dessus et au-dessous de la ligne noire horizontale, respectivement, ainsi que dans des diagrammes en médaillon illustrant l'empilement dans le DAR spécifié ainsi que les données ChIP-seq publiées par Guo et . Al. (Guo et al., 2021). Les empreintes de facteur de transcription identifiées par HINT sont répertoriées dans des bannières orange. Les diagrammes à barres dans des panneaux séparés sur la droite indiquent l'expression de miARN (vert) et les événements d'insertion Tn5 normalisés dans les régions amplificatrices proposées (orange). A) Le let-7 membre de la famille let-7c-5p est très fortement exprimé danscellules progénitrices du néphronet correspond au "pic_54636" distant de 119 ko dans une région intergénique. B) miR-9-3p correspond à un DAR distant de 249 ko. C) miR-181a 2-3p est situé à 131 kb du "pic_5887", un possible activateur intergénique.

Discussion

Dans cette étude, nous avons cherché à identifier simultanément de nouveaux miARN qui contribuent à l'arrêt de la néphrogénèse, ainsi que des caractéristiques potentielles cis-régulatrices. Nous avons identifié 114 miARN qui sont exprimés de manière différentielle dans les cellules progénitrices du néphron, ainsi que 2,103 DAR, dans E14.5 par rapport à P0reins. Nous observons plusieurs caractéristiques qui prédisent de nouveaux activateurs putatifs pour les gènes Eya1 et Pax8 danscellules progénitrices du néphron. Enfin, nous avons identifié desaccessibilité de la chromatineet l'expression des miARN change pour 33 paires de miARN et de DAR, y compris let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p, et miR-9-3p et présentent des gènes cibles putatifs exprimés dans des progéniteurs de néphrons pour des miARN exprimés de manière différentielle. Ensemble, nos données démontrent que les changements intrinsèques aux progéniteurs du néphron et dépendant du stade de la néphrogenèse se reflètent dans l'environnement chromatinien de la cellule progénitrice et dans son transcriptome de miARN.

Parmi les changements que nous observons dans le transcriptome du miARN progéniteur du néphron, nous notons de larges augmentations de l'expression dans la famille let{{0}} à mesure que les progéniteurs vieillissent. Ceci est cohérent avec les rapports précédents : la protéine Lin28b et la famille let-7 de miARN sont mutuellement antagonistes et forment un interrupteur bistable qui régit l'expression let-7 chez les mammifères (Zhu et al., 2011), et dans progéniteurs du néphron, le passage à une expression accrue de let-7 affecte directement le moment de l'arrêt de la néphrogenèse (Yermalovich et al., 2019). Nous observons également une expression accrue de miR-125b-5p, qui est également connu pour réprimer l'expression de Lin28b dans d'autres contextes cellulaires (Chaudhuri et al., 2012 ; Potenza et al., 2017). La famille let-7 et miR-125b-5p font partie des 114 miARN exprimés de manière différentielle entre E14.5 et P0 chez les progéniteurs de néphron, ce qui suggère le rôle des miARN dans le développement des progéniteurs de néphron n'est pas limité à let-7/Lin28b. Par exemple, les miARN dont l'expression diminue comprennent deux membres de la famille miR-200, dont il a été rapporté qu'ils jouent un rôle dans la différenciation des podocytes (Z. Li et al., 2016) : miR-200b -3p et miR-429-3p. Plus loin, on observe une diminution de l'expression de miR-126a 5p, connu pour favoriser la vasculogenèse (Schober et al., 2014 ; S. Wang et al., 2008). Cela peut refléter la lignée mésenchymateuse commune des progéniteurs vasculogéniques et néphrons, et l'engagement d'un sous-ensemble de ces cellules à devenir des progéniteurs néphrons.

Les analyses des voies des cibles géniques prédites de l'évolution des miARN à l'aide de DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015) montrent un enrichissement de la signalisation MAPK et TGF, deux régulateurs clés des progéniteurs du néphron (Hilliard et al., 2019 ; Ihermann-Hella et al., 2018 ). Plusieurs autres voies KEGG sont également surreprésentées parmi les cibles génétiques prédites des miARN régulés positivement, y compris les voies liées à la matrice extracellulaire, au cytosquelette d'actine et à l'adhésion focale : toutes les facettes cruciales de la migration cellulaire, de la différenciation, de la ramification, de l'attachement, de la polarisation et de la prolifération. (Rozario & Desimone, 2010). Les gènes associés à l'ECM sont ciblés par certains des miARN les plus exprimés et en augmentation significative que nous détectons, y compris le transcrit le plus exprimé que nous détectons : miR-196a-5p. miR-196a-5p est connu pour cibler Col1a1, Col1a2 et Col3a1, des gènes qui sont régulés à la hausse dans les progéniteurs de néphrons déficients en Pax2-qui subissent une transdifférenciation dans le stroma rénal (Naiman et al., 2017). Ainsi, l'augmentation de l'expression miR-196a-5p peut jouer un rôle dans le renforcement des limites de la lignée à mesure que les progéniteurs vieillissent. De plus, nous identifions de nouvelles interactions cibles potentielles miARN-ARNm qui peuvent contribuer à l'arrêt de la néphrogenèse, y compris la régulation à la hausse de la famille let-7 qui peut cibler Hmga2 et Meis2 (associé à la prolifération cellulaire) (Abruzzese et al ., 2019 ; Fusco & Fedele, 2007 ; Lam et al., 2014 ; Mugford et al., 2009) à mesure que les progéniteurs du néphron vieillissent. Hmga2 n'a aucun rôle connu dansun reindéveloppement. Cependant, on pense que Meis2 a un chevauchement fonctionnel avec le facteur de transcription apparenté Meis1, qui est connu pour être nécessaire au développement des reins (Hisa et al., 2004). Nous observons également la régulation à la baisse des miR (miR-34b-5p, miR-983p et miR-200a-3p) qui peuvent cibler Jag1, qui est connu pour être régulé à la hausse et important dans la différenciation des néphrons (Chung et al., 2016).

Parallèlement à l'évolution du transcriptome du miARN, nous avons simultanément mesuré les changements dans l'environnement de la chromatine de la cellule progénitrice du néphron entre E14.5 et P0. Nous décrivons deux nouveaux activateurs putatifs pour Eya1 et Pax8, basés sur (i) leur proximité avec ces promoteurs de gènes, (ii) leurs changements respectifs dansaccessibilité de la chromatinependant le développement étant en ligne avec les changements d'expression génique en pseudo-temps pendant la différenciation, (iii) les empreintes deun reinfacteurs de transcription de développement, (iv) conservation de la séquence, (v) preuve de la fonction d'amplificateur dans d'autres tissus/types de cellules d'Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020), et (vi) données ChIP-seq dans E16 .5 progéniteurs de néphrons pour une marque d'amplificateurs actifs (H3K27ac) et de liaison aux facteurs de transcription de Ctnnb1, Lef1, Six2 et Tcf7. Nous observons une diminution de l'accessibilité de la chromatine pour l'amplificateur Eya1, ce qui est cohérent avec le rôle d'Eya1 dans la promotion de la multipotence des progéniteurs du néphron et avec les rapports selon lesquels la perte d'Eya1 entraîne l'épithélialisation précoce de la population progénitrice (J. Xu et al., 2014 ; PX Xu et al., 1999). Pax8 et son homologue Pax2 contribuent à la spécification de la lignée des progéniteurs de néphron (Bouchard et al., 2002), et les progéniteurs de néphron sans au moins un de ces gènes ne subiront pas de MET (Narlis et al., 2007). L'accessibilité accrue de la chromatine que nous détectons pour l'activateur putatif Pax8 est cohérente avec l'augmentation de l'expression de Pax8 dans l'épithélium rénal à mesure que les néphrons se différencient.

L'analyse d'enrichissement (McLean et al., 2010) des DAR a révélé que la "régulation de la différenciation épithéliale" était le terme le plus significativement enrichi parmi les régions d'ouverture de la chromatine, indiquant que les DAR que nous détectons peuvent contenir des caractéristiques régulatrices conduisant ou répondant aux signaux de différenciation et de développement decellules progénitrices du néphronen types de cellules épithéliales. La signalisation Notch est l'un des termes GO les plus significativement enrichis identifiés parmi les DAR d'ouverture, et dans les progéniteurs du néphron, cette voie est connue pour réprimer l'expression de Six2 et favoriser la différenciation des cellules progénitrices du néphron (Chung et al., 2016). Parmi les gènes impliqués dans cette voie figure Jag1, un ligand clé de la signalisation Notch dont l'expression est inversement corrélée à l'expression de Six2 et Hes1 (Chung et al., 2016). Nous notons que Jag1 est une cible annotée pour trois miARN avec une expression croissante (miR34b-5p, miR98-3p et miR200a-3p, figure 2). Enfin, nous observons un enrichissement des gènes associés au remodelage des vaisseaux sanguins et à la morphogenèse lors de l'ouverture des DAR, bien que cela semble être une conséquence des gènes partagés entre ces voies de développement et la différenciation des cellules épithéliales, notamment Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 et Hey2.

Changements dansaccessibilité de la chromatineparmicellules progénitrices du néphronont été mesurés dans des études antérieures (Guo et al., 2021 ; Hilliard et al., 2019).

Dans l'ensemble, nos résultats sont cohérents avec ces études précédentes, mettant en évidence les gènes liés à Notchsignaling et Pax8-. Notamment, cependant, il existe certaines différences expérimentales dans ces études antérieures par rapport à ce rapport. L'isolement des progéniteurs de néphrons exprimant la GFP à l'aide d'une cellule activée par fluorescence de la souris rapporteur du transgène Six2-TGC est potentiellement confondu par la découverte que cet allèle a une diminution signalée du nombre de néphrons d'environ 45 % (Hilliard et al. , 2019 ; Volovelsky et al., 2018). De plus, il a été démontré que les progéniteurs de néphron en culture (cultivés avec du CHIR à faible ou à forte dose) ont des transcriptomes distincts des progéniteurs de néphron primaires, ce qui suggère que leur accessibilité à la chromatine serait également différente (Guo et al., 2021 ; Hilliard et al., 2019). Étant donné que l'objectif de notre étude était de comprendre comment les changements dans le paysage de la chromatine ont un impact sur l'expression des miARN chez les progéniteurs de néphrons précoces et tardifs, l'analyse des progéniteurs de néphrons primaires était nécessaire.

Cistanche est meilleur pour les reins

En combinant ces changements observés dans l'environnement de la chromatine avec des changements correspondants dans l'expression des miARN, nous impliquons plusieurs nouvelles paires putatives de miARN-amplificateur dans l'arrêt de la néphrogénèse pour une étude plus approfondie. Les miARN miR-125a-5p et let-7c-5p, par exemple, voient une augmentation significative de l'expression entre E14.5 et P0 , et ceci est récapitulé par l'inaccessibilité croissante d'un DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) dans le même TAD. Ce DAR est également associé à un site de liaison Six2 (Guo et al., 2021) et peut désigner un activateur qui affecte l'expression de miR-125a-5p et/ou let{{18} }c-5p, qui à son tour pourrait favoriser la différenciation par la répression de Lin28b. De même, nous observons un activateur possible pour miR 181a, qui est connu pour moduler l'expression de la rénine chez l'homme (Marques et al., 2015) et a été considéré comme une cible thérapeutique pour réduire la néphrotoxicité en raison de sa capacité à réprimer BIRC6 et l'apoptose (Liu et al. al., 2018). Enfin, nous observons un DAR de fermeture associé à miR-9-3p qui a des empreintes de facteurs de transcription pour les protéines sensibles à la signalisation Wnt Snai1 et Snai2.miR-9-3p's reverse complément, miR-9-5p, est connu pour protéger deun reinfibrose (Fierro-Fernández et al., 2020), il a été démontré que Snai1 et Snai2 favorisent la métastase du carcinome dans les cellules cancéreuses de la peau de souris (Olmeda et al., 2008) et favorisent les transitions épithéliales-mésenchymateuses (EMT) chez les patients cancéreux (Sundararajan et al., 2019), tandis que miR-9 est connu pour favoriser l'angiogenèse et la migration des cellules endothéliales tumorales (Zhuang et al., 2012). Un mécanisme peut exister dans lequel l'augmentation de la signalisation Wnt entraîne une expression réduite de Snai1 et Snai2, qui à son tour réduit l'expression de miR-9-3p pour prendre en charge la différenciation des progéniteurs du néphron.

Notre étude a identifié de manière exhaustive les changements dans le paysage de la chromatine et le transcriptome des miARN des progéniteurs du néphron au cours du développement embryonnaire, et nous avons identifié des régions candidates cis-régulatrices et des miARN qui pourraient jouer un rôle dans l'arrêt de la néphrogenèse. Les analyses d'enrichissement pour les données d'ARNm-seq et d'ATAC-seq fournissent des indices attrayants sur les mécanismes qui peuvent être impliqués, tels que les voies qui régulent la différenciation des progéniteurs de néphron, y compris Notch et TGF-. Nous rapportons également deux nouveaux éléments régulateurs putatifs pour Eya1 et Pax8, des gènes connus pour être importants dansun reindéveloppement et séquences régulatrices potentielles pour les miARN clés qui sont impliquées dans l'arrêt de la néphrogenèse.

Méthodes

Souches de souris

Des femelles gestantes CD -1 de type sauvage ont été obtenues auprès de Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, États-Unis, RRID : MGI : 5659424) etreinsont été prélevés sur des portées au jour embryonnaire E14.5 ou P0. Tous les animaux ont été hébergés dans le vivarium du Rangos Research Center de l'UPMC Children's Hospital of Pittsburgh (Pittsburgh, PA, USA) et toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux politiques de l'Institutional Animal Care and Use Committee de l'Université de Pittsburgh. Le sexe de chaque embryon ou chiot a été identifié en effectuant une PCR sur l'ADN génomique isolé à partir de coupures de queue à l'aide des amorces suivantes pour le gène Sry du chromosome Y : SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAAATGTGAGGTA-3ʹ et SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA-3', comme précédemment publié (McFarlane et al., 2013).

Séquençage et analyse de petits ARN

ARN total isolé de lacellules progénitrices du néphronrestant après le retrait de la fraction cellulaire ATAC-seq a été soumis au noyau de séquençage des sciences de la santé de l'hôpital pour enfants UPMC de Pittsburgh pour la préparation de la bibliothèque à l'aide du kit de préparation de bibliothèque QIAseq miRNA (Qiagen 3315{{10}}2). Le séquençage à une extrémité des bibliothèques d'ARNm-seq a été effectué sur un Illumina NextSeq500, et les bibliothèques ont été séquencées jusqu'à une profondeur d'environ 50 millions de lectures à une extrémité par bibliothèque. Les lectures séquencées ont ensuite été alignées sur le génome mm10 de la souris à l'aide du package Rsubread (Liao et al., 2019) (version 2.0.1) et annotées sur les miARN connus répertoriés dans miRBase (version 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014) avec la fonction featureCounts du package Rsubread. L'expression différentielle des miARN connus a été mesurée à l'aide du package DESeq2 R (version 1.26.0) (Love et al., 2014). La fraction de lectures alignées annotées sur des miARN connus ainsi que la fraction d'embryons femelles par échantillon ont été incluses en tant que cofacteurs dans le modèle de test soumis à DESeq2. Les miARN exprimés de manière différentielle ont ensuite été identifiés tout en contrôlant le taux de fausses découvertes à 5 %, et leur sens de changement (croissant contre décroissant) a été déterminé en fonction de leur valeur de changement de pli ("croissant" indiquant une expression plus élevée à P0 par rapport à E14.5) . L'enrichissement des voies de régulation parmi les cibles géniques prédites de miARN avec une expression significativement croissante et décroissante a été calculé à l'aide des outils DIANA miRPath version 3.0 (Vlachos et al., 2015). Les transcrits cibles prédits pour les miARN ont été extraits des référentiels TargetScan (Agarwal et al., 2015) et miRDB (Y. Chen & Wang, 2020).

Isolement des progéniteurs de néphron

Reinsont été disséqués à partir de portées d'embryons {{0}} E14.5 ou de chiots P0, et chaque portée a été considérée comme un échantillon. Un rein par échantillon a été utilisé pour l'isolement de l'ARN total à utiliser comme "témoin de rein entier" dans les analyses ultérieures (voir ci-dessous). Au total, trois échantillons ont été prélevés à chaque instant. Les cellules corticales ont ensuite été isolées de chaque échantillon en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) comme précédemment publié (Brown et al., 2011). En bref, les reins ont subi une digestion partielle avec de la collagénase A 2 mM (Roche 11088793001) et de la pancréatine 3,5 mM (Sigma P1625) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 15 minutes à 37 degrés. La réaction de digestion a été arrêtée à l'aide de sérum bovin fœtal froid à 100 % (FBS), et la suspension cellulaire a été collectée et remise en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) froide avec un inhibiteur de protéase de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) 1 mM (Sigma-Aldrich 10837091001). Les cellules ont été lavées et remises en suspension dans un tampon d'isolement glacé composé de 2% de FBS dans du PBS, puis incubées avec des billes magnétiques (kit Dynabeads FlowComp Flexi, ThermoFisher 11061D) biotinylées aux anticorps pour l'intégrine alpha 8 (Itg 8, R&D Systems AF4076) à l'aide du kit de marquage des protéines de biotine DSB-X (ThermoFisher D-20655). Les progéniteurs de néphron liés à ces billes ont été isolés comme précédemment publié (Hemker et al., 2020) et regroupés dans les reins pour chaque échantillon. Une aliquote de 50 000 cellules progénitrices de néphron a été immédiatement traitée par leaccessibilité de la chromatineprotocole de préparation de la bibliothèque (voir ci-dessous), et l'ARN total a été extrait de la suspension cellulaire restante à l'aide du kit Qiagen miRNeasy Mini (Qiagen 217004).

Pour confirmer l'enrichissement decellules progénitrices du néphronpar rapport à d'autres types de cellules, l'ARN total a été isolé à partir de progéniteurs de néphrons ainsi que de cellules entières.reins(contrôle du rein entier, voir ci-dessus), et une PCR quantitative de transcription inverse (qRT-PCR) pour les marqueurs suivants : marqueurs progéniteurs du néphron Six2 et Cited1 (L. Huang et al., 2016), et pour Lhx1, Pdgfr , Pecan et Caleb qui marquent la vésicule rénale (Brunskill et al., 2014), le stroma rénal (S. Chen et al., 2015), l'endothélium (Kobayashi et al., 2008) et le bourgeon urétéral (Cebrian et al., 2014a ) cellules, respectivement ; voir également la figure supplémentaire 1. Gapdh (Barber et al., 2005) a été utilisé comme gène de ménage et la quantification relative a été calculée via la méthode 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001). Les amorces pour ces transcriptions sont incluses dans le tableau 2.

Tableau 2. Amorces RT-PCR.

Accessibilité de la chromatinepréparation de la bibliothèque

Environ 50,000cellules progénitrices du néphronont été utilisés pour générer chaque bibliothèque de séquençage pour ATAC-seq à l'aide du kit de préparation de bibliothèque Nextera DNA Flex (Illumina FC-121-1030) avec des modifications selon une méthode publiée précédemment (Buenrostro et al., 2013). En bref, les cellules ont été mises en suspension dans un tampon de lyse non ionique glacé composé de Tris 10 mM, de NaCl 10 mM, de MgCl2 3 mM, d'inhibiteur de protéase PMSF 1 mM et de 0, 05% de Triton X -100 en volume pendant 10 minutes pour lyser la cellule membranes tout en laissant les membranes nucléaires intactes. Les noyaux intacts des progéniteurs de néphron ont été remis en suspension dans un tampon de transposition contenant l'enzyme transposase et incubés à 37 degrés pendant 30 minutes. L'ADN génomique libre libéré par le processus de transposition a été purifié à l'aide du kit MinElute PCR Purification (Qiagen 28004), puis indexé à l'aide d'amorces d'index direct (i7) et inverse (i5) du kit Nextera Index (Illumina FC-121-1011). La ligature d'index et l'amplification des fragments ont été réalisées à l'aide du programme de cycle thermique d'amplification PCR de la méthode.

Pour déterminer le nombre optimal de cycles d'amplification requis pour la bibliothèque ATAC-seq, une réaction secondaire qPCR a été réalisée à l'aide de SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) et d'un 96-well C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) pour calculer la valeur normalisée valeur du rapporteur (Rn) pour chaque cycle. Le nombre de cycles auquel la réaction a atteint un tiers de sa fluorescence maximale a été identifié comme le nombre optimal de cycles d'amplification restants, et le volume restant de la réaction de transposition ATAC-seq indexée a été soumis à ce nombre de cycles supplémentaires dans l'amplification finale. programme. Les bibliothèques finales ont été purifiées à l'aide de billes magnétiques Ampure XP (Beckman Coulter A63881).

Accessibilité de la chromatineséquençage

Le séquençage apparié de la bibliothèque ATAC-seq a été effectué sur un Illumina NextSeq500 par le Health Sciences Sequencing Core de l'UPMC Children's Hospital de Pittsburgh, multiplexé avec des concentrations de bibliothèques censées produire 90 millions de lectures appariées par échantillon . La qualité des lectures a été ajustée à l'aide de TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (version 0.4.3) en mode "--apparié" et avec les autres paramètres par défaut. Les lectures ont été alignées sur le génome mm10 (Church et al., 2011) à l'aide de Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (version 2.3.1) avec les paramètres "--local -q -X 2000 -- m". Les lectures résultant de doublons PCR du même fragment d'ADN ont été marquées à l'aide de la fonction MarkDuplicates de Picard Tools (Broad Institute, 2016) (version 2.10.9) avec les paramètres par défaut. Les lectures mappées de manière ambiguë à plus d'un emplacement dans le génome ont été assignées au hasard à l'un de ces emplacements s'il y avait moins de quatre possibilités, et ont été autrement éliminées (ENCODE, nd) (à l'aide d'un script Python disponible sur https://github. com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) avec les paramètres "--paired-end -k"). Samtools (H. Li et al., 2009) (version 1.3.1) a été utilisé pour filtrer les lectures dupliquées, non cartographiées, orphelines et mitochondriales, ainsi que pour le tri et l'indexation des fichiers BAM. Le contrôle de la qualité des données ATAC-seq a suivi les directives ATAC-seq du projet ENCODE (ENCODE, nd), et les bibliothèques d'échantillons ont été sous-échantillonnées de manière aléatoire pour contenir chacune 31 millions de lectures appariées afin de normaliser les différences de taille des bibliothèques.

Cistanche peut prévenir l'infection rénale

Identification des régions de chromatine accessibles

Les fichiers BAM contenant des lectures ATAC-seq filtrées ont été convertis au format BED apparié à l'aide de Bedtools '(Quinlan & Hall, 201{{20}}) (version 2.26.0) 'bombed ' fonction avec paramètres "- bed pe -mate1". Les régions de chromatine accessible ont été identifiées à l'aide de l'algorithme d'appel de pic large de l'outil d'analyse basée sur le modèle de ChIP-seq (MACS2, version 2.1.1.20160309) (Zhang et al., 2008), avec les paramètres "-- format BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --large --décalage 37 --taille du texte 75 --conserver tout le --modèle". Pour identifier les régions accessibles de haute confiance, des comparaisons par paires (de chaque combinaison de répétitions à partir d'un moment donné) ont été effectuées et le taux de découverte non reproductible (IDR) (Q. Li et al., 2011) a été calculé à l'aide d'un outil accessible au public. Implémentation Python (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) avec les paramètres "--input-file-type broad peak --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.1 --lit de type de fichier de sortie". Plus précisément, pour chaque instant, un fichier BED concaténé de toutes les régions accessibles a été soumis via l'argument "--peak-list" pour chaque comparaison (par exemple, lors de la comparaison de deux échantillons E14.5, tous les pics larges E14.5 entre les trois répétitions sont utilisées). Les régions d'accessibilité qui étaient cohérentes par IDR dans au moins deux comparaisons répétées par paires (avec un minimum de 20 % de chevauchement) ont été combinées en un ensemble unifié de régions accessibles à haute confiance ("régions IDR").

Changements dans les régions de chromatine accessibles

L'accessibilité de chaque région IDR au sein d'un échantillon donné a été quantifiée en comptant le nombre d'événements de transposition qui se produisent lors de la normalisation de la séquence GC-content à travers les échantillons. Cela a été réalisé à l'aide d'un script personnalisé (disponible dans le référentiel de logiciels d'accompagnement, voir les données supplémentaires). Les modifications de cette accessibilité ont ensuite été déterminées en comparant ces valeurs à différents moments à l'aide du progiciel Limma-voom (version 3.42.2) (Ritchie et al., 2006). Pour tenir compte du sexe de l'embryon, la fraction d'embryons femelles dans chaque échantillon a été incluse en tant que cofacteur dans les modèles linéaires utilisés pour l'analyse d'accessibilité différentielle, et elle a été supprimée en tant qu'effet de lot dans les visualisations à l'aide de la fonction de suppression d'effet de lot du package Limma. Les régions différentiellement accessibles de la chromatine (DAR) ont été jugées significativement ouvertes (accessibilité accrue entre E14.5 et P0) ou fermées (accessibilité réduite entre E14.5 et P0) lors du contrôle du taux de fausse découverte à 10 %. . Les analyses d'enrichissement fonctionnel des régions génomiques d'ouverture et de fermeture ont été déterminées en soumettant les coordonnées respectives à l'outil d'enrichissement des régions génomiques d'annotations (GREAT, disponible sur http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010 ). Des annotations d'amplificateurs connus et prédits ont été extraites des référentiels FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007) et EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Empreintes des facteurs de transcription

Les empreintes des facteurs de transcription ont été identifiées en regroupant tous les fichiers BAM à partir du même point dans le temps, puis en exécutant le logiciel Hmm-based Identification of TF Footprints (HINT) de la Regulatory Genomics Toolbox (version 0.12.3), en particulier le modèle d'empreinte pour l'ATAC -seq data (disponible sur www.regulatory-genomics.org ) (Z. Li et al., 2018). Ce logiciel a été exécuté avec les paramètres "empreinte droite --organism=mm10 --at-seq --paired-end". Les empreintes ont ensuite été annotées avec des motifs de liaison de souris connus de la base de données HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018) à l'aide de la fonction de correspondance de motifs de HINT avec les paramètres "analyse du motif droit correspondant à --organisme=mm10". Les empreintes avec des scores HINT inférieurs à 10 ont été exclues. Enfin, les modèles d'activité différentiels parmi les empreintes correspondant aux motifs ont été mesurés à l'aide de la fonction différentielle du programme RGT-HINT, avec des paramètres "différentiel à droite --organisme=mm10 --bc {{27} }NC 12 --profils de sortie". Des niveaux d'activité considérablement changeants ont été identifiés sur la base d'un seuil de valeur p de 0,05 (méthode de Friedman-Nemeny).

Cistanche peut améliorer la fonction rénale

Configuration nucléosomale

Les lectures alignées du même point temporel ont été regroupées dans un seul fichier BAM, et le package NucleoATAC (version 0.3.4) a été utilisé pour identifier les modèles de longueurs de lecture suggérant à la fois des dyades nucléosomales liées et des régions sans nucléosome ( NFR) (Schep et al., 2015). Ce logiciel a été exécuté en utilisant les paramètres par défaut. Les nucléosomes ont été annotés comme la région de 146 pb centrée autour de chaque dyade appelée nucléosome.

Expression d'ARN unicellulaire

Les données d'expression génique unicellulaire ont été traitées pour un manuscrit précédent (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020) et ont été extraites du Gene Expression Omnibus (GÉOÏDE GSE158166). Les données traitées incorporées dans la figure supplémentaire 7 comprennent les types de cellules, les niveaux d'expression génique, les incorporations de faible dimension (tSNE) et les annotations pseudo-temporelles relatives à la trajectoire établie entre les grappes de progéniteurs de néphrons en prolifération et en différenciation. Les données ont été consultées et organisées à l'aide du package SingleCellExperiment R (Lun & Risso, 2019).

Interactions miARN-ARNm dans le vieillissement et la différenciation des cellules progénitrices du néphron

Gènes dont l'expression change entre l'auto-renouvellement, l'amorçage et la différenciationcellules progénitrices du néphronont été obtenus à partir des tableaux supplémentaires 3 et 4 publiés par Bais et al. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Séquençage de l'immunoprécipitation de la chromatine chez les progéniteurs primaires du néphron

Les données de séquençage d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) pour la liaison -caténine, Lef1, Six2 et Tcf7 dans les progéniteurs primaires du néphron ont été extraites des fichiers BedGraph du référentiel GEO (GSE131119) pour Guo et al., 2021. Les valeurs du signal d'enrichissement du pli ont été moyennées à travers des échantillons répétés.

Recherche d'éléments régulateurs affectant l'expression des miARN

Pour dépister les activateurs potentiels des miARN, nous avons annoté les miARN et les DAR avec les domaines topologiquement associés (TAD) dans lesquels ils se trouvent sur la base des annotations mm10 des cellules souches embryonnaires de souris, téléchargées à partir du navigateur de génome 3D (disponible sur http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Régions deaccessibilité de la chromatineet les miARN étaient considérés comme des activateurs candidats - des paires de miARN si elles occupaient le même TAD et montraient des changements constants dans l'accessibilité et l'expression (augmentation de l'accessibilité avec l'augmentation de l'expression des miARN et vice versa). Les DAR n'étaient considérés comme des "caractéristiques de régulation" possibles que s'ils ne chevauchaient pas un promoteur connu ou une extrémité d'exon. Les paires potentielles de miARN et d'éléments régulateurs putatifs ont été priorisées si elles 1) appartenaient au même TAD et 2) subissaient des changements significatifs entre E14.5 et P 0 (augmentation de l'expression du miARN et augmentation de l'accessibilité de la région IDR, et vice versa) .

Remerciements

Shelby Hemker et Abha Bais ont contribué à la conception expérimentale. Le séquençage pour ATAC-seq et mRNA-seq a été réalisé par le Health Sciences Sequencing Core de l'UPMC Children's Hospital de Pittsburgh.

Intérêts concurrents

Aucun intérêt concurrent déclaré

Financement

AC a été soutenu par des subventions du National Institute of Diabetes and Digestive andUn reinMaladies relevant de l'Institut national de la santé (T32DK061296-17). DK a été soutenu par des subventions de l'Institut national des sciences médicales générales relevant de l'Institut national de la santé (R01GM115836). JH a été soutenu par des subventions de l'Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales relevant de l'Institut national de la santé (R01DK103776 et 125015). DMC a été soutenu par une bourse de développement de carrière du réseau d'étude du syndrome néphrotique (NEPTUNE) et une bourse postdoctorale du conseil consultatif de recherche de l'hôpital pour enfants de Pittsburgh. YP a été soutenu par des subventions de l'UPMC Children's Hospital de Pittsburgh et du North American Mitochondrial Disease Consortium.

Disponibilité des données

Les amplificateurs de souris prédits ont été extraits de FANTOM5 (DOI : 10.1038/nature12787 ; fichier disponible ici), Vista (DOI : 10.1093/var/gkl822 ; fichier disponible ici) et EnhancerAtlas (DOI : 10.1093/var/gkz980 ; fichiers de souris disponibles ici) bases de données. Le génome de la souris mm10 et ses annotations ont été téléchargés via le projet Illumina genomes (disponible ici). Le fichier sur-chaîne pour soulever les coordonnées mm9 à mm10 a été récupéré à partir du navigateur du génome UCSC (DOI : 10.1101/gr.229102 ; fichier disponible ici). Les annotations TAD des cellules souches embryonnaires de souris ont été extraites du navigateur de génome 3D (DOI : 10.1186/s13059-018-1519-9 ; fichier disponible ici). Les cibles de transcrit miARN prédites ont été extraites de TargetScan (DOI : 10.7554/eLife.05005, fichier disponible ici) et de miRDB version 6 (DOI : 10.1093/var/gkz757, fichier disponible ici). Les données ATAC-seq, y compris les emplacements IDR/DAR, les annotations et les résultats d'enrichissement différentiel, sont disponibles sur GEO (GSE168339), tout comme les données d'ARNm-seq, y compris les annotations et les résultats d'expression différentielle (GSE168342). Le code informatique utilisé pour traiter et analyser les données, et pour générer des chiffres est disponible sur https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

Bibliographie

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M (2019). Le facteur de transcription homéobox MEIS2 est un régulateur de la survie des cellules cancéreuses et de l'activité des IMiDs dans le myélome multiple : modulation par les inhibiteurs des protéines Bromodomain et Extra-Terminal (BET). Mort cellulaire et maladie, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW et Bartel, DP (2015). Prédire les sites cibles de microARN efficaces dans les ARNm de mammifères. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Un atlas des activateurs actifs dans les types de cellules et les tissus humains. Nature, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014). Garniture à gogo. En Bioinformatique. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_à gogo

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J. et Kostka, D. (2020). Le séquençage de l'ARN unicellulaire révèle une activité différentielle du cycle cellulaire dans les populations cellulaires clés au cours de la néphrogenèse. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA et Clark, BJ (2005). GAPDH en tant que gène domestique : analyse de l'expression de l'ARNm de GAPDH dans un panel de 72 tissus humains. Génomique physiologique. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). Reconnaissance de cible de microARN et fonctions de régulation. Cellule, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroARN

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD, & Hoy, WE (2011). Nombre de néphrons humains : implications pour la santé et la maladie. Néphrologie pédiatrique, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ et Li, Q. (2015). Taux de découverte non reproductible (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). Spécification de la lignée néphrique par Pax2 et Pax8. Gènes et développement. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

De : Journal Pré-épreuve

2021 Publié par Elsevier Inc.