Comment étudier la diversité génétique des Herba Cistanches ?

Etude sur la diversité génétique des Herba Cistanches par RAPD

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Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da

(Institut de la matière médicale chinoise, Académie chinoise de médecine chinoise, Pékin 100700)

Résumé

Objectif:Pour étudier la populationdiversité génétiquedeCistanche désertiqueetCistanche tubulosa.

Méthodes :Deux populations sauvages deCistanche désertiqueet quatre populations sauvages deCistanche tubulosaont été analysés par RAPD, et lesdiversité génétiquedes populations a été analysée par le logiciel version 1.31 de POPGENE.

Résultats:Le pourcentage moyen de locus polymorphes deCistanche désertiqueétait de 47,37 %, les locus polymorphes des deux populations étaient de 39,47 % et 35,53 %, et la diversité génétique moyenne de Nei était de 0.135 8. Shannon's était plus. L'indice d'informations d'état est 0.207 2, et le coefficient de différenciation génétique Gst {{1{{20}}}}.254 6. Le pourcentage moyen de locus polymorphes à Cistanche était de 27,59 %, et le pourcentage de loci polymorphes dans chaque population variait de 19,54 % à 25,29 %, dont la population d'Andier avait les 25,29 % les plus élevés, et la diversité génétique moyenne de Nei était de 0. { {21}}, l'indice d'information sur le polymorphisme de Shannon est de 0,1258, le coefficient de différenciation des gènes Gst =0.175 5.

Conclusion:Cistanche désertiqueetCistanche tubulosaont une certaine différenciation entre les populations. Ladiversité génétiquede Desert Cistanche est significativement plus élevé que celui de Cistanche tubulosa et s'est différencié en deux écotypes.

Mots-clés : Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD ; diversité génétique

[Numéro de classification de la bibliothèque chinoise] S 567 [Code d'identification du document] A [Numéro d'article] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Cistanche est une plante parasite appartenant au genre Cistanche de la famille des Lidanaceae, également connue sous le nom de Dayun, qui est une précieuse matière médicinale chinoise. Les principales plantes sources de Cistanche deserticola dans mon pays sontCistanche désertiqueYCMa et C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Les plantes hôtes du Cistanche deserticola sont Haloxylon ammodendron et Haloxylon ammodendron, qui sont principalement distribuées dans la Ligue d'Alashan en Mongolie intérieure, dans le nord du Xinjiang, au Qinghai, au Gansu et dans d'autres endroits. La répartition de Cistanche deserticola est la même que celle des plantes hôtes. Dans mon pays, Cistanche cistanche n'est distribué que dans les comtés autour du désert de Taklimakan au sud des monts Tianshan au Xinjiang, et sa distribution n'est pas complètement synchronisée avec l'hôte Tamarix. D'autres régions telles que le nord du Xinjiang, le Gansu, le Qinghai, le Ningxia, la Mongolie intérieure, le Shaanxi et d'autres lieux de plantes Tamarix ne sont pas des parasites Cistanche Tubula [2]. En raison de l'augmentation rapide de la demande de Cistanche ces dernières années, entraînant l'extinction de ses ressources, les ressources de cistanche sauvage se sont réduites à quelques zones de production principales. Les deux ont été répertoriées comme espèces végétales protégées en voie de disparition dans mon pays [3], parmi lesquellesCistanche désertiquea été inscrite à l'Annexe II de la CITES [4].

Après plusieurs années de recherche, la recherche sur l'élevage artificiel de Cistanche a été couronnée de succès, et elle est au stade de la promotion et de la plantation à grande échelle. Cependant, comment prévenir le déclin des espèces de Cistanche pendant la production industrielle, comment restaurer la population sauvage limitée dès que possible et préserver les précieuses ressources de germoplasme sauvage, sont les clés pour parvenir à son utilisation durable. En ce qui concerne le patrimoine protégé de Cistanche [Date de réception], 2004-03-11 [Projet de fonds] Ministère de la science et de la technologie Projet d'aide sociale (2001.109) ; Ministère de la Science et de la Technologie "Tenth Five-Year Plan" Project (2001BA701A09a) [Auteur correspondant] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net L'étude de la transmission est encore Vide. Cette étude utilise la technologie RAPD pour étudier 2 populations sauvages deCistanche désertiqueet 4 populations sauvages deCistanche tubulosa, et analyser à la fois la différence dediversité génétiquedevrait fournir une importante base génétique expérimentale pour la protection du Cistanche, un précieux médicament chinois.

cistanche

1. Matériel et méthodes

1.1 Matériaux

Cistanche désertiquea été collecté dans le comté de Jimsar au Xinjiang et dans la région de Jilantai de l'ancienne Ligue Alxa en Mongolie intérieure. Des populations de Cistanche ont été collectées dans les comtés de Minfeng et de Yutian, Xinjiang. Le comté de Minfeng est actuellement la zone avec le plus grand rendement de Cistanche cistanche, avec la plus forte densité et des communautés relativement complètes de forêts naturelles. Les points d'échantillonnage Andil, Sawuzek, Yatongguz et Daheyan du comté de Yutian sont les principales zones de production, qui sont situées dans la rivière Andir, la rivière Yeyike, la rivière Yatongguzi et Kelaniya Dans le cours inférieur de la rivière, la distance entre les populations est supérieure à 50 kilomètres. Chaque population a échantillonné au hasard 19-30 individus. Les échantillons ont été rapidement séchés dans du gel de silice et utilisés pour l'extraction d'ADN (tableau 1).

Tableau 1 Populations d'échantillonnage et zones de production de Cistanche deserticola et Cistanche tubulosa

1.2 Extraction d'ADN

La méthode d'extraction de l'ADN total utilise une méthode à haute teneur en sel et à faible pH [5]. L'échantillon d'ADN a été soumis à un spectrophotomètre pour détecter la concentration de matrice d'ADN, puis une électrophorèse sur gel d'agarose à 1%, une coloration EB, une observation et une photographie sous lumière ultraviolette, une électrophorèse d'ADN avec des bandes claires et moins de queue ont été utilisées pour l'analyse RAPD.

1.3 Criblage des amorces RAPD

Étant donné que l'expérience a révélé que la même amorce a un effet insatisfaisant sur l'amplification simultanée des deuxCistanche désertiqueet Cistanche tubulosa, les amorces ont été criblées indépendamment. 150 amorces aléatoires (10 pb), 25 μL de système de réaction de Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. ont été utilisés pour l'amplification et le criblage ; chaque amorce a utilisé 2 modèles de population et 1 eau bidistillée stérilisée comme témoin à blanc, et a obtenu 10 amorces pour l'amplification de Cistanche deserticola avec des bandes claires, un fort polymorphisme et une bonne répétabilité : S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }} ; 10 amorces deCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 Amplification par PCR et détection du produit

Les amorces sélectionnées ont été utilisées pour amplifier l'ADN matrice deCistanche désertiqueetCistanche tubulosapar PCR. L'ADN génomique a été dilué à 50 ng·μL -1 selon la concentration mesurée comme matrice. Le volume de réaction total est de 25 μL, dont 10 × tampon PCR 2,5 μL, Mg2 plus 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, mélange dNTP (chacun 2,5 mM) 1 μL, amorce 5 μM 1 μL, ADN matrice 1 μL, eau bidistillée stérilisée 18,8 μL, la solution d'amplification PCR ci-dessus est le produit de Shanghai Sangon. L'amplification a été réalisée sur un thermocycleur PTC-100. Le programme d'amplification était une pré-dénaturation à 94 degrés pendant 5 min puis 40 cycles. Chaque cycle comprenait 94 degrés 45 s, 34 degrés 1 min, 72 degrés 1 min 30 s, et enfin Prolonger à 72 degrés pendant 5 min. Les produits amplifiés ont été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 2,0 % (contenant de l'EB) dans un tampon 1 x TAE et observés et photographiés sous le système d'imagerie sur gel SYNGENE.

1.5 Statistiques et analyse des données

Dans le spectre d'électrophorèse, la position correspondante du produit de réaction sur le gel est comparée selon l'étalon de poids moléculaire, et le poids moléculaire du produit amplifié est estimé. La bande avec la bande est enregistrée comme 1, et la bande sans bande est enregistrée comme 0, formant un graphique matriciel 0/1 et entrant dans l'ordinateur, en utilisant POPGENE32 pour calculer le pourcentage de sites polymorphes (PPL) de chaque population, l'indice de diversité génétique de Nei (H), l'indice d'information sur le polymorphisme de Shannon (I), le coefficient de différenciation génétique (Gst), la diversité génétique (Ht),Diversité génétique(Hs), l'identité génétique (I) et la distance génétique (D) de Nei (1978) au sein d'une population, et l'analyse par grappes a été effectuée à l'aide de la méthode UPGMA.

2. Résultats et analyse

2.1 Diversité génétique de Cistanche

Tous les échantillons ont obtenu des bandes avec un poids moléculaire allant de 200 à 2 200 bp (Figure 1, 2). Au total, 76 locus ont été détectés dans 60 échantillons provenant de 2 populations deCistanche désertique, dont 36 étaient des locus polymorphes, représentant 47,37 %, H=0.135 8, I=0.207 2. Parmi eux, le PPL de Jimsar est de 39,47 % et celui de Gilanty est de 35,53 %. H est 0. 0 95 3 et 0.1 070 respectivement, et I est 0.15 12 et 0.163 7 respectivement. Un total de 87 locus ont été détectés chez {{20}} individus de 4 populations de Cistanche, dont 24 étaient des locus polymorphes, représentant 27,59 %, H=0.084 8, Je=0.1278. Le PPL le plus élevé était Andil à 25,29 % , tandis que le PPL était inférieur à Savuzek et Yatungusi (tous deux à 19,54 % ). H est 0.062 1 -0.080 0, I est 0.095 0 -0.116. La taille de H et I est cohérente avec la tendance de la taille du PPL de chaque population, et les coefficients sont les plus élevés à Andier, suivi de Dayan. Dans le cas du même PPL, le H=0 de Savuzek.{{40}} La somme I=0.097 0 est légèrement supérieure à 0.{{44 }} et 0.095 0 de Yatunguska (tableau 2).

Figure 1 Bandes amplifiées RAPD de certains échantillons de désertCistanche désertique, amorce S490 1-10. Échantillons de garantie ; 11-20. Jimpster échantillonne le marqueur d'ADN-M (200 - 2 000 bp)

Figure 2 Bandes amplifiées RAPD de certains échantillons de Cistanche Tubulosa, amorce S2 042 1-20. Xinjiang Andier échantillon M-DNA Marker (200 - 2 000 bp)

Tableau 2 Lediversité génétiquedeCistanche désertiqueetCistanche tubulosapopulations

2.2 Analyse de la variation génétique de Cistanche

Selon le niveau dediversité génétiquedans les populations (Hs), la différenciation entre les populations (Dst) et la proportion de différences génétiques entre les populations dans les différences génétiques totales (Gst), on peut voir que la diversité génétique totale de Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, où Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, dont Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (tableau 3). Les résultats ci-dessus indiquent qu'il existe un certain degré de variation génétique entre les populations. La variation entre les populations du désert de Cistanche deserticola représentait 25,46 % de la variation totale, et la variation des populations de Cistanche tubulosa représentait 17,55 % de la variation totale.

Tableau 3 Analyse de la variation génétique deCistanche désertiqueetCistanche tubuleuse.

2.3 Distance génétique et analyse des grappes parmi les populations de Cistanche deserticola

La distance génétique des deux populations deCistanche désertiqueest {{0}}.080 0, et l'identité génétique est 0.9231. La distance génétique des quatre populations de Cistanche était de 0.012 0-0.031 5, et l'identité génétique était de 0.9690-0.988 1 (Tableau 4) . Le regroupement des individus de Cistanche deserticola et de Cistanche tubulosa montre que le Cistanche deserticola peut être regroupé en deux groupes distincts selon la population, tandis que les différents individus de Cistanche tubulosa ne peuvent pas être regroupés par population, ce qui indique également que la différenciation génétique entre Cistanche deserticola population est relativement élevée. Grand, mais la différenciation génétique entre les populations de Cistanche tubulosa est faible.

Tableau 4 Identité génétique (en bas à gauche) et distance génétique (en haut à droite) decistanche tubulosa.

3. Débat

3.1 Diversité génétique de Cistanche

Le niveau dediversité génétiquedes plantes est indissociable de leurs caractéristiques biologiques, de leurs habitats, de leur origine et de leur évolution. Parmi eux, le système de reproduction, l'aire de répartition, la forme de vie et les méthodes de dispersion du pollen et des graines ont la plus grande influence [6]. Selon les résultats statistiques des données allozymes de 499 espèces végétales dans 165 genres par Ge Song et al. [7], le polymorphisme de Cistanche au niveau de l'espèce devrait être d'environ 50 pour cent, et le polymorphisme au niveau de la population devrait être d'environ 40 pour cent. Autour de 0,17. Les niveaux de polymorphisme obtenus dans cette expérience sont tous inférieurs à ces valeurs moyennes. Dans le même temps, par rapport aux niveaux de loci polymorphes obtenus par les méthodes RAPD pour plusieurs plantes communes en voie de disparition, telles que 32 % des espèces en voie de disparition Silver Fir [18], 22,5 % de la pivoine naine et 27,6 % de la pivoine pourpre. [9] ] On constate que la diversité génétique desCistanche désertique est légèrement inférieur au niveau moyen, alors que la diversité génétique de Cistanche tubulosa est déjà extrêmement faible.

3.2 Raisons de la faible diversité génétique de Cistanche

Cistanche est une plante parasite spécifique, distribuée dans les zones désertiques étroites en même temps. Par conséquent, le style de vie unique et la zone de vie relativement étroite peuvent être la raison inhérente pour laquelle lediversité génétiquede Cistanche est généralement inférieur à celui des plantes ordinaires.

La différence dansdiversité génétiqueentre Cistanche deserticola et Cistanche tubulosa peut être liée à la différence dans l'aire de répartition des deux et si elles sont synchronisées avec la répartition des hôtes. L'aire de répartition de Cistanche tubulosa est nettement plus petite que celle de Cistanche deserticola et sa répartition est extrêmement décalée par rapport à la plante hôte. Des études ont montré qu'il existe une grande diversité parmi les espèces de Tamarix. Par exemple, Zhang Juan et al. ont rapporté que la diversité génétique de Tamarix sibiricus était aussi élevée que 98,7 pour cent [10], tandis que la diversité génétique de Cistanche est extrêmement pauvre, indiquant l'évolution à long terme. Cistanche tubulosa peut avoir connu de graves goulots d'étranglement dans l'histoire, entraînant la perte d'une grande quantité dediversité génétique.

Dans le même temps, selon les enquêtes, il a été constaté qu'aucun desCistanche désertiqueà moins de 20 km des établissements humains pourraient être déterrés et fleuris normalement. Les grandes et petites fosses du Cistanche ont été creusées, en particulier dans les principales zones de production de la fleur tubulaire du Cistanche. Par conséquent, il a été causé par une grande quantité d'excavation. Le manque de provenance et la destruction de l'habitat peuvent être les principales raisons anthropiques de la faiblediversité génétiquede Cistanche.

3.3 Différenciation génétique de Cistanche

En raison de la distance géographique entre le Xinjiang et la Mongolie intérieure, l'isolement géographique a provoqué la différenciation et l'isolement entre lesCistanche désertiquepopulations, et les deux populations ont formé différents écotypes génétiquement différents en raison de leur adaptation aux conditions locales de l'habitat. En raison de son aire de répartition étroite et des échanges de gènes fréquents entre les populations, la différenciation génétique entre les populations est inférieure à celle de Cistanche deserticola.

3.4 Recommandations pour la protection du Cistanche

Diversité génétiqueest la condition préalable à la survie à long terme des espèces pour éviter l'extinction. La réduction dediversité génétiqueréduira la capacité des populations à s'adapter aux changements environnementaux à court et à long terme [11]. Par conséquent, protéger la diversité génétique de Cistanche est très important pour protéger cette médecine chinoise rare et précieuse. Le Cistanche étant une espèce avec un type écologique particulier, il convient de le protéger principalement in situ, et la base de protection naturelle du Cistanche doit être établie en fonction de sa diversité génétique. Par exemple, pourCistanche tubulosa, parce que la diversité génétique provient principalement de l'intérieur de la population, les populations à grande diversité génétique seront les objets de protection prioritaires [12], comme l'Angier de Minfeng et le Daheyan de Yutian peuvent l'être Il est répertorié comme base de protection naturelle pour Cistanche. En ce qui concerne laCistanche désertique, les populations de la Mongolie intérieure et du Xinjiang ont subi des changements importants, de sorte que la recherche expérimentale devrait être encore renforcée pour déterminer les populations prioritaires pour la protection. En même temps, effectuer des recherches fondamentales sur la biologie de la reproduction et l'écologie de la pollinisation de Cistanche afin de fournir des informations pour sa protection ultérieure.

Références

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. Identification deCistancheet enquête sur les matières médicinales commerciales. Matériaux médicinaux chinois, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Mingting. Recherche approfondie et application générale des plantes Tamarix. Lanzhou: Presse universitaire de Lanzhou, 1995.

[3] Fu Guoli. Livre rouge des plantes chinoises. Pékin : Presse scientifique, 1992.

[4] Le Bureau de gestion de l'importation et de l'exportation des espèces menacées de la République populaire de Chine, le Comité scientifique des espèces menacées de la République populaire de Chine. Convention sur le commerce international des espèces de faune et de plantes sauvages menacées d'extinction (CITES), Annexe II. 2003.41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, et al. Extraction et identification de l'ADN total de plusieurs plantes menacées et de leurs parents. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Système de sélection végétale, structure génétique et protection desdiversité génétique. Biodiversité, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Biologie évolutive des plantes. Wuhan : presse universitaire de Wuhan, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et al. Analyse RAPD de la diversité génétique du sapin argenté. Science chinoise (C), 1997, 40(2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, et al. Un rapport préliminaire sur l'analyse RAPD de la pivoine naine et de la pivoine pourpre. Journal chinois de taxonomie végétale, 1995, 33(4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Une étude préliminaire surDiversité génétiquedes Populations Naturelles de Tamarix lancéolé. Recherche botanique du Yunnan, 2003, 25(5):557.

[11] Ellstrand NC, Elam DR. Conséquences génétiques des populations de la petite taille de la population : Implications pour la conservation des plantes. Revue annuelle Ecologie et Systématique, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Le principe de la génétique des populations et son application à la protection des plantes rares et menacées. Biodiversité, 1999, 7(4): 340.

Tiré de : China Journal of Chinese Materia Medica ; Vol. 29, numéro 8 août 2004