Le polysaccharide de Cistanche Deserticola peut atténuer l'ostéoclastogenèse et la résorption osseuse

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Dezhi Song, et al

L'ostéoporose est une maladie métabolique caractérisée par une ostéopénie et une détérioration de la microstructure osseuse. Les ostéoclastes sont les principales cellules effectrices qui dégradent la matrice osseuse et leur fonctionnement anormal conduit au développement de l'ostéoporose. L'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) au cours du métabolisme cellulaire favorise la prolifération et la différenciation des ostéoclastes, jouant ainsi un rôle important dans l'ostéoporose.Cistanche désertiquepolysaccharide (CDP) possèdeantitumoral, anti‐inflammatoire, etantioxydant activité. Cependant, l'impact des ostéoclastes CDPon n'est pas clair. Dans cette étude, la coloration à la phosphatase acide tartrate‐résistante, l'immunofluorescence, la transcription inverse‐amplification en chaîne par polymérase et l'analyse Western blot ont été utilisées pour démontrer que la CDP inhibait l'ostéoclastogenèse et la résorption de l'hydroxyapatite. En outre, le CDP a également inhibé l'expression des gènes marqueurs des ostéoclastes, notamment Ctsk, Mmp9 et Acp5, et n'a eu aucun effet sur l'expression de l'activateur du récepteur du facteur nucléaire κB (RANK). Des analyses mécanistes ont révélé que le CDP augmente l'expression des enzymes antioxydantes pour atténuer la production de ROS médiée par le RANKL dans les ostéoclastes et inhibe le facteur nucléaire des lymphocytes T activés et l'activation de la protéine kinase activée par les mitogènes. Ces résultats suggèrent que le CDP pourrait représenter un médicament candidat pour le traitement de l'ostéoporose causée par une activité excessive des ostéoclastes.

MOTS CLÉS:os résorption, Cistanchedésertiquepolysaccharide, MAPK, ostéoclaste, espèces réactives de l'oxygène

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1. INTRODUCTION

L'équilibre entre la formation osseuse, médiée par les ostéoblastes, et la résorption osseuse, médiée par les ostéoclastes, joue un rôle vital dans le maintien de l'homéostasie métabolique osseuse (Manolagas, 2000 ; Zhu et al., 2018). Lorsque la résorption osseuse dépasse la formation osseuse, l'ostéoporose se produit, qui se caractérise par une réduction de la masse osseuse et des dommages à la microstructure osseuse (Ikeda, 2008). L'ostéoporose est une maladie courante chez les personnes âgées et les femmes ménopausées et sa pathogénie n'a pas été complètement élucidée (Cooper & Melton, 1992). La carence en œstrogène est la principale cause d'ostéoporose (Manolagas, O'Brien et Almeida, 2013). De plus, les espèces réactives de l'oxygène (ROS) peuvent être induites par l'activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaireκB (RANKL) et sont associées à la formation d'ostéoclastes (Yip et al., 2005), et peuvent ainsi contribuer au développement de l'ostéoporose (Manolagas, 2010 ). Certaines études ont montré que la carence en Nrf2-antioxydant augmente les niveaux de ROS et favorise la différenciation des ostéoclastes induite par le rang (Hyeon, Lee, Yang et Jeong, 2013). Par conséquent, la réduction de la production de ROS lors de la différenciation des ostéoclastes doit être évaluée comme une stratégie thérapeutique pour le traitement de l'ostéoporose.

Les ostéoclastes sont dérivés de la lignée hématopoïétique des monocytes ou des macrophages et sont les seules cellules multinucléées qui effectuentos résorption(Teitelbaum, 2000). Par conséquent, la recherche impliquant la formation d'ostéoclastes est d'une grande importance dans le développement de traitements efficaces pourosmétabolismemaladies(Lorenzo, 2017). Le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et le RANKL, produits par les ostéoblastes et les lymphocytes T activés, sont des cytokines importantes qui régulent l'ostéoclastogenèse (Kim & Kim, 2016 ; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL induit l'expression du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFATc1), qui est un facteur de transcription critique actif lors de la formation des ostéoclastes (Ishidaet al., 2002). NFATc1 activé favorise l'expression de gènes marqueurs des ostéoclastes tels que la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAcP) et la cathepsine K (CTSK) qui régulent l'ostéoclastogenèse et la fonction des ostéoclastes (Balkan et al., 2009 ; Crottiet al., 2008). Ces résultats suggèrent que la CDP pourrait être utilisée pour traiter l'ostéoporose causée par une résorption osseuse ostéoclastique excessive.

2|MATÉRIAUX ET MÉTHODES

2.1|Matériaux

Le CDP (pureté> 98 pour cent) a été acheté auprès de Solarbio (Pékin, Chine) et préparé à une concentration de stock de 1 mM dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les anticorps sont spécifiques pour c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, phosphorylé (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK et ‐actine ont été obtenus auprès de Santa Cruz Biotechnology (San José, Californie). Des anticorps anti-V-ATPase d2 ont été produits comme décrit précédemment (H. Feng et al., 2009). Le système de dosage du 3‐(4,5‐diméthylthiazol‐2‐yl)‐5‐(3‐carboxyméthoxyphényl)‐2‐(4‐sulfophényl)‐2H‐tétrazolium (MTS) et de la luciférase a été obtenu auprès de Promega (Sydney, Australie) . Le M-CSF recombinant a été acheté auprès de R&D Systems (Minneapolis, MN). La protéine recombinante GST-rRANKL a été exprimée et purifiée comme décrit précédemment (Xu et al., 2000).

2.2|Culture de cellules

Des cellules RAW264.7 (cellules de macrophages de souris) ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) et cultivées dans un milieu essentiel minimal modifié (Thermo FisherScientific, Scoresby, Australie) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM de L‐glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 ug/ml de streptomycine (milieu complet). Des monocytes dérivés de la moelle osseuse (BMM) ont été isolés à partir de souris C57BL/6J âgées de 6 semaines, qui ont été euthanasiées conformément aux procédures approuvées par le comité d'éthique animale de l'Université d'Australie-Occidentale (RA/3/100/1244). Les os longs ont été disséqués sans tissus mous et la moelle osseuse a été évacuée du fémur et du tibia, qui a ensuite été cultivée dans un milieu complet en présence de M‐CSF (50 ng/ml).

2.3|Test d'ostéoclastogenèse

BMMs were plated into 96‐well culture plates at a density of 6 × 103cells per well and treated with a complete medium containing M‐CSF(50 ng/ml) and GST‐rRANKL (100 ng/ml), in the presence or absence of varying concentrations of CDP. The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4%paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells(>trois noyaux) ont été identifiés comme des ostéoclastes.

2.4|Essais de cytotoxicité

Les BMM ont été ensemencés dans des plaques à 96 puits à raison de 6 × 103 cellules par puits et laissés adhérer toute la nuit. Le jour suivant, les cellules ont été incubées avec différentes concentrations de CDP. Après 48 heures supplémentaires, une solution de MTS (20 ul/puits) a été ajoutée et incubée avec des cellules pendant 2 heures. L'absorbance à 490 nm a été déterminée avec un lecteur de microplaques (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA).

2.5|Coloration immunofluorescente

Les BMM ont été ensemencés à une densité de 6 × 103 cellules par puits en présence de M‐CSF (50 ng/ml) pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été stimulées avec M‐CSF et GST‐rRANKL (100 ng/ml) jusqu'à ce que des ostéoclastes matures se forment. Les ostéoclastes ont ensuite été traités avec des concentrations variables de CDP pendant 48 heures avant d'être fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %, perméabilisés avec du Triton X‐100–PBS à 0,1 % et bloqués avec de l'albumine de sérum bovin à 3 % dans du PBS. Les cellules préparées ont été incubées avec de la phalloïdine conjuguée à la rhodamine pendant 45 min dans l'obscurité pour colorer la F-actine. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, les noyaux contre-colorés avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et montés avec des lamelles pour la microscopie confocale.

2.6|Test de résorption de l'hydroxyapatite

Pour mesurer l'activité des ostéoclastes, des BMM (1 × 105 cellules par puits) cultivées sur des plaques recouvertes de collagène à six puits (BD Biocoat ; ThermoFisher Scientific) ont été stimulées avec du GST-rRANKL (100 ng/ml) et du M-CSF (50 ng/ml ) jusqu'à ce que des ostéoclastes matures soient générés (Zhou et al., 2016). Les cellules ont ensuite été délicatement détachées de la plaque à l'aide d'une solution de dissociation cellulaire (Sigma-Aldrich) et un nombre égal d'ostéoclastes matures ont été ensemencés sur des plaques à 96 puits recouvertes d'hydroxyapatite (Corning Osteoassay, Corning, NY). Les ostéoclastes matures ont été incubés dans un milieu contenant du rRANKL et du M-CSF avec ou sans CDP aux concentrations indiquées. Après 48 heures, la moitié des puits ont été immunohistochimiquement colorées pour l'activité TRAcP, comme décrit ci-dessus, pour évaluer le nombre de cellules multinucléées par puits. Les puits restants ont été blanchis pendant 10 min pour éliminer les cellules et permettre la mesure des zones résorbées. Les zones résorbées ont été photographiées sous microscopie optique standard et le logiciel Ima geJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) a été utilisé pour quantifier le pourcentage de surface d'hydroxyapatite résorbée par les ostéoclastes.

2.7|Essais de rapporteur de luciférase

Pour étudier l'activation de la transcription de NFATc1, des cellules RAW264.7 ont été transfectées de manière stable avec une construction de rapporteur de luciférase sensible à NFATc1 (Cheng et al., 2018 ; van der Kraan et al., 2013). Les cellules transfectées ont été cultivées dans des plaques à 48 puits à une densité de 1,5 × 105 cellules par puits et prétraitées avec diverses concentrations de CDP pendant 1 h. Après le prétraitement, les cellules ont été stimulées avec GST‐rRANKL (100 ng/ml) pendant 24 heures, et l'activité de la luciférase a été mesurée à l'aide du système de dosage rapporteur de la luciférase conformément au protocole du fabricant (Promega).

2.8|Analyse quantitative de la transcription inverse‐polymérase en chaîne (RT‐PCR)

L'ARN total a été isolé des cellules en utilisant le réactif Trizol selon le protocole du fabricant (Thermo Fisher Scientific). L'ADN complémentaire a été synthétisé à l'aide de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney avec 1 ug de matrice d'ARN et des amorces oligo‐dT. L'amplification par réaction en chaîne par polymérase de séquences spécifiques a été réalisée en utilisant le programme suivant : 94 degrés pendant 5 min, suivi de 30 cycles de 94 degrés pendant 40 s, 60 degrés pendant 40 s et 72 degrés pendant 40 s, et une étape d'extension finale de 5 min à 72 degrés. Les informations détaillées sur les amorces spécifiques sont présentées dans le tableau 1. Les niveaux relatifs d'ARN messager ont été calculés par normalisation à l'expression du gène domestique Hmbs.

2.9|Analyse Western blot

Les BMM ont été cultivés dans un milieu complet avec du M‐CSF dans des plaques à six puits et stimulés avec du GST‐rRANKL (100 ng/ml) pendant les durées indiquées. Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse par radioimmunoprécipitation et les protéines ont été résolues par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide et transférées sur des membranes de poly(fluorure de vinylidène) (GE Healthcare, Silverwater, Australie). Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % pendant 1 heure, puis sondées avec divers anticorps primaires spécifiques sous agitation douce pendant une nuit à 4 degrés. Les membranes ont été lavées puis incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort. La réactivité des anticorps a ensuite été détectée avec un réactif de chimiluminescence amélioré (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) et visualisée avec un Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Détection intracellulaire des ROS

Les niveaux de ROS intracellulaires ont été détectés à l'aide d'un kit de test de détection de ROS cellulaire au diacétate de 2′, 7′-dichlorofluorescéine (Abcam, Melbourne, Australie). Les BMM (5 × 103 cellules par puits) ont été cultivées dans des plaques à 96 puits et traitées avec du RANKL (100 ng/ml), du M‐CSF (50 ng/ml) et du CDP pendant 72 heures. Les niveaux intracellulaires de ROS ont été mesurés à l'aide de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine, qui s'oxyde en LCR fluorescent en présence de ROS. Les cellules ont été lavées dans du tampon de Hank et incubées dans l'obscurité pendant 30 min avec 10 µM de DCFH‐DA. Les images ont été obtenues par microscopie confocale.

2.11|analyses statistiques

Toutes les données sont représentatives d'au moins trois expériences réalisées en triple, sauf indication contraire. Les données sont exprimées en moyenne ± SD. Une analyse unidirectionnelle de la variance suivie de tests hoc de Student–Newman–Keulspost ont été utilisés pour déterminer la signification des différences entre les résultats, avec p < 0.05="" considéré="" comme="">

3|RÉSULTATS

3.1|Le CDP inhibe l'ostéoclastogenèse induite par RANKL et la fusion des ostéoclastes

Pour déterminer si le CDP peut supprimer la formation d'ostéoclastes induite par RANKL, nous avons d'abord effectué un test d'ostéoclastogenèse à l'aide de BMM de souris (Liu et al., 2013 ; Song et al., 2016). Les BMM ont été traités avec RANKL et M‐CSF pendant 5 jours avec des concentrations croissantes de CDP. Le CDP a réduit le nombre de cellules multinucléées TRAcP‐positives lorsque la concentration de CDPreached 5 µM ou plus (Figure 1a, b). Pour évaluer la toxicité du CDP et confirmer que ces résultats ne reflétaient pas la mort ou le nombre de cellules, nous avons effectué un test MTS. Les BMM ont été traités avec RANKL et M‐CSF pendant 48 heures avec différentes doses de CDP. Le CDP n'a eu aucun effet sur la prolifération de BMM à la concentration de 15 µMor moins (Figure 1c).

Pour tester les effets du CDP sur la fusion des ostéoclastes, les ostéoclastes ont été induits avec un traitement au RANKL et au M‐CSF, avec ou sans différentes doses de CDP. Les ostéoclastes ont été colorés avec de la rhodamine-phalloïdine et du DAPI pour évaluer le nombre de noyaux par ostéoclaste (Figure 2a). Le nombre d'ostéoclastes et le nombre moyen de noyaux par ostéoclaste ont diminué après le traitement au CDP (5 à 10 µM; Figure 2b, c). Par conséquent, le CDP a eu des effets inhibiteurs sur l'ostéoclastogenèse induite par RANKL et la fusion des ostéoclastes de manière dose‐dépendante.

3.2|Le CDP atténue l'activité de résorption de l'hydroxyapatite ostéoclastique induite par RANKL

Un test de résorption de l'hydroxyapatite a été effectué pour détecter l'effet du CDP sur la fonction des ostéoclastes (Figure 3a). Après une incubation de 24 heures, le nombre d'ostéoclastes par puits n'a pas changé tandis que la zone de résorption de l'hydroxyapatite a été significativement réduite par le traitement avec 5 et 10 µM de CDP par rapport aux groupes témoins (Figure 3b, c). Ces résultats démontrent que le CDP a de forts effets inhibiteurs à la fois sur la formation des ostéoclastes et sur l'activité de résorption des ostéoclastes sans aucun effet cytotoxique.

3.3|Le CDP inhibe l'expression du gène marqueur des ostéoclastes

Pour étudier plus avant les effets inhibiteurs du CDP sur l'ostéoclastogenèse et la résorption osseuse ostéoclastique, les BMM ont été traités avec RANKL et M‐CSF pendant 5 jours avec différentes concentrations de CDP. Une RT‐PCR a ensuite été réalisée pour détecter l'expression des gènes marqueurs des ostéoclastes. L'expression de Nfatc1, un facteur de transcription crucial au cours de l'ostéoclastogenèse, a été inhibée par le CDP de manière dose‐dépendante (Figure 4a). De plus, le CDP (5 et 10 µM) a régulé à la baisse l'expression de gènes liés à la résorption osseuse, notamment Mmp9, Ctsk et Acp5 (Figure 4bd).

3.4|Le CDP supprime l'activité de NFATc1 et l'expression des protéines en aval

Pour examiner l'effet du CDP sur l'activité NFATc1 induite par RANKL, un test de rapporteur de luciférase a été effectué. Le traitement au CDP, à des concentrations de 5 µM et plus, a inhibé de manière significative l'activité NFATc1 induite par RANKL (Figure 5a). De plus, une analyse par Western blot a montré que le CDP supprimait de manière significative l'expression des protéines de NFATc1 et de c‐Fos dans les BMM traités avec RANKL et M‐CSF pendant 3 et 5 jours (Figure 5b). De plus, l'expression des protéines liées à la fonction des ostéoclastes, telles que V‐ATPase‐d2 et CTSK, était régulée négativement en présence de CDP par rapport aux groupes témoins. Cependant, le CDP n'a eu aucun effet sur l'expression de RANK (figure 5b).

3.5|Le CDP favorise l'expression d'enzymes antioxydantes pour piéger la production de ROS pendant l'ostéoclastogenèse induite par RANKL

Pour explorer le mécanisme sous-jacent de l'inhibition de l'ostéoclastogenèse dépendante du CDP, les BMM ont été traités avec du RANKL (100 ng/ml) et du M‐CSF (50 ng/ml) avec du PBS ou du CDP pendant 72 heures. Nous avons examiné l'effet du CDP sur la production intracellulaire de ROS stimulée par RANKL. Les niveaux de ROS intracellulaires ont été augmentés par le traitement RANKL, qui a été atténué par le CDP (5 et 10 µM; Figure 6a). Le nombre de cellules ROS‐positives et l'intensité de la coloration ROS ont été diminués par le traitement CDP de manière dose‐dépendante (Figure 6b,c). L'analyse Western blot a montré que le CDP favorisait l'expression de la thiorédoxine (TRX1) et de la glutathion réductase (GSR) tout en supprimant l'expression de l'oxyde nitrique synthase inductible (NOS2) dans les BMM traités avec RANKL et ‐CSF pendant 3 jours (Figure 6d).

Pour explorer plus avant si le CDP supprimait la différenciation des ostéoclastes en réduisant la production de ROS, nous avons ensuite traité les BMM avec du peroxyde (10 µM) pour imiter le statut élevé de ROS dans les cellules. Les BMM ont été induits par RANKL et M‐CSF pendant 3 jours et les résultats de l'analyse Western blot et RT‐PCR ont montré que le peroxyde favorisait l'expression de NFATc1 et de c‐Fos par rapport aux groupes témoins. Conformément aux résultats de la figure 5, l'expression de NFATc1 et de c-Fos a été supprimée par le CDP tandis que le peroxyde a sauvé l'effet inhibiteur du CDP (figure 6e, f). Ces données ont indiqué que le CDP réprimait l'expression de NFATc1 et de c‐Fos en éliminant la production de ROS.

3.6|Le CDP réprime les voies MAPK pendant l'ostéoclastogenèse induite par le RANKL

Ensuite, nous avons étudié l'effet du traitement CDP sur l'expression de TRAF6 médiée par RANKL et l'activation de la voie MAPK. Après incubation dans un milieu sans sérum pendant 2 heures, les BMM ont été stimulés avec RANKL, avec ou sans CDP, pendant 60 minutes. La stimulation avec CDP (10 µM) n'a eu aucun effet sur l'expression de TRAF6 et a atténué la phosphorylation de JNK2 et ERK1/2 à 10 et 20 min (Figure 7). De plus, la phosphorylation de p38 a été significativement inhibée par un traitement au CDP de 60 min par rapport aux groupes témoins (Figure 7). Ces données révèlent que le CDP supprime les voies de signalisation MAPK induites par le RANKL, conformément à son effet inhibiteur sur la formation et l'activité des ostéoclastes.

4|DISCUSSION

Cistanche, connu sous le nom de "ginseng du désert", a récemment attiré beaucoup d'attention pour sa capacité à moduler l'immunité et à agir de manière protectrice pendant le vieillissement et le stress oxydatif (Jia et al., 2012 ; Snytnikovaet al., 2012). Il a été démontré que les diglycosides substitués par des phénylpropanoïdes, les principaux composants actifs de Cistanche, inhibent l'activité des macrophages (Ahn, Chae, Chin et Kim, 2017). De plus, un extrait de Cistanche a réduit le stress oxydatif dans le myocarde reperfusé suite à une ischémie et a joué un rôle important dans l'inhibition des voies apoptotiques conduisant à la cardioprotection (Yu, Li, & Cao, 2016). En tant que composant important de Cistanche, le CDP a une variété de fonctions pharmacologiques. Notre étude actuelle a révélé que le CDP réprimait la différenciation et l'activation des ostéoclastes activés par RANKL en atténuant la production de ROS ainsi que l'activation de NFAT et de MAPK.

En tant que phosphatase acide, TRAcP existe dans une variété de cellules et est abondant dans les ostéoclastes et les macrophages alvéolaires (Snipes, Lam, Dodd, Gray et Cohen, 1986). TRAcP est une enzyme caractéristique des ostéoclastes et son expression est étroitement liée à la fonction des ostéoclastes, considérée comme un indicateur de l'activité des ostéoclastes et de la résorption osseuse (Minkin, 1982). Dans notre étude, le CDP a inhibé le nombre de cellules positives pour TRAcP, indiquant que l'ostéoclastogenèse induite par RANKL était bloquée par le CDP. La dégradation de la matrice osseuse par les ostéoclastes dépend de la cathepsine K (CTSK) et des MPs (Gruber, 2015). Ici, le CDP a significativement régulé à la baisse l'expression des gènes fonctionnels des ostéoclastes tels que Mmp9, Ctsk et Acp5.

La différenciation et la fonction des ostéoclastes sont régulées par de multiples voies de signalisation (Boyle, Simonet et Lacey, 2003). Après s'être lié à RANK, RANKL recrute la protéine adaptatrice TRAF6 pour activer l'expression de NFATc1, qui est un facteur de transcription important pour la formation des ostéoclastes, affectant l'expression des gènes spécifiques aux ostéoclastes, y compris TRAcP et CTSK (X. Feng, 2005 ; Takayanagi et al., 2002). Dans cette étude, nous avons constaté que le CDP n'avait aucun effet sur l'expression de RANK et de TRAF6 dans les ostéoclastes. Cependant, le CDP a inhibé l'activation de NFATc1 induite par RANKL au cours de l'ostéoclastogenèse des BMM. Par ailleurs, il a été démontré que les ROS, produits par les mitochondries en train de délivrer des électrons, favorisaient la prolifération et la différenciation des ostéoclastes et régulaient la dégradation de la matrice osseuse (Ha et al., 2004). Une étude récente a révélé que RANKL induisait l'import nucléaire de Bach1 et atténuait la production d'enzymes antioxydantes médiées par Nrf2, augmentant ainsi l'expression intracellulaire des ROS et l'ostéoclastogenèse chez la souris (Kanzaki et al., 2017). De plus, la génération accrue de ROS intracellulaires par l'homocystéine a amélioré la formation et l'activité des ostéoclastes (Koh et al., 2006). Notre étude a révélé que le CDP réduisait l'accumulation de ROS dans les ostéoclastes en inhibant l'expression de NOS2 et en favorisant l'expression d'enzymes antioxydantes, telles que TRX1 et la glutathion réductase. Lorsque nous avons traité les BMM avec du peroxyde pour améliorer l'accumulation intracellulaire de ROS, les résultats selon lesquels une augmentation des ROS pourraient améliorer l'expression de NFATc1 ont révélé que les ROS étaient en amont de NFATc1. Ainsi, nos données suggèrent que le CDP supprime l'accumulation de ROS pour inhiber l'expression de NFATc1, puis réprime la formation et la fonction des ostéoclastes.

ERK, JNK et p38 appartiennent à la famille MAPK, qui est également impliquée dans la régulation de la différenciation des ostéoclastes (Seger & Krebs, 1995). RANKL active la voie MAPK en augmentant la phosphorylation de ERK, JNK et p38 (Mizukami et al ., 2002). Nous avons démontré que le CDP réprimait la phosphorylation médiée par RANKL des protéines clés de la voie MAPK, contribuant ainsi à l'effet inhibiteur du CDP sur l'expression des gènes marqueurs des ostéoclastes. À notre connaissance, il s'agit de la première étude montrant les effets inhibiteurs du CDP sur la production de ROS, l'activation de NFAT et de MAPK, représentant de nouveaux mécanismes d'action du CDP in vitro.

En résumé, nous avons démontré que le CDP atténue l'ostéoclastogenèse et la résorption de l'hydroxyapatite, ainsi que l'expression des gènes marqueurs des ostéoclastes, notamment Ctsk, Mmp9 et Acp5. Le CDP a pu supprimer la production de ROS médiée par RANKL, ainsi que l'activation de NFAT et MAPK (Figure 8). Collectivement, nos résultats suggèrent que le CDP pourrait représenter un médicament candidat pour le traitement des affections liées aux ostéoclastes accompagnées d'une surproduction de ROS.

REMERCIEMENTS

Cette étude a été soutenue par la Nature Science Foundation of China (81572164), le National Key Technology Research and Development Program of China (2017YFC1103300), la Natural ScienceFoundation of Guangxi Province (2016GXNSFAA380295) et le University Science and Technology Research Project of GuangxiProvince ( KY2015YB054). Il est également soutenu en partie par le GuangxiScientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & HealthResearch Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, TheUniversity of Western Australia (UWA) Research CollaborationAwards et Australian Health and Conseil de la recherche médicale (NHMRC, nos 1107828 et 1027932).

LES CONFLITS D'INTÉRÊTS

Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflits d'intérêts.

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