Composants flavonoïdes actifs et mécanismes potentiels des parties aériennes de Glycyrrhiza Uralensis pour la prostatite chronique sur la base de la pharmacologie de réseau et de la validation expérimentale

Abstrait:

Objectif : Déterminer les principes actifs et les mécanismes d'action possibles des flavonoïdes des parties aériennes du Cistanche dans la prostatite chronique. Méthodes : Chromatographie liquide ultra-performante – quadripôle – champ électrostatique La spectrométrie de masse à haute résolution Orbitrap (UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS) a été utilisée pour identifier les principaux constituants flavonoïdes de l'extrait alcoolique des parties aériennes du Cistanche. La pharmacologie de réseau et l'amarrage moléculaire ont été utilisés pour prédire les composants essentiels et les cibles clés liées à la prostatite chronique. Un modèle de prostatite chronique chez le rat a été induit par la carraghénane et des modifications histopathologiques dans la prostate du rat ont été observées par coloration à l'HE. Les taux sériques de DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA et TNF- ont été mesurés par ELISA pour évaluer l'efficacité thérapeutique de l'extrait. Résultats : Au total, 44 flavonoïdes ont été identifiés dans l'extrait alcoolique. La pharmacologie en réseau a indiqué que les composants essentiels, notamment la glycyrrhizine, les isoflavones trichothécènes, la manzanita florifera épineuse et la glycyrrhizine (prévues comme constituants représentatifs), exercent des effets anti-prostatite chronique en agissant sur des cibles clés telles que AKT1, TNF, VEGFA, EGFR et MMP9, régulant ainsi les voies de signalisation associées. L'amarrage moléculaire a montré des affinités de liaison favorables entre les composants principaux et les cibles clés. Des expériences sur des animaux ont démontré que l'extrait alcoolique des parties aériennes du Cistanche produisait un effet thérapeutique évident sur la prostatite chronique chez le rat. Conclusion : L'efficacité anti-prostatite chronique des parties aériennes du Cistanche est validée. Les composants actifs, notamment l'aristolochicine épineuse, les isoflavones de trichostatine et la glycyrrhizine, peuvent agir via la voie de signalisation PI3K – AKT pour moduler l'EGFR, l'AKT1 et la MMP9.

Mots-clés : parties aériennes de Cistanche; prostatite chronique; flavonoïde; UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS ; pharmacologie de réseau

 

 

avantages de la cistanche pour la santé de la prostate

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Introduction:

L'herbe médicinale traditionnelle chinoise Cistanche (Cistanche spp.) comprend la matière médicinale séchée principalement utilisée en MTC. Il s'agit d'une ressource médicinale importante en Chine, avec des fonctions telles que tonifier et soutenir les fonctions corporelles, éliminer la chaleur et détoxifier, soulager la douleur et harmoniser les formules, et elle est couramment utilisée comme composant complémentaire dans de nombreuses prescriptions multi-herbes. La demande du marché est élevée tant au niveau national qu’international. Les parties aériennes, y compris les tiges et les feuilles, sont des ressources abondantes qui attendent d'être développées et utilisées.

La prostatite chronique est une maladie urologique courante chez les hommes jeunes et d'âge moyen. Les symptômes cliniques comprennent des douleurs abdominales basses ou pelviennes, une dysurie et une fréquence urinaire. Sans traitement rapide, cela peut entraîner des dysfonctionnements sexuels tels que l'éjaculation précoce et la dysfonction érectile, affectant gravement la santé physique et mentale des hommes.

Les flavonoïdes sont abondants dans les parties aériennes du Cistanche et présentent des activités anti-inflammatoires et antitumorales notables. Des études antérieures ont indiqué que les parties aériennes sont riches en flavonoïdes ayant des effets antitumoraux et anti-inflammatoires. L'enrichissement en flavonoïdes des parties aériennes a démontré une bonne activité antioxydante in vitro. Des recherches pharmacodynamiques ont également montré que les flavonoïdes des parties aériennes avaient des effets préventifs et thérapeutiques sur la prostatite chronique.

Dans cette étude, UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS a été utilisé pour profiler les flavonoïdes dans l'extrait alcoolique des parties aériennes de Cistanche. La pharmacologie en réseau a été appliquée pour prédire les cibles et les voies clés de la prostatite chronique, l'amarrage moléculaire a été utilisé pour déduire les mécanismes et des expérimentations animales ont été menées pour valider l'activité anti-prostatite chronique, fournissant ainsi une référence pour le développement ultérieur de médicaments et leur application clinique.

Matériels

 

Animaux

Rats SD mâles de qualité SPF (n=24), âgés de 6 à 7 semaines, poids corporel de 230 à 250 g [Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd. ; licence de production : SCXK (Jing) 2019-0010]. Les animaux ont été hébergés dans l'animalerie SPF du Centre animalier expérimental de l'Université de médecine chinoise de Pékin. Le protocole a été approuvé par le comité d'éthique institutionnel (numéro d'approbation : BUCM-2023110204-4271).

 

Instruments

 

Système Ultimate 3000 UPLC (Dionex, États-Unis)

Spectromètre de masse haute résolution Thermo Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific, États-Unis)

Nettoyeur à ultrasons numérique KH500DE (Kunshan Hechuang)

Balance électronique FA2004N (Pékin Sartorius)

Centrifugeuse réfrigérée à basse vitesse H1650 (Changsha Xiangyi)

RE-5023 évaporateur rotatif (Shanghai Yarong)

Ballon chauffant à température contrôlée électronique (Tianjin Teste)

Lecteur de microplaques Multiskan MK3 (Thermo Scientific, Shanghai)

Microscope biologique inversé à fluorescence B032 (Nikon Instruments, Shanghai)

Spectrophotomètre UV N5000 (Shanghai Youke)

Réactifs

Les parties aériennes de Cistanche (tiges, feuilles et une petite quantité de gousses) ont été récoltées en septembre 2019 dans le comté de Guazhou, ville de Jiuquan, province du Gansu, et authentifiées par le professeur Wang Wenquan (Institut de développement des plantes médicinales, CAMS) comme étant Cistanche spp.

Autres réactifs : Ulatan (Shandong Keyuan Biochemical Co., lot C15887472) ; carraghénane (Beijing Solarbio, lot 20220601) ; Comprimés Qianliekang Pule'an (Zhejiang Conba Pharmaceutical); carboxyméthylcellulose de sodium (CMC-Na ; Shanghai YuanYe, lot S14016) ; Kits ELISA pour rat DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA et TNF- (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology) ; Lecteur de microplaques Multiskan MK3 (Thermo Scientific) ; fixateur de tissus (Guangzhou Shuopu, lot 23257838) ; éthanol (Beijing Chemical Works, qualité analytique); méthanol, acide formique, acétonitrile (Fisher Scientific, qualité MS) ; eau (Groupe Wahaha). Étalons de référence (pureté > 98%, Shanghai YuanYe) : liquiritigénine, puerarine, isoorientine II, naringénine, isoquercitrine, isoliquiritine, ononine, isoquercitrine, quercétine, astragaline, kaempférol, formononétine.

Méthodes et résultats

 

2.1 Profilage chimique de l'extrait alcoolique des parties aériennes de Cistanche

2.1.1 Préparation des échantillons

Des quantités appropriées de parties aériennes ont été extraites avec de l'éthanol à 70 %. L'extrait a été concentré à sec. Le résidu a été dissous par ultrasons dans l'eau pendant 20 min, centrifugé à 3 000 tr/min-1 pendant 15 min et le surnageant a été concentré à sec. Une quantité appropriée de l'échantillon séché a été placée dans une fiole jaugée de 5 ml et portée au volume avec du méthanol pour obtenir la solution d'essai.

 

2.1.2 Conditions chromatographiques et spectrométriques de masse

 

Conditions UPLC : colonne ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm) ; phase mobile A, acétonitrile ; phase mobile B, 0,5 % d'acide formique dans l'eau ; élution par gradient (0 à 20 min, 5 à 20 % de A ; 20 à 70 min, 20 à 30 % de A) ; débit 0,2 mL·min−1 ; volume d'injection 2 µL ; température de la colonne 30 degrés.

Conditions MS : source HESI ; modes d'ions positifs et négatifs ; acquisition par balayage complet ; tension de pulvérisation +3.2 kV (positif) et −3,0 kV (négatif) ; température capillaire 320 degrés ; gaz de gaine 40 arb ; gaz auxiliaire 15 arb; chauffage d'appoint 350 degrés ; Résolution MS 70 000 ; Résolution MS/MS 17 500 ; plage de balayage m/z 100-1500.

Liste des spécifications Cistanche

2.1.3 Identification des composants

L’échantillon de partie aérienne a été analysé par UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS pour obtenir des TIC (Figure 1). Les données ont été traitées avec Thermo Xcalibur et comparées aux bibliothèques de composants et à la littérature, identifiant 44 flavonoïdes au total (Tableau 1).

 

2.2 Pharmacologie de réseau

Les constituants identifiés ont été importés dans la base de données TCMSP 2.3 (//tcmspw.com/tcmsp.php). Sur la base d'une biodisponibilité orale (OB) supérieure ou égale à 30,00 % et d'une similarité médicamenteuse (DL) supérieure ou égale à 0,18, 19 composants actifs ont été sélectionnés. Les cibles prévues des composants actifs et les cibles de la maladie pour la prostatite chronique ont été recoupées, donnant lieu à 88 cibles communes. STRING 11.0 (http://string-db.org) a été utilisé pour construire le réseau PPI. Les cibles principales classées par degré comprenaient AKT1, TNF, VEGFA, EGFR, SRC, ESR1, PTGS2, MMP9, BCL2L1 et MMP2. L'enrichissement GO et KEGG (DAVID 6.8, http://david.ncifcrf.gov) a indiqué des processus biologiques tels qu'une régulation positive de la protéine kinase B, une régulation négative de l'apoptose et une régulation positive de l'activité MAPK ; des composants cellulaires comprenant une région extracellulaire, des complexes macromoléculaires et des complexes récepteurs ; fonctions moléculaires, notamment les activités de tyrosine kinase, de sérine kinase et de thréonine kinase. Les voies KEGG ont été enrichies en voies du cancer, de la signalisation PI3K – AKT, du cancer de la prostate et de la résistance aux inhibiteurs de la tyrosine kinase de l'EGFR. Cytoscape 3.7.1 a été utilisé pour construire le réseau « composant actif – cible principale – voie » (Figure 2). Les 10 principaux composants par degré étaient la liquiritigénine, la spinacétine (flavone représentative), l'isovitexine, le chrysoériol, la santine, le kaempférol, le schaftoside, la lutéoline, l'ononine et la formononétine.

L'amarrage moléculaire a été effectué par paires entre les 10 composants principaux et les cibles clés de l'analyse PPI. Les structures moléculaires des composants principaux ont été téléchargées à partir de TCMSP 2.3 (format mol2) et les structures 3D des cibles clés ont été obtenues à partir du PDB (//www.rscb.org/) au format pdb. Autodock a été utilisé pour l’amarrage de chaque paire ligand-protéine. Les énergies de liaison < −20,92 kJ·mol−1 indiquaient une liaison favorable ; plus l'énergie est faible, meilleure est l'affinité. Les paires cible-ligand les plus performantes sont répertoriées dans le tableau 2. Des complexes d'amarrage représentatifs avec cinq cibles ont été visualisés dans PyMol (Figure 3).

 

2.3 Validation in vivo

Un modèle de prostatite chronique chez le rat a été établi à l'aide de carraghénane. La coloration HE a révélé des lésions histopathologiques caractéristiques de la prostatite chronique chez les animaux modèles, tandis que le traitement avec l'extrait alcoolique des parties aériennes de Cistanche a amélioré l'architecture glandulaire et réduit l'infiltration inflammatoire. ELISA a montré que, par rapport au groupe modèle, les groupes de traitement présentaient une régulation de la DHT, de l'IFN-, des IgG, du IL-6, du PSA et du TNF- sériques vers des niveaux normaux, indiquant une efficacité thérapeutique.

Discussion
Une analyse complète intégrant le profilage haute résolution basé sur la MS, la pharmacologie de réseau, l'amarrage moléculaire et la validation animale confirme que les flavonoïdes des parties aériennes de Cistanche exercent des effets anti-prostatite chronique. Les mécanismes putatifs impliquent la modulation de PI3K – AKT et des voies associées à l'inflammation et à la prolifération ainsi que des cibles clés telles que EGFR, AKT1 et MMP9. Les résultats fournissent une base scientifique pour le développement et l'application clinique des préparations de flavonoïdes à partie aérienne de Cistanche dans la gestion de la prostatite chronique.

Conclusion
Les flavonoïdes des parties aériennes de Cistanche démontrent un potentiel thérapeutique contre la prostatite chronique, probablement via la régulation de la voie PI3K – AKT et l'interaction avec l'EGFR, l'AKT1 et la MMP9. L'intégration du profilage chimique, de la pharmacologie des réseaux, de l'amarrage moléculaire et des expérimentations animales corrobore leur efficacité et élucide des mécanismes plausibles.