Cistanche Deserticola améliore les lésions des cellules nerveuses de l'hippocampe chez les rats de la maladie de Parkinson en régulant la voie antioxydante Keap1 / Nrf2 / Ho -1

Abstrait:

 

Objectif d'explorer l'effet deCistanche Deserticola sur les lésions des cellules nerveuses dans la maladie de Parkinson (PD)les rats et son mécanisme connexe. MÉTHODES Les rats mâles de Sprague-Dawley (SD) ont été divisés au hasard en trois groupes (1 0} dans chaque groupe): groupe témoin, groupe modèle et groupe Cistanche. Les rats du groupe modèle et du groupe de traitement ont été injectés intracranialement avec 6- hydroxydopamine (6- ohda). Des rats du groupe Cistanche ont reçu 0,216 g / ml de solution de Cistanche, les rats en groupe vierge et en groupe modèle ont reçu une irrigation saline normale, la quantité d'irrigation était de 1 ml / (100 g · d) pendant deux semaines. La morphologie et l'ultrasine des cellules nerveuses dans l'électron de l'hématoxyline et de la transmission électron-microscopie. La morphologie des corps de Nishi dans la région de l'hémimani a été observée par la coloration de Nishi. Les niveaux de malondialdéhyde (MDA) et de superoxyde dismutase (SOD) ont été détectés par la méthode de l'acide thiobarbiturique et la méthode du tétrazolium nitroblue. Les changements de la protéine 1 liés à l'ECH de plancher (Keap 1), le facteur nucléaire E 2- Facteur 2 (NRF 2) et les protéines de l'hème cyclooxygénase 1 (HO -1) ont été analysés par Western blot. Résultats Après le traitement du médicament de Cistanche Deserticola, la structure tissulaire hippocampique des rats PD a été améliorée, la morphologie des neurones a été améliorée, la pyretosis nucléaire a été soulagée, le contenu de l'antioxydante enzymatique SOD dans l'hippocampe a été progressivement augmenté, tandis que le contenu du produit de stress oxydatif a été progressivement diminué et l'expression de l'expression de Keap 1 Protein dans le produit de l'entrave. L'expression de la protéine de Nrf 2 et Ho -1 a augmenté. Conclusions Cistanche Deserticola peut améliorer les dommages des neurones de l'hippocampe et réduire le niveau de réponse au stress oxydatif dans l'hippocampe des rats PD. LeEffet de Cistanche Deserticoladans leTraitement de la PDLes rats sont étroitement liés à la régulation de Keap -1 / nrf 2 / ho -1 voie de signalisation.

 

 

 

Cistanche de haute qualité pour le traitement de la MP

 

Mots-clés: Cistanche Deserticola;La maladie de Parkinson; Stress oxydatif; hippocampe; neurones; Keap1; Nrf2; Ho -1

 

Selon les statistiques de l'étude mondiale des données sur les maladies, les maladies neurologiques sont devenues la principale cause d'invalidité dans le monde. Dans ce domaine, la maladie de Parkinson (PD) est devenue l'une des maladies qui accrochent la croissance la plus rapide avec son augmentation significative de la prévalence artisanale, augmentant les cas d'invalidité et la hausse du taux de mortalité. un.
De 1990 à 2020, le nombre de patients atteints de MP dans le monde a augmenté de 118%, atteignant 6,2 millions et l'incidence augmente toujours d'année en année [1-2]. Les patients atteints de MP présentent généralement des symptômes moteurs tels que les tremblements, la raideur musculaire, la bradykinésie et les difficultés d'équilibre au stade tardif. Cependant, des symptômes non moteurs tels que le déclin cognitif peuvent survenir au début de la maladie. À mesure que la maladie progresse, les troubles cognitifs aggraveront progressivement et deviendront plus graves.

Cistanche de haute qualité pour le traitement de la MP

Affecter la qualité de vie des patients [3]. L'hippocampe est une organisation importante dans le cerveau pour l'apprentissage spatial et la réception d'informations externes. C'est la structure principale pour réaliser les fonctions cognitives humaines. Le dysfonctionnement hippocampique est étroitement lié au début de la dysfonction cognitive chez les patients atteints de MP. Le stress oxydatif est impliqué dans le développement de cellules nerveuses dans les tissus hippocampiques. Dommage [4-5]. Par conséquent, si les neurones hippocampiques sont protégés chez les patients atteints de MP, cela peut améliorer la cognition du patient et retarder la progression de la maladie.
Ces dernières années, une variété de plantes médicinales chinoises s'est avérée efficace pour traiter les maladies neurologiques [6]. Cistanche Deserticola est une médecine traditionnelle chinoise qui peut nourrir le yang rénal et reconstituer l'essence et le sang. Il a été utilisé pour traiter les maladies neurologiques telles que les AVC ischémiques et la neuromyélite [7]. Des études antérieures du groupe de recherche ont montré que Cistanche Deserticola peut améliorer le comportement des rats du modèle PD et réduire l'apoptose des cellules nerveuses de dopamine dans la zone de substantia nigra du cerveau moyen [8-9]. Cependant, il n'est pas clair si Cistanche Deserticola peut améliorer les lésions tissulaires de l'hippocampe chez les rats du modèle PD. Par conséquent, cette étude a établi un modèle de rat PD pour observer l'effet de Cistanche Deserticola sur les dommages aux tissus hippocampiques et explorer son mécanisme, afin de fournir de nouvelles idées pour le traitement PD. Compagnie biologique de Tian); Réactif de coloration Nissl (Nanjing Senbeijia Biological Company); Isoflurane (Shanghai Yaji Biological Company).

 

1 Matériaux et méthodes

1.1 Matériaux

1.1.1 Animaux expérimentaux

30 6- Des rats mâles SD d'une semaine pesant 210-230 g ont été utilisés. Le centre animal expérimental de l'Université du Fujian de médecine traditionnelle chinoise a fourni des animaux expérimentaux et des installations générales de l'environnement expérimental médical animal. L'expérience a été approuvée par le comité d'éthique animal de cette institution, et le numéro d'enregistrement d'éthique est 1N2023019.

1.1.2 Réactifs expérimentaux
Cistanche Deserticola granules (Fujian Third People's Hospital); 6- hydroxydopamine (6- ohda) réacent (Beijing Biolabor Technology Co., Ltd.); Réactif de coloration de l'hématoxyline-Eosin (He) (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); Lysat des protéines tissulaires animales (Pékin Solebao Biological Company); Inhibiteurs de la protéine phosphatase (Wuhan Pujian Biological Company); Inhibiteurs de la protéase (Hunan Yunbang Biotechnology Company); Protéine associée à l'ECH de type kelch -1 (Keap1) Anticorps monoclonal (Wuhan Sanying Biotechnology Company); Glycéraldéhyde 3- phosphate déshydrogénase (GAPDH) anticorps monoclonal (Wuhan Huamei biologique); Facteur nucléaire E2 Facteur 2 (NRF2), Hème oxygénase 1 (hémoxygénas -1, Ho -1) Anticorps monoclonal (Wuhan Pujian Biotechnology Co., Ltd.); Kits de détection de la superoxyde dismutase (SOD) et malondialdéhyde (MDA) (Shanghai Biotech Co., Ltd.); Réactif de coloration Nissl (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); Isoflurane (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 Instruments

JEA3001 Electronic Balance (Shanghai Puchun Mesuring Instrument Co., Ltd.); BSA224S Balance électronique (Sartorius, Allemagne); STAB S2T Shaker à basse température (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 Slicer de paraffine entièrement automatique (Leica, Allemagne); Lecteur de microplaques multifonctionnelles PECTRAMAX I3X (Molecular Devices, USA); Bx63
Microscope à fluorescence (Olympus, Japon); DLAB Centrifugeuse D1008 / D1008E (Beijing Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co., Ltd.); Cryocube F740Hi Réfrigérateur à température ultra-bas (EPEND, Allemagne); MiniPro Epbasic Basic Electrophorsise Instrument Power Alimentation (Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.); Four à séchage à température constante (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); Ascence maximum de fumées sans conduit (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 Méthodes

1.2.1 Établissement du modèle et regroupement d'animaux

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 cercles, qui était considéré comme une modélisation réussie. Après cela, les rats du groupe Cistanche Deserticola ont été gavés avec une solution de déserticola de Cistanche de 0,216 g / ml tous les jours, et le groupe vierge et le groupe modèle ont été gavés avec une solution saline normale. Le volume de gavage des trois groupes de rats était de 1 ml / (100 g · d) pendant deux semaines [9]. Une fois le traitement de chaque groupe de rats terminé, les rats ont été euthanasiés de 2% d'anesthésie par inhalation d'isoflurane et les tissus cérébraux ont été collectés pour des études expérimentales ultérieures.

 

1.2.2 Observation des changements pathologiques du tissu hippocampique par coloration à l'hématoxyline-éosine

 

Les tissus hippocampiques de rats dans chaque groupe ont été collectés, placés dans une solution de formaldéhyde, déshydratés avec de l'éthanol de gradient, cuits dans un four à séchage, de la cire dissous, séché, déwaxé, coloré avec lui, transparent avec du xylène, scellé avec de la gomme neutre, et observé au microscope.

 

1.2.3 Microscopie électronique à transmission Observation de l'ultrastructure des cellules nerveuses hippocampiques

Le tissu hippocampique a été placé dans un fixateur de glutaraldéhyde à 3%, déshydraté avec de l'éthanol de gradient, intégré (résine époxy) et des coupes ultramines ont été préparées. La coloration au citrate de plomb et à l'acétate d'uranyle a été utilisée pour observer les changements ultrastructuraux des cellules nerveuses hippocampiques (en microscopie électronique à transmission).

 

1.2.4 Talage Nissl pour observer les changements des corps Nissl dans le tissu hippocampique

Les coupes de paraffine tissulaire hippocampique susmentionnées ont été hydratées dans de l'éthanol anhydre, 95% et 70% d'éthanol de gradient, respectivement. Après le lavage à l'eau distillée 3 fois, teindre avec une solution de coloration NissL pendant 5 min, puis laver avec de l'alcool dégradé déshydraté et de l'eau distillée et claire avec du xylène. Les coupes ont été scellées avec de la colle neutre, et observées et enregistrées au microscope optique après solidification.

 

1.2.5 Méthode colorimétrique chimique pour détecter le contenu du MDA et du SOD dans le tissu hippocampique

Après que les tissus hippocampiques de différents groupes expérimentaux ont été homogénéisés, ils ont été centrifugés à 1000 g pendant 20 min et le surnageant de chaque groupe expérimental a été collecté. Selon les instructions du kit, les kits de test MDA et SOD ont été utilisés pour détecter la teneur en MDA et en SOD dans chaque groupe d'échantillons expérimentaux.

 

1.2.6 Immunotransfert des protéines pour détecter l'expression spécifique des protéines Keap1, Nrf 2 et Ho -1 dans le tissu hippocampique

Les tissus hippocampiques de chaque groupe ont été ajoutés avec du tampon de lyse et centrifugés à 12, 000 r · min -1 pendant 15 min. Le surnageant a été collecté pour une utilisation en attente. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode BCA. Selon les résultats de la quantification des protéines, le volume correspondant de protéine totale a été ajouté et chargé avec une électrophorèse sur gel protéique. Les échantillons ont été dénaturés à 95 degrés pendant 10 min, transférés à la membrane, coupés et bloqués en solution de blocage pendant 1 h. Les anticorps primaires dilués Keap1, Nrf 2, Ho -1 et GAPDH (1: 500) ont été ajoutés, réagi pendant une nuit à 4 degrés, lavé avec 1 × TBST, incubé avec des anticorps secondaires (1: 4000), et lavé avec 1 × TBST pour l'imagerie de couleur.

 

1.3 Analyse statistique

Les données de comptage ont été exprimées en moyenne ± écart-type. Les données conformes à la distribution normale et à l'homogénéité de la variance ont été soumises à un test t, les données conformes à la distribution normale et à une variance inégale ont été soumises à un test t corrigé; Les données qui ne sont pas conformes à la distribution normale ont été soumises à un test non paramétrique. L'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour comparer les différences entre les différents groupes, puis la méthode LSD a été utilisée pour comparer les deux groupes. P <0. 05 était considéré comme statistiquement significatif.

 

2 résultats

2.1 Effet de Cistanche Deserticola sur la structure morphologique de la région de l'hippocampe CA1 chez les rats du modèle PD, il tachant que les résultats ont montré que les neurones de la région CA1 de l'hippocampe des rats de groupe vierge étaient disposés soigneusement et étroitement, avec une morphologie régulière et une distribution uniforme, et aucun dommage neuronal neuronal évident; Les cellules neuronales du groupe modèle ont été disposées de manière plus désordonnée, les noyaux cellulaires ont été réduits, la coloration nucléaire a été approfondie et les lésions des cellules neuronales étaient évidentes; Les cellules neuronales du groupe Cistanche Deserticola ont été disposées plus régulièrement que celles du groupe modèle, le nombre de condensations nucléaires a été relativement réduit et les lésions des cellules neuronales ont été atténuées. Les résultats sont présentés dans la figure 1.

 

 

Figure 1 Effet de Cistanche Deserticola sur la structure pathologique dans la région CA1 de l'hippocampe chez le rat de Parkinson (He, × 400) Remarque: A: groupe témoin; B: groupe de modèles; C: Cistanche Group. Les flèches noires indiquent les cellules nerveuses endommagées.

 

2.2 Effet de Cistanche Deserticola sur l'ultrastructure des neurones hippocampiques chez les rats du modèle PD

Dans le groupe vide, lors de l'observation des neurones hippocampiques, on peut observer que la structure cellulaire maintient une morphologie claire, le noyau présente une forme ronde ou ovale régulière, la membrane nucléaire reste lisse et intacte, et la chromatine dans le noyau est répartie et il n'y a pas d'agrégation de bord de la chromatine nucléaire. En revanche, les neurones hippocampiques du groupe modèle ont montré des changements évidents: la densité électronique globale des cellules a augmenté, le noyau condensé, la chromatine dans le noyau agrégé et attaché au fond de la membrane nucléaire, la membrane nucléaire s'épaissit et les vacuoles ont été observés dans le cytoplasme. Après l'intervention avec Cistanche Deserticola, par rapport au groupe modèle, les neurones hippocampiques du groupe de Cistanche Deserticola ont montré une certaine tendance de récupération: la taille du corps de cellules neuronales a été restaurée, la membrane cellulaire est restée intacte, l'agrégation de bords de la chromatine nucléaire a également été allé Le cytoplasme a diminué, indiquant que Cistanche déserticola a un certain effet de protection ou de réparation sur les cellules nerveuses. Voir la figure 2.

 

Figure 2 Effet de Cistanche Deserticola sur l'ultrastructure neuronale dans l'hippocampe des rats de la maladie de Parkinson (× 7000) Remarque: A: groupe témoin; B: groupe de modèles; C: Cistanche Group.

 

2.3 Effet du déserticola de Cistanche sur les corps NISSL dans les neurones hippocampiques de rats modèles PD

Les résultats de la coloration NISSL ont montré que les neurones du groupe vierge étaient étroitement disposés, avec une morphologie régulière, des corps Nissl abondants et une coloration sombre; Les neurones du groupe modèle ont été disposés vaguement, gonflés et la plupart des corps NISSL ont été dissous et légèrement colorés; Les neurones du groupe Cistanche Deserticola ont été étroitement disposés, avec une morphologie régulière, et le nombre et la coloration des corps NISSL ont été améliorés par rapport au groupe modèle. Les résultats sont présentés dans la figure 3.

 

Figure 3 Effet de Cistanche Deserticola sur le corps de NISSL des cellules nerveuses hippocampiques chez la maladie de Parkinson Rat (Nissl, × 200) Remarque: A: groupe témoin; B: groupe de modèles; C: Cistanche Group.

 

2.4 Effets du déserticola de Cistanche sur le contenu du gazon et de la MDA dans l'hippocampe des rats de la maladie de Parkinson

 

Par rapport au groupe vide, la teneur en SOD dans l'hippocampe du groupe modèle a diminué, tandis que la teneur en MDA a augmenté; Par rapport au groupe de modèles, la teneur en SOD dans l'hippocampe du groupe Cistanche Deserticola a augmenté, tandis que la teneur en MDA a diminué. Voir le tableau 1.

 

Languette. 1 Effets de Cistanche Deserticola sur le contenu du gazon et de la MDA dans l'hippocampe des rats de la maladie de Parkinson

Groupe	SOD (PG / ML)	MDA (PG / ML)
Contrôle	12.36±2.75	2.85±0.83
Modèle	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Remarque: par rapport au groupe témoin, * P<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Effet de Cistanche Deserticola sur l'expression des protéines Keap1, Nrf2 et Ho -1 dans l'hippocampe des rats de la maladie de Parkinson

Les résultats des expériences Western blot ont montré que l'expression des protéines Nrf2 et Ho -1 dans l'hippocampe des rats dans le groupe modèle a diminué, tandis que l'expression de la protéine Keap1 a augmenté; Par rapport au groupe modèle, l'expression des protéines Nrf2 et Ho -1 dans l'hippocampe des rats dans le groupe déserticola de Cistanche a augmenté, tandis que l'expression de la protéine Keap1 a diminué. Voir la figure 4 et le tableau 2.

Figure 4 Effet de Cistanche Deserticola sur l'expression de Keap1, Nrf2 et Ho -1 dans l'hippocampe des rats de la maladie de Parkinson

Remarque: A: groupe témoin; B: groupe de modèles; C: groupe Cistanche

 

 

Languette. 2 Effet de Cistanche Deserticola sur l'expression de Keap1, Nrf2, Ho -1 dans l'hippocampe des rats de la maladie de Parkinson

 

Groupe	Keap	Nrf2	Ho -1
Groupe vide	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Groupe de modèles	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Groupe positif	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

Remarque: par rapport au groupe témoin, * p <{{0}}. 05; Comparé au groupe de modèles, #P <0,05.