La maladie rénale chronique augmente les microhémorragies cérébrales chez la souris et l'homme

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Wei Ling Lau1,2 & Ane CF Nunes 1 & Vitaly Vasilevko3 & David Floriolli4 & Long Lertpanit 1 & Javad Savoj 1 & Maria Bangash 1 & Zhihui Yao 1,5 & Krunal Shah6 & Sameen Naqvi 1 & Annlia Paganini-Hill6 & Nosratola D. Vaziri 1 & David H Cribbs3 & Mark Fisher6,7

Reçu : 25 août 2018 /Révisé : 28 janvier 2019 /Accepté : 22 février 2019 /Publié en ligne : 4 mai 2019

# Le(s) Auteur(s) 2019

Cistanchepeut soulagermaladie du rein

Résumé

Les microsaignements cérébraux sont augmentés danschroniqueun reinmaladie(IRC) et leur présence augmente le risque de déclin cognitif et d'accident vasculaire cérébral. Nous avons examiné l'interaction entre l'IRC et les microhémorragies cérébrales (le substrat neuropathologique des microhémorragies) dans des modèles de culture de souris et de cellules et étudié la progression de la charge de microhémorragies sur l'imagerie cérébrale en série chez l'homme. Études chez la souris : deux modèles d'IRC ont été étudiés : la néphrite tubulo-interstitielle induite par l'adénine et la néphrectomie chirurgicale 5/6. Études de culture cellulaire : des cellules endothéliales cérébrales de souris bEnd.3 ont été cultivées jusqu'à confluence, et l'intégrité de la monocouche a été mesurée après exposition à 5 à 15 % de sérum urémique humain ou à des concentrations croissantes d'urée. Études humaines : La progression des microhémorragies cérébrales a été évaluée sur des IRM en série chez des patients témoins, pré-dialyse CKD et dialysés. Les microhémorragies ont été augmentées de 2 à 2,5- fois chez les souris atteintes d'IRC indépendamment de l'augmentation de la pression artérielle dans le modèle de néphrectomie 5/6. La coloration IgG a été augmentée chez les animaux CKD, ce qui correspond à une perméabilité accrue de la barrière hémato-encéphalique. L'incubation des cellules bEnd.3 avec du sérum urémique ou de l'urée élevée a produit une chute dose-dépendante de la résistance électrique trans-endothéliale. Une urée élevée induit des dérangements du cytosquelette d'actine et une diminution de l'expression de la claudine-5. Chez les sujets humains, la prévalence des microhémorragies était de 50 % dans les deux cohortes d'IRC, contre 10 % chez les témoins appariés selon l'âge. Un plus grand nombre de patients de la cohorte de dialyse présentaient une augmentation des microhémorragies lors du suivi par IRM après 1,5 an. L'IRC perturbe la barrière hémato-encéphalique et augmente les microhémorragies cérébrales chez la souris et les microhémorragies chez l'homme. L'urée élevée modifie le cytosquelette d'actine et les protéines de jonction serrées dans les cellules endothéliales cultivées, suggérant que ce mécanisme explique (au moins en partie) les microhémorragies et les microhémorragies observées dans les études animales et humaines.

Mots clés Maladie rénale chronique. Microsaignements. Modèle de souris. Culture de cellules endothéliales. CerveauIRM

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Introduction

L'une des découvertes les plus importantes de ces dernières années dans le domaine de la neurologie dechroniqueun reinmaladieavoir un impact qui va bien au-delà des facteurs de risque traditionnels tels que l'hypertension et le diabète [10, 11]. Compte tenu de la prévalence élevée (environ 50 %) des microhémorragies cérébrales et des troubles cognitifs chez les patients atteints d'IRC avancée [2–4, 6, 7], cette relation mérite une étude plus approfondie.

Les microhémorragies cérébrales sont de petits foyers d'hémosidérine-fer démontrables à l'imagerie par résonance magnétique (IRM), censés refléter des microhémorragies cérébrales sous-jacentes [12, 13] et indicatifs d'un risque accru d'accident vasculaire cérébral, à la fois hémorragique et ischémique [9, 14]. Des séquences IRM spécifiques (écho de gradient et imagerie pondérée en susceptibilité) mettent en évidence ces foyers de perte de signal dans le parenchyme cérébral mesurant inférieur ou égal à 10 mm [12, 15]. Les microhémorragies cérébrales dépendent de l'âge, avec une prévalence approchant les 20 % à l'âge de 65 ans [16]. Outre l'âge, l'hypertension et l'angiopathie amyloïde cérébrale sont les facteurs de risque les mieux décrits pour le développement de microhémorragies [13, 17]. Au stade avancé de l'IRC, les microhémorragies sont présentes chez jusqu'à 50 % de la population [2–4].

Parallèlement, les troubles cognitifs sont à la fois plus fréquents et plus graves à des niveaux inférieurs deun reinfonction[18], atteignant une prévalence de 30 à 70 % chez les patients dialysés chroniques [6, 7]. Dans une analyse transversale de 338 patients hémodialysés âgés de 55 ans et plus avec des témoins appariés selon l'âge, 34 % des patients dialysés présentaient des troubles cognitifs graves, contre 12 % des témoins [6]. Un autre 35 pour cent de la cohorte de dialyse avait une déficience cognitive modérée [6].

Plusieurs études dans des cohortes non CKD ont démontré une forte association entre les microhémorragies cérébrales et le déclin des fonctions cognitives [19–22]. Les données épidémiologiques soutiennent la coexistence de la charge de microhémorragie IRM et du dysfonctionnement cognitif chez les patients atteints d'insuffisance rénale terminale (IRT) [8, 23]. De plus, un rapport récent de 28 patients dialysés chroniques avec une IRM cérébrale en série a montré une association entre de nouveaux microhémorragies et une baisse du score au mini-examen de l'état mental (MMSE) [4]. De plus, les patients atteints d'IRT ont un taux d'incidence 3- à 4- fois plus élevé d'AVC ischémiques et hémorragiques par rapport à la population générale [5]. Dans une cohorte de patients japonais en hémodialyse sans AVC au départ, la présence de microhémorragies cérébrales était un facteur prédictif indépendant d'hémorragie intracérébrale au cours d'une période de suivi de 5- ans [9].

Nous rapportons ici les résultats d'études chez la souris et chez les patients atteints d'IRC. Nous avons trouvé une augmentation des microhémorragies cérébrales chez les souris CKD et décrivons la jonction serrée endothéliale altérée et la perturbation du cytosquelette d'actine comme des mécanismes potentiels de formation de microhémorragies dans le milieu CKD. L'analyse rétrospective d'IRM cérébrales en série de sujets non CKD, pré-dialyse et hémodialyse chronique a confirmé l'IRT comme un facteur de risque important pour la progression de la charge de microhémorragies.

Méthodes

Expériences sur les souris

Animaux expérimentaux et groupes de traitement

Deux modèles de souris CKD ont été étudiés. (1) Modèle de néphrite tubulo-interstitielle à adénine : des souris mâles C57BL/6J des Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) âgées de 1 0 à 12 semaines ont reçu un régime contenant 0,2 % d'adénine pendant 18 jours pour induire une néphropathie interstitielle chronique, placées retour à la nourriture régulière pendant 2 semaines, puis réexposé au régime d'adénine pendant 1 semaine pour maintenir l'IRC (Fig. 1a). Les souris témoins ont été maintenues sous alimentation régulière. (2) Modèle de néphrectomie 5/6 : Des souris mâles C57BL/6J âgées de 10 semaines ont subi une chirurgie en deux étapes aux Jackson Laboratories qui impliquait une néphrectomie partielle gauche suivie d'une néphrectomie totale droite 1 semaine plus tard. Les animaux ont été livrés au laboratoire 1 semaine après la

deuxième chirurgie. Ces deux modèles ont été utilisés pour déterminer l'effet de l'hypertension ; l'hypertension est une caractéristique du modèle de néphrectomie 5/6, alors que l'adénine-IRC est non hypertensive [24].

Les animaux CKD ont été randomisés pour ne recevoir aucune injection de lipopolysaccharide (LPS) ou de LPS. (Dans des études pilotes, nous avons déterminé qu'une plus longue durée d'urémie était nécessaire pour détecter un fardeau plus élevé de microhémorragies spontanées chez les animaux CKD non traités ; souris sous régime d'adénine pendant seulement 10 jours au-delà des 18 jours initiaux l'exposition a eu 3,0 ± 0,4 microhémorragies par cm2.)

Cinq semaines après l'induction initiale de l'IRC et à un âge équivalent chez les témoins, les souris ont reçu des injections intrapéritonéales (ip) de LPS (Salmonella enterica sérotype Typhimurium, L{{0}}MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) pour induire des microhémorragies cérébrales. Le LPS a été administré en trois doses, 1 mg/kg à 0, 6 et 24 h [25]. Les souris traitées au LPS ont reçu une hydratation avec des injections salines sous-cutanées deux à trois fois par jour pendant 3 jours après le traitement au LPS. La pression artérielle (BP) a été mesurée 2 jours avant les injections de LPS par pléthysmographie à manchette de queue (multicanal CODA-S2, Kent Scientific). Toutes les expériences ont été approuvées par l'Université de Californie, Irvine Institutional Animal Care, and Use Committee.

Récolte de tissus et chimie du sang

Les souris ont été euthanasiées 1 semaine après les injections de LPS ou à un âge équivalent chez les animaux non traités par exsanguination par ponction cardiaque sous anesthésie à l'isoflurane inhalé. Une aiguille de jauge 26- a été utilisée comme canule et insérée dans le ventricule gauche, et une solution de PBS glacée a été appliquée à un débit de 7 à 8 ml/min. Après

perfusion pendant 5 min, l'hémisphère gauche du cerveau a été congelé pour le Western blot. L'hémisphère droit du cerveau et les deux reins ont été fixés pendant une nuit dans du paraformaldéhyde à 4 %, puis stockés dans du PBS froid avant la coupe. Le sérum a été aliquoté pour les analyses chimiques du sang. L'azote uréique du sang (BUN) a été mesuré à l'aide du kit colorimétrique de BioAssay Systems (Hayward, CA). La créatinine sérique a été mesurée par électrophorèse capillaire au O'Brien Kidney Research Core Center (UT Southwestern, Dallas, TX).

Détection des microhémorragies

Les cerveaux ont été montés dans de l'agarose à 1,5 % et sectionnés avec un vibratome pour générer des coupes coronales (40 μm). Une section sur 5 a été prélevée pour une coloration au bleu de Prusse afin de détecter les microhémorragies [26]. La coloration au bleu de Prusse a été réalisée en utilisant du trihydrate d'hexacyanoferrate de potassium à 5 % fraîchement préparé et de l'acide chlorhydrique à 10 %. Vingt minutes plus tard, les coupes ont été rincées à l'eau et contre-colorées avec du rouge nucléaire rapide, déshydratées et recouvertes d'une lamelle. Les microhémorragies ont été identifiées au grossissement × 20 sous forme de dépôts bleu violet comptés par trois injections à 0, 6 et 24 h. Une hydratation saline sous-cutanée a été administrée pendant 3 jours après les injections de LPS. La pression artérielle (BP) de la queue a été mesurée avant les injections de LPS. Les souris ont été sacrifiées 1 semaine après les injections de LPS. b Sections de rein colorées H&E représentatives démontrant une lésion tubulo-interstitielle induite par l'adénine chez les souris CKD (panneau de droite) par rapport au rein normal d'un animal CTL (panneau de gauche), grossissement × 20. Barre d'échelle=100 μm

observateurs indépendants, puis la moyenne a été calculée. Les images des sections colorées positivement observées ont été capturées à l'aide d'un photomicroscope (Nikon Eclipse, Japon) pour trois animaux par groupe afin de calculer la zone de microhémorragie. Des images de diapositives entières ont été numérisées et le logiciel gratuit ImageJ (version 10.2) des National Institutes of Health (www.imagej.nih.gov/ij/) a été utilisé pour

calculer la surface totale du cerveau. Le nombre de microhémorragies a été normalisé à la surface totale du cerveau par animal.

Western blot

Les hémisphères cérébraux pour l'analyse des protéines ont été congelés au moment de la collecte des tissus et homogénéisés dans du réactif d'extraction de tissus glacé I (Thermo Fisher Scientific) complété par un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Les concentrations de protéines ont été mesurées avec un kit de dosage de protéines BCA (Thermo Fisher Scientific). L'électrophorèse sur gel SDS-PAGE a été réalisée avec 100 ug de protéine par échantillon. Les protéines ont été transférées sur des membranes PVDF puis bloquées pendant

1 h dans du lait écrémé en poudre écrémé à 5 % préparé dans un tampon TBS-T (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM et Tween 0,1 %-20) ​​et incubé avec des anticorps primaires ciblant la claudine -5 (dilué 1:200, Sigma-Aldrich SAB4502981), occludine (dilué 1:200, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific), et normalisé au contrôle interne GAPDH (dilué 1:10,000, Abcam, Cambridge, MA) dans du lait écrémé à 5 % TBS-T pendant une nuit à 4 degrés. Les blots ont ensuite été incubés avec les anticorps secondaires respectifs anti-lapin ou anti-souris pendant 2 h à température ambiante. Après lavage avec du TBS-T, les bandes ont été détectées à l'aide du Luminescent Image Analyzer LAS-3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT).

Immunohistochimie

Pour détecter les fuites de la barrière hémato-encéphalique (BBB), les sections ont été incubées avec un anticorps secondaire IgG anti-souris biotinylé à 1: 100 pendant 1 h à température ambiante (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Après lavage avec du PBS, les coupes ont été incubées pendant 30 min avec un complexe avidine-biotine-peroxydase (Vector Laboratories) à une dilution de 1:200. La coloration a été développée en utilisant la 3′,3′-diaminobenzidine (DAB, Vector Laboratories) comme chromogène. Le pourcentage de surface tachée d'IgG a été analysé à l'aide du logiciel ImageJ dans des cerveaux CTL et CKD non LPS. Un seuil de coloration IgG positive a été choisi en évaluant manuellement un animal témoin pour la coloration IgG, et ce seuil a ensuite été maintenu égal pour tous les animaux inclus [27].

Cistanche deserticola prévient les maladies rénales

Expériences de culture cellulaire

Culture de cellules endothéliales cérébrales et traitement sérique

Des cellules bEnd.3 de souris immortalisées ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Le phénotype des cellules endothéliales a été confirmé par immunomarquage pour le facteur von Willebrand.

Les cultures cellulaires ont été incubées dans du milieu de Eagle modifié complet à haute teneur en glucose (DMEM, ATCC 30-2002) contenant du glucose 25 mM additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et de 1 % de pénicilline-streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 degrés dans une atmosphère de 5 % de CO2 et 95 % d'air. Les cellules ont été utilisées au passage 5 pour toutes les expériences. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 5 × 106 sur des inserts Transwell en polyester 12- puits (pores de 0, 4 μm, Costar) et la confluence a été atteinte après 24 à 48 h. Le milieu de culture a ensuite été modifié pour exposer les cellules à différentes concentrations de FBS, de sérum humain normal (HNS) ou de sérum urémique (CKD) de patients dialysés. Les lectures TEER ont été mesurées à l'aide de l'EVOM2 volt/Ohm Meter (World Precision Instruments, Sarasota, FL) à trois endroits par puits pour obtenir une moyenne. Les expériences se sont poursuivies pendant 21 jours et le milieu de culture a été renouvelé tous les 3 à 4 jours. Le NHS et le sérum urémique provenaient d'échantillons précédemment mis en banque obtenus après l'approbation de l'IRB et le consentement éclairé.

Expériences de culture cellulaire d'urée

Pour examiner les effets de l'urée (la toxine retenue la plus abondante dans l'IRC), les cellules bEnd.3 ont été incubées dans du DMEM riche en glucose avec 10 % de FBS seul ou dans un milieu additionné de 42 ou 72 mg/dL (70 ou 120 μm) d'urée ( Sigma-Aldrich). Ces concentrations d'urée se rapprochent des valeurs pré- et post-hémodialyse généralement trouvées chez les patients atteints d'IRT et sont considérées comme cliniquement pertinentes [28]. À la fin d'une période d'incubation de 24-h, la TEER a été mesurée et les cellules ont été récoltées et traitées pour une analyse Western blot. Pour la visualisation du cytosquelette d'actine, les cellules bEnd.3 ont été cultivées sur des lamelles de verre et exposées aux concentrations d'urée ci-dessus pendant 24 h, fixées pendant 10 min dans du formol/PBS réfrigéré à 4 %, puis traitées pour la coloration par immunofluorescence à l'aide d'actistain 488 fluorescent. phalloïdine avec coloration nucléaire DAPI (numéro de catalogue PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Des diapositives en triple ont été réalisées par groupe et trois images ont été imagées par diapositive sur le logiciel ImageJ pour calculer la zone de coloration à la phalloïdine normalisée par rapport à la zone DAPI.

Western blot

Les cellules bEnd.3 des expériences sur l'urée ont été culottées, puis lysées dans le réactif d'extraction tissulaire I (Thermo Fisher Scientific) additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéase (Roche Applied Science). Les concentrations de protéines ont été mesurées avec un kit de dosage de protéines BCA, et le Western blot a été effectué comme décrit ci-dessus avec de la claudine-5 (dilué au 1 : 500) et de l'occludine (dilué au 1 : 500) normalisé au contrôle interne GAPDH (dilué au 1 : 20 ,000). Les Western blots ont été répétés au moins trois fois pour chaque échantillon.

Études humaines

Examen rétrospectif des graphiques d'IRM cérébrale

Les dossiers médicaux électroniques entre le 1er janvier 2008 et le 31 décembre 2014 au centre médical de l'Université de Californie à Irvine ont été examinés à l'aide du système Honest Broker et de l'UCReX (University of California Research Exchange) après l'approbation de l'IRB. Les patients atteints d'IRC avant dialyse (n =8) et les patients en hémodialyse chronique (n =9) qui ont subi au moins deux IRM cérébrales à des moments différents ont été identifiés (sur 10 patients en hémodialyse initialement identifiés, 1 a été retiré de l'analyse finale en raison d'images manquantes dans le système PACS de radiologie). Les témoins avec une fonction rénale normale (n=10) ont été appariés manuellement aux patients IRC sous hémodialyse par sexe et âge ± 5 ans.

Examen de l'IRM pour les microhémorragies cérébrales

Les microhémorragies ont été comptées par un neuroradiologue (DF) traitant et analysées pour leur progression dans le temps. Des IRM cérébrales avec imagerie pondérée en T2* et pondérée en susceptibilité (SWI) et images FLAIR (récupération par inversion atténuée par le liquide) ont été réalisées sur des scanners IRM 1,5T et 3T. L'épaisseur de couche pour les séquences SWI a été réalisée à 2 mm, avec un intervalle intercouche de 0. Les micro-hémorragies ont été comptées sur la base du SWI axial de 2- mm. FLAIR était per-

formé pour détecter les lésions de substance blanche à une épaisseur de tranche de 3 mm, également avec un intervalle intercouche de 0.

Analyses statistiques

Il n'y avait pas de données aberrantes lors de la sélection avec le test de Grubbs (méthode de déviation étudiante extrême, http://graphpad.com/quick calls/grubbs1/). Les différences entre les groupes chez les souris et chez l'homme ont été comparées par des tests du chi carré (exact de Fisher) pour les variables catégorielles et des tests t et ANOVA pour les variables continues. Les données continues sont rapportées sous forme de moyenne ± SEM. Pour les données de souris, nous avons effectué à la fois une ANOVA non paramétrique de Kruskal – Wallis et une ANOVA unidirectionnelle avec des tests Tukey HSD. Une ANOVA à deux facteurs (CKD-oui/non et LPS- oui/non) a été utilisée pour tester l'interaction CKD. Les différences entre les groupes étaient considérées comme significatives si P < 0.05.="" les="" figures="" ont="" été="" générées="" à="" l'aide="" du="" logiciel="" graphpad="" prism="" 4="" (graphpad="" software,="" san="" diego="">

Résultats

Survie avec le traitement LPS

Les souris CKD traitées avec du LPS avaient un taux de survie de 80 %. Seules les souris qui ont survécu jusqu'à 1 semaine après le traitement au LPS ont été

inclus dans les analyses finales. Toutes les souris des autres groupes ont survécu jusqu'à la fin de l'expérience.

CKD Augmentation significative des microhémorragies cérébrales

Fardeau après le traitement LPS

Les animaux atteints d'IRC induite par l'adénine et néphrectomie 5/6 ont montré des valeurs significativement élevées d'azote uréique sanguin (BUN) et de créatinine sérique par rapport aux animaux CTL (tableau 1). La pression artérielle de la queue était significativement plus élevée chez les animaux néphrectomie-CKD par rapport aux animaux CTL et adénine-CKD (tableau 1); cependant, le nombre de microsaignements dans les deux groupes CKD était similaire. La coloration H&E a confirmé les lésions tubulo-interstitielles induites par l'adénine dans les reins des souris CKD (Fig. 1b).

La charge moyenne de microhémorragie cérébrale était de 2,0 ± 0,5 par cm2 chez les souris CTL non LPS et a été augmentée de 2 à 2,5- fois chez les animaux CKD non LPS (adénine- Souris CKD 4,5 ± 0.9 par cm2 ;

néphrectomie-souris CKD 4,2 ± 1,1 par cm2) (Tableau 1; Fig. 2a). Pour les groupes non-LPS, une augmentation des microhémorragies était significative pour l'adénine-CKD par rapport aux CTL mais pas pour la néphrectomie-CKD. Le traitement au LPS a augmenté la formation de microhémorragies au même degré chez les animaux CTL et CKD en