Le polysaccharide de Cistanche Deserticola induit la mélanogénèse dans les mélanocytes, réduit le stress oxydatif et favorise le blanchiment

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Yibo Hu1|Jinhua Huang1|Yixiao Li2|Ling Jiang1|Yujie Ouyang1|Lun Yang1|Xiaojiao Zhao1|Lihua Huang3|Hong Xiang3|Jing Chen1 Qinghai Zeng1

Résumé

En tant que partie principale des troubles de la pigmentation, les maladies de la dépigmentation de la peau telles que le vitiligo et le naevus achromique sont très courantes et attirent davantage l'attention maintenant. La pathogenèse de la dépigmentation comprend le dysfonctionnement et la perte de mélanocytes, qui sont probablement causés par l'hérédité, l'auto-immunité etstress oxydatifs. Parmi eux, le stress oxydatif joue un rôle clé ; cependant, peu de traitements cliniques peuvent traiter le stress oxydatif. Comme signalé,Polysaccharide de Cistanche deserticola(CDP) est un antioxydant efficace ; sur cette base, nous avons évalué son rôle dans les mélanocytes et révélé les mécanismes. Dans cette étude, nous avons constaté que le CDP pouvait promouvoirmélanogénèsedans les mélanocytes épidermiques humains (HEM) et les cellules de mélanome de souris B16F10, il a également induit une pigmentation chez le poisson zèbre. Par ailleurs,CDPpourrait activer la voie du signal de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK), puis réguler à la hausse l'expression du facteur de transcription associé à la microphtalmie (MITF) et des gènes en aval TYR, TRP1, TRP2 et RAB27A. Sinon, nous avons découvert que le CDP pouvait atténuer la cytotoxicité et l'apoptose induites par H2O2- dans les mélanocytes. D'autres preuves ont révélé que le CDP pourrait améliorer la voie antioxydante NRF2/HO-1 et piéger les ROS intracellulaires. En résumé, le CDP peut promouvoirmélanogénèseet empêcher les mélanocytes deoxydantstresserblessure, suggérant que le CDP aide à maintenir le statut normal des mélanocytes. Ainsi,CDPpeut être un nouveau médicament pour le traitement des maladies de dépigmentation.

MOTS CLÉS

Cistanche deserticola polysaccharide, maladie de dépigmentation, mélanocyte, mélanogénèse, NRF2, stress oxydatif

FraisCistanche

1|INTRODUCTION

Les maladies de dépigmentation cutanée, telles que le vitiligo et le naevus achromique, se caractérisent par une dépigmentation cutanée inégale ou étendue.1 Bien que les lésions cutanées provoquent rarement des lésions physiques graves, elles affectent l'apparence du patient et créent un lourd fardeau psychologique, voire des troubles de santé mentale.2 les principaux changements pathologiques de la dépigmentation comprennent le dysfonctionnement et la perte de mélanocytes, qui ont un impact important sur la synthèse et le transport de la mélanine,3 conduisant ainsi à une accumulation insuffisante de mélanine dans la peau.

Les mécanismes impliqués dans la dépigmentation sont actuellement inconnus, mais des études ont identifié certains facteurs liés. D'une part, la fonction des mélanocytes dépend en partie du facteur de transcription associé à la microphtalmie (MITF), bien connu pour favoriser l'expression demélanogénèse- gènes liés, y compris la tyrosinase (TYR), la protéine 1 liée à la tyrosinase (TRP1), la protéine 2 liée à la tyrosinase (TRP2), la protéine liée à ras Rab-27a (RAB27A) et la protéine 1 de liaison à l'actine de la fascine (FSCN1 ).4 Parmi ces gènes, TYR joue un rôle clé dans la synthèse de la mélanine via l'oxydation de la l-dopa en dopaquinone.5 D'autre part, des études suggèrent une combinaison de plusieurs facteurs pouvant être responsables de la perte de mélanocytes, notamment l'hérédité, l'environnement, l'auto-immunité , etstress oxydatif.6-9 Parmi ces facteurs, le stress oxydatif est considéré comme le plus important.

Les mécanismes destress oxydatifprovoquant une dépigmentation ont été en partie révélés ; la surcharge en espèces réactives de l'oxygène (ROS) est un facteur clé.10 La surcharge en ROS dans la dépigmentation implique un déséquilibre entre les systèmes pro- et antioxydant.11 L'un des éléments qui participe à ce déséquilibre est lié au facteur nucléaire érythroïde 2- facteur 2/élément de réponse antioxydante (NRF2/ARE) altération de la voie antioxydante.12 La voie est constituée de NRF2 et d'enzymes antioxydantes telles que l'hème oxygénase-1 (HMOX-1, HO-1) , la catalase (CAT), la glutathion peroxydase 1 (GPX1) et la NAD(P)H quinone déshydrogénase 1 (NQO1).13 l'expression d'enzymes antioxydantes. Cependant, dans certaines maladies de dépigmentation, telles que le vitiligo, une voie antioxydante NRF2/ARE altérée ne peut pas piéger efficacement les ROS.14

Les thérapies cliniques couramment utilisées dans la dépigmentation comprennent les corticostéroïdes topiques ou systémiques, les inhibiteurs de la calcineurine, l'ultraviolet B à bande étroite (NBUVB ; 311 nm), la lumière excimère 308-nm, la greffe épidermique autologue et la thérapie de médecine traditionnelle chinoise (MTC). Les corticostéroïdes et les inhibiteurs de la calcineurine peuvent réduire l'activation immunitaire anormale,15 tandis que les photothérapies sont utilisées comme traitement de première ligne ; en particulier, le NBUVB stimule la prolifération des mélanocytes et la destruction des lymphocytes T,16 tandis que la lumière excimère 308-nm induit l'apoptose des lymphocytes T.17 En outre, les effets des thérapies TCM sont liés à la promotionmélanogénèse.18 Dans une certaine mesure, ces méthodes sont utiles pour améliorer la dépigmentation, mais le contrôle de la progression de la maladie reste difficile. Il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies, notamment pourstress oxydatif, qui était auparavant négligé.

Cistanche deserticola est connue sous le nom de « ginseng du désert ».19 Ses composants sont utiles dans les lésions hépatiques induites par l'éthanol et l'hyperplasie inflammatoire intestinale ; il peut également être utilisé comme réactif anti-fatigue, anti-inflammatoire et anti-tumoral. 20-22 Récemment, Guo et al ont rapporté quePolysaccharide de Cistanche deserticola(CDP), l'un de ses principaux composants, possédait une activité antioxydante et hépatoprotectrice20 ; deux autres études ont identifié son rôle dans la protection des cellules contre unstress oxydatifblessure dans les conditions de privation/reperfusion d'oxygène-glucose et d'ostéoporose.23,24 Cependant, le rôle de la CDP dans les maladies de dépigmentation n'a pas été élucidé. Ici, nous avons cherché à confirmer siCDPpourrait affectermélanogénèseet protéger les mélanocytes du stress oxydatif.

2|MATÉRIEL ET MÉTHODES

2.1|Produits chimiques et anticorps

Polysaccharide de Cistanche deserticola(CDP) et l-dopa ont été achetés auprès de Yuanye Biotec (pureté supérieure ou égale à 98 % ; Shanghai, Chine). Peroxyde d'hydrogène (H2O2), diméthylsulfoxyde (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-diméthylthiazol-2-yl-2,5-bromure de diphényltétrazolium ( MTT) et un kit de détection d'apoptose Annexin V-FITC ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. du paraformaldéhyde neutre à 4 % a été acheté auprès de Biosharp (Hefei, Chine) ; et un kit de coloration par immunofluorescence (Alexa Fluor 488) et du 2,7- dichlorofluorescéine-diacétate (DCFH-DA) ont été achetés auprès de Beyotime Biotec (Shanghai, Chine). Un kit de coloration Fontana-Masson et un kit d'extraction de protéines nucléoplasmiques ont été achetés auprès de Sloarbio (Beijing, Chine). Le supplément de croissance des mélanocytes humains (HMGS), le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et le milieu 254 ont été achetés auprès de Gibco. Le sérum de veau fœtal (FBS) a été acheté auprès de BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israël). Les anticorps primaires pour -actine, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, NRF2 et HO -1 ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology, un principal l'anticorps pour MITF a été acheté auprès du St John's Laboratory, un anticorps primaire pour p-MITF a été acheté auprès d'Affinity Biosciences, un anticorps primaire pour GAPDH a été acheté auprès de Bioworld et un anticorps primaire pour TRP1 a été acheté auprès d'EMD Millipore.

2.2|Culture cellulaire et traitement

Des cellules de mélanome de souris B16F10 ont été cultivées dans du milieu DMEM additionné de 10 % de FBS et d'un mélange antibiotique de pénicilline-streptomycine à 1 %. Des mélanocytes épidermiques humains (HEM) ont été séparés du prépuce humain (voir notre étude précédente) et cultivés dans un milieu 254 additionné de HMGS, de 5 % de FBS et d'un mélange d'antibiotiques pénicilline-streptomycine à 1 %. Toutes les cellules ont été cultivées dans un incubateur humide à 37 degrés avec 5 % de CO2. Le CDP a été dissous dans du DMSO et dilué avec le milieu avant utilisation, la concentration finale de DMSO était inférieure à 0,1 %. H2O2 a été dilué avec le milieu avant utilisation.

2.3|Culture et traitement du poisson zèbre

Les embryons et le milieu de poisson zèbre ont été achetés chez EzeRinka Biotech. Le protocole expérimental a été approuvé par le comité d'éthique de l'Université Central South. Les poissons zèbres ont été cultivés dans des plaques à puits 12- à 37 degrés de la lumière et traités avec différentes concentrations de CDP. Un microscope inversé a été utilisé pour observer et enregistrer quotidiennement les mélanines dans la tête et la queue du poisson zèbre. Après observation, nous avons changé de milieu et rajouté leCDP. La densité de mélanine dans les queues de poisson zèbre a été mesurée avec l'image J, et les valeurs sont présentées sous forme de densités optiques intégrées (IOD).

2.4|Viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide d'un test MTT. Pour étudier la cytotoxicité deCDP, des cellules HEM et B16F10 ont été implantées dans des plaques 96-puits à une densité de 2 × 103 cellules/puits et cultivées jusqu'à ce que les cellules soient attachées aux plaques. Les cellules ont ensuite été traitées avec différentes concentrations (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 et 320 ug/mL) deCDPpendant 24, 48 ou 72 heures. Avant la mesure, 20 μL de MTT ont été ajoutés à chaque puits et les plaques ont été incubées à 37 degrés pendant 4 heures. Après cela, nous avons jeté le surnageant et ajouté 160 μL de DMSO dans chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan. La valeur d'absorbance à 490 nm a été mesurée par un lecteur de plaque multimode (PerkinElmer). Pour étudier l'effet du CDP dans la condition de cytotoxicité induite par H2O2-, des cellules HEM et B16F10 ont été étalées dans des plaques à puits 96- à une densité de 4 × 103 cellules/puits. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations deCDP({{0}}, 20, 40 ou 80 ug/mL) pendant 24 heures, après quoi nous avons ajouté du H2O2 (concentrations finales : 500 μm pour les HEM et 1,0 mm pour les cellules B16F10) dans chaque puits et incubé les cellules pendant encore 24 heures. Nous avons mis en place des groupes traités au CDP et de contrôle négatif (NC). Les étapes de détection étaient les mêmes que celles décrites précédemment.

2.5|Dosage NaOH de la teneur en mélanine

Les cellules ont été cultivées dans des boîtes de Pétri de 100- mm et traitées avecCDPà différentes concentrations (0, 20, 40 et 80 ug/mL) pendant 48 heures, puis digérées avec de la trypsine et recueillies dans des tubes de 1,5-mL. Nous avons lavé les cellules deux fois avec de l'eau bidistillée, les avons remises en suspension dans 1 mL d'éthanol et les avons vortexées pour libérer la mélanine. Nous avons ensuite centrifugé (200 g, 5 minutes) le mélange et jeté le surnageant, ajouté 1 ml de DMSO à 10 % (dilué avec une solution de NaOH 1 mm) dans chaque tube et suspendu le sédiment. Nous avons incubé la suspension dans un bain-marie à 80 degrés pendant 1 heure pour dissoudre la mélanine. Enfin, nous avons transféré 200 μL du liquide dans une plaque à puits 96- et utilisé un lecteur de plaque multimode pour mesurer la valeur d'absorbance à 470 nm.

Cistanchecritiques : inhibemélanineproduction.

2.6|Mesures de l'activité tyrosinase

Les cellules ont été cultivées dans des boîtes de Petri de 100- mm et traitées avecCDPavant la mesure, digéré avec de la trypsine et collecté dans des tubes de 1.5-mL, et lavé deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Nous avons déplacé 106 cellules de chaque échantillon vers un nouveau tube et jeté le surnageant après centrifugation, puis ajouté 1 ml de 00,5 % de Triton X-100 au culot cellulaire et stocké le mélange à 0 degré pendant 15 minutes. Par la suite, nous avons ajouté 1 mL de l-dopa (1 mm, dilué avec du tampon phosphate 0.1 M) comme substrat et mélangé la solution, déplacé 200 μL du mélange vers un { {16}}plaque à puits immédiatement et mesuré la valeur d'absorbance (A0) à 475 nm à l'aide d'un lecteur de plaque multimode, en répétant la mesure à 10 minutes (A10). L'activité tyrosinase a été calculée par (A10-A0)/105, et les résultats sont exprimés en pourcentage (pourcentage) par rapport au contrôle négatif.

2.7|Coloration à la mélanine de Fontana-Masson

Les cellules ont été cultivées dans des plaques à puits 12- jusqu'à atteindre une densité de 50 %. Après traitement, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde neutre à 4 % pendant 30 minutes et lavées avec de l'eau distillée. Nous avons ensuite ajouté 500 μL de solution d'ammoniac-argent Fontana dans chaque puits et stocké les plaques dans l'obscurité pendant 16 heures pour teindre la mélanine. Ensuite, nous avons lavé les cellules avec de l'eau distillée cinq fois (1 minute à chaque fois) et les avons trempées dans 500 μL d'hyposulfite pendant 5 minutes ; enfin, nous avons éliminé l'hyposulfite et rincé à nouveau les cellules avec de l'eau distillée pendant 1 minute. Nous avons ensuite utilisé un microscope inversé pour observer et enregistrer les mélanines.

2.8|Extraction d'ARN et réaction quantitative en chaîne de la transcription inverse-polymérase

Les cellules ont été cultivées dans des plaques à puits 6-. Après traitement, les cellules ont été digérées avec de la trypsine et recueillies dans des tubes de 1,5-mL. Nous avons lavé les cellules deux fois avec du PBS, puis ajouté 1 ml de tampon de lyse, vortexé le mélange et placé les tubes sur de la glace pendant 5 minutes pour lyser complètement les cellules. L'ARN a été extrait à l'aide d'un kit d'ARN total (Omega Bio-Tek) et transcrit à l'envers (RT) à l'aide de ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). La transcription inverse quantitative-réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été réalisée à l'aide du KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). Le volume réactionnel du mélange RT était de 20 μL, tandis que le volume réactionnel du mélange PCR était de 20 μL (ADNc 1-8 μL, MIX 10 μL, amorce F 1 μL, amorce R 1 μL, ajouter DEPC H2O à 20 μL ). Les expériences ont été réalisées selon les protocoles. Les séquences des amorces sont répertoriées dans le tableau S1.

2.9|Extraction de protéines et Western blot/immunofluorescence

Les cellules ont été cultivées dans des boîtes de Pétri de 100- mm. Après traitement, les cellules ont été digérées avec de la trypsine et recueillies dans des tubes de 1,5-mL. Nous avons lavé les cellules deux fois avec du PBS, puis ajouté 500 μL de tampon de lyse RIPA (Thermo Fisher) additionné de 1 mm de fluorure de phénylméthylsulfonyle (Thermo Fisher) et d'un cocktail d'inhibiteurs de phosphatases dilué au 1:100 (Roche). La protéine nucléaire et cytoplasmique a été extraite à l'aide du kit d'extraction de protéines nucléoplasmiques selon le protocole du fabricant. Nous avons placé les tubes sur de la glace pendant 30 minutes et les avons vortexés toutes les 5 minutes pour lyser complètement les cellules. Nous avons centrifugé les cellules (200 g, 4 degrés, 15 minutes), déplacé le surnageant dans un nouveau tube et mesuré la concentration de protéines totales à l'aide d'un kit de dosage des protéines BCA (KeyGEN Biotec). Nous avons fait bouillir les protéines avec un tampon de chargement 5 × (Beyotime Biotec, Chine) à 100 degrés pendant 10 minutes, puis les avons stockées à -80 degrés. La méthode d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) a été utilisée dans le Western blot, et 20 ug de protéine de chaque groupe ont été séparés et transférés sur une membrane de fluorure de polyvinylidène. Après le blocage de l'antigène, nous avons incubé la membrane dans un anticorps primaire dilué au 1:1000 pendant 16 heures à 4 degrés, puis lavé la membrane avec du PBST et l'avons incubée dans 1 : 10 000 anticorps secondaire fluorescent dilué pendant 1 heure à 37 degrés . L'intensité de fluorescence a été détectée à l'aide d'un système d'imagerie Odyssey CLx (LI-COR). L'immunofluorescence a été réalisée à l'aide du kit de coloration par immunofluorescence (Alexa Fluor 488) avec une dilution au 1:100 de l'anticorps primaire.

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2.10|Mesure de l'apoptose cellulaire

Les cellules ont été cultivées dans des boîtes de Petri de {{0}} mm et traitées avec différentes concentrations (0, 20, 40 et 80 ug/mL) deCDPpendant 24 heures, et du H2O2 a été ajouté (concentrations finales : 500 μm pour les HEM, 1,0 mm pour les cellules B16F10) dans chaque puits et incubé pendant 24 heures supplémentaires. Nous avons également mis en place des groupes traités par CDP et NC. Après traitement, nous avons digéré les cellules avec de la trypsine sans EDTA et les avons collectées dans des tubes, puis lavé les cellules deux fois avec du PBS et les avons remises en suspension dans 100 μL de PBS. Les cellules ont été colorées avec un kit de détection d'apoptose Annexin V-FITC selon le protocole et détectées par cytométrie en flux (FCM). Le logiciel FlowJo a été utilisé pour analyser le taux d'apoptose.

2.11|Mesure des ROS intracellulaires

Les cellules ont été cultivées dans des plaques {{0}}puits et traitées avec différentes concentrations (0, 20, 40 et 80 ug/mL) deCDPpendant 24 heures, auquel nous avons ajouté du H2O2 (concentrations finales : 500 μm pour les HEM, 1,0 mm pour les cellules B16F10) dans chaque puits, les avons incubés pendant 24 heures supplémentaires et mis en place des groupes traités au CDP et NC. Après le traitement, nous avons lavé les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer tout le milieu et le FBS, puis avons dilué la sonde DCFH-DA à 1:1000 avec du milieu et l'avons ajoutée à chaque puits. Nous avons incubé les cellules à 37 degrés pendant 30 minutes et les avons lavées trois fois avec un milieu sans sérum. Nous avons utilisé unmicroscope à fluorescence inversé pour observer et enregistrer la fluorescence, puis utilisé ImageJ pour mesurer l'intensité de la fluorescence.

2.12|Statistiques et analyses

Les données de ce travail sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD), et l'analyse statistique a été effectuée à l'aide de GraphPad Prism (version 7.0) ou SPSS (version 22.0), et de Student's Le test t ou l'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) a été utilisé pour les comparaisons de groupes multiples. La valeur grise des bandes de protéines WB a été standardisée avec GAPDH ou -actine. Les valeurs de P < 0,05="" ont="" été="" considérées="" comme="" significatives.="" toutes="" les="" expériences="" ont="" été="" répétées="" au="" moins="" trois="">

3|RÉSULTATS

3.1|Mélanogenèse induite par le CDP dans les HEM et les cellules B16F10

Avant de commencer, nous avons utilisé le test MTT pour étudier la cytotoxicité potentielle du CDP sur les HEM et les cellules de mélanome de souris B16F10. Les cellules ont été traitées avecCDPà différentes concentrations pendant 24, 48 ou 72 heures. Les tests de viabilité HEM ont démontré que lorsque les concentrations étaient inférieures à 320 ug/mL, le CDP n'avait aucune influence sur la viabilité cellulaire ; cependant, la viabilité a diminué de manière significative lorsque la concentration a atteint 320 ug/mL à 24, 48 et 72 heures (P < 0,05="" ;="" figure="" 1a).="" la="" viabilité="" des="" cellules="" b16f10="" a="" également="" diminué="" à="" 48="" et="" 72="" heures="">CDPatteint 320 ug/mL (P < 0,01)="" mais="" aucun="" changement="" n'a="" été="" observé="" à="" des="" concentrations="" plus="" faibles="" (figure="" 1b).="" nous="" avons="" ensuite="" exploré="" de="" manière="" préliminaire="" le="" rôle="" du="" cdp="">mélanogénèseet a comparé ses effets à ceux de l'hormone stimulatrice des mélanocytes (-MSH ; concentrations : 20, 100 et 400 nm) et du DMSO (0,1 %) dans les HEM. Les résultats des tests de coloration de la mélanine, de l'activité de la tyrosinase et de la teneur en mélanine ont suggéré que le CDP était comparable à -MSH pour favoriser la mélanogenèse, tandis que le traitement à 0, 1% de DMSO ne faisait aucune différence (Figure S1).

Nous avons ensuite affiné notre exploration en conséquence. Les HEM ont été traités avecCDPà différentes concentrations (20, 40 et 80 ug/mL) pendant 48 heures ; la coloration de la mélanine, la teneur en mélanine et les tests d'activité de la tyrosinase ont été effectués, et tous ont montré des augmentations significatives après le traitement au CDP d'une manière dépendante de la concentration qui a culminé dans le groupe de 80 ug/mL (P < 0,05,="" figure="" 2a-c).="" nous="" avons="" ensuite="" mesuré="" les="" niveaux="" d'arnm="" et="" de="" protéines="">mélanogénèse- gènes apparentés (MITF, TYR, TRP1, TRP2, RAB27A et FSCN1). Le CDP a augmenté de manière significative les niveaux d'ARNm de ces gènes dans les HEM (P < 0,05 ;="" figure="" s2a).="" en="" outre,="" les="" niveaux="" de="" protéines="" mitf,="" tyr,="" trp1="" et="" rab27a="" ont="" augmenté,="" tout="" comme="" le="" rapport="" entre="" le="" mitf="" phosphorylé="" et="" le="" mitf="" total="" (p="">< 0,05),="" alors="" que="" trp2="" et="" fscn1="" n'ont="" montré="" aucune="" différence="" (figure="" 2d,e).="" les="" résultats="" ont="" indiqué="" que="" le="" cdp="" peut="" favoriser="" la="" mélanogénèse="" et="" réguler="" à="" la="" hausse="" l'expression="" des="" gènes="" liés="" à="" la="" mélanogénèse="" dans="" les="" mélanocytes="">

De plus, nous avons revérifié les effets deCDPà nouveau avec des cellules B16F10 et a constaté que la teneur en mélanine des cellules B16F10 augmentait de manière significative (P < 0,01 ;="" figure="" s2b).="" en="" outre,="" le="" cdp="" a="" augmenté="" de="" manière="" significative="" les="" niveaux="" d'arnm="">mélanogénèse-gènes liés (P < 0,05; Figure S2C), et les niveaux de protéines de MITF, TYR, TRP1, TRP2 et RAB27A ont également augmenté après le traitement au CDP (P < 0,05; Figure S2D-E).

FIGURE 1 La cytotoxicité du CDP dans les HEM et les cellules B16F10.

3.2|Le CDP a favorisé la mélanogénèse chez le poisson zèbre

Pour rechercher siCDPpourrait promouvoirmélanogénèsein vivo, nous avons utilisé des embryons de poisson zèbre. Les embryons de poisson zèbre ont été divisés en quatre groupes et traités en continu avec du milieu seul (NC) ou du CDP à différentes concentrations (20, 40 et 80 ug/mL) ; la densité et la distribution des granules de mélanine ont été observées et enregistrées chaque jour. Au fur et à mesure que les embryons de poisson zèbre grandissaient, nous avons constaté que la densité de mélanine augmentait progressivement dans les têtes et les queues. Le 3ème jour, les différences intergroupes étaient perceptibles, et la différence a continué d'augmenter jusqu'à ce que nous ayons terminé l'expérience le 6ème jour (Figure 3A). Nous avons utilisé l'image J pour mesurer la densité de mélanine dans les queues de poisson zèbre ; la densité de mélanine dans les groupes traités au CDP était significativement plus élevée que celle du groupe témoin (P < 0,05 ;="" figure="">

3.3|CDP a activé la voie du signal MAPK dans les HEM et les cellules B16F10

Révéler les mécanismes par lesquelsCDPpromumélanogénèse, nous avons traité les HEM avec du CDP à différentes concentrations (20, 40 et 80 ug/mL) pendant 48 heures, puis nous avons étudié les niveaux phosphorylés et totaux des protéines ERK, JNK et p38 dans la voie de signalisation MAPK. Comme mesuré par Western blot, les niveaux de p-ERK, p-JNK et p-p38 ont augmenté après le traitement CDP (P < 0,05),="" tandis="" que="" leurs="" niveaux="" totaux="" n'ont="" pas="" changé="" (figure="" 4a,="" b).="" les="" expériences="" ont="" été="" répétées="" avec="" des="" cellules="" b16f10="" et="" les="" niveaux="" phosphorylés="" des="" protéines="" erk,="" jnk="" et="" p38="" ont="" été="" augmentés="" (p="">< 0,05),="" mais="" les="" niveaux="" totaux="" de="" mapk="" n'ont="" pas="" changé="" (figure="" 4c,="" d),="" conformément="" aux="" résultats="" dans="" les="">

3.4|CDP atténue la cytotoxicité et l'apoptose induites par H2O2- dans les HEM et les cellules B16F10

Nous avons utilisé H2O2 pour simuler l'environnement de stress oxydatif et exploré plus avant le rôle du CDP dans les mélanocytes sous stress oxydatif. La concentration finale de H2O2 utilisée dans les HEM était de 500 μm, tandis que celle des cellules B16F10 était de 1,0 mm. Pour étudier l'effet du CDP sur la cytotoxicité induite par H2O2-, nous avons prétraité les cellules HEM et B16F10 avecCDPà différentes concentrations (20, 40 et 80 ug/mL) pendant 24 heures, puis ajouté H2O2 et continué à les traiter pendant 24 heures avant d'effectuer l'observation et le test MTT.

H2O2 a provoqué un gonflement apparent de la membrane et un rétrécissement cellulaire dans les HEM, dans les groupes prétraités au CDP, la situation a été atténuée. Le traitement avec CDP seul n'a eu aucun effet (figure 5A). Le test MTT a montré un résultat similaire en ce que le traitement H2O2 a diminué la viabilité HEM, alors que CDP a significativement amélioré cet impact nocif (P < 0,01)="" ;="" traitement="">CDPseul n'a fait aucune différence (figure 5C). Nous avons ensuite vérifié à nouveau l'effet protecteur dans les cellules B16F10. Le traitement au H2O2 a induit un gonflement apparent de la membrane et un rétrécissement cellulaire, tandis que la condition défavorable a également été améliorée par le CDP dans les cellules B16F10 (figure 5B). Pendant ce temps, le test MTT a montré que la viabilité des cellules B16F10 diminuait après le traitement au H2O2, mais la situation s'améliorait de manière significative dans les groupes prétraités au CDP (P < 0,05 ;="" figure="">

De plus, nous avons utilisé le FCM pour mesurer l'apoptose induite par H2O2- des HEM et des cellules B16F10. Les résultats ont montré que H2O2 provoquait une apoptose significative dans les HEM et les cellules B16F10, mais un prétraitement avecCDPà différentes concentrations pourrait réduire l'apoptose de manière significative ; sinon, le traitement CDP seul n'a fait aucune différence (Figure 5E, F). Le taux d'apoptose a augmenté après le traitement au H2O2 mais a diminué dans les groupes prétraités au CDP, le changement était significatif à la fois dans les HEM et les cellules B16F10 (P < 0,05,="" figure="" 5g,="">

FIGURE 2 Le CDP favorise la mélanogénèse dans les HEM.

3.5|ROS intracellulaires induites par H2O 2- piégées par le CDP dans les HEM et les cellules B16F10

Pour étudier les mécanismes deCDPpour diminuer la cytotoxicité et l'apoptose induites par H2O2-, nous avons en outre détecté les ROS intracellulaires dans les HEM et les cellules B16F10 à l'aide d'une sonde de fluorescence DCFH-DA. Les traitements étaient les mêmes que ceux décrits ci-dessus, l'intensité de fluorescence a été mesurée pour représenter le niveau de ROS. Comme nous l'avons observé dans les HEM, le traitement au H2O2 a été efficace pour élever les ROS, mais le CDP a significativement récupéré les ROS intracellulaires dans les groupes traités au H2O2- (P < 0,01 ;="" figure="" 6a,="" c) ;="" de="" plus,="" l'utilisation="" du="" cdp="" seul="" n'a="" fait="" aucune="" différence.="" nous="" avons="" reconfirmé="" les="" résultats="" dans="" les="" cellules="" b16f10.="" dans="" les="" cellules="" b16f10,="" le="" traitement="" au="" cdp="" seul="" n'a="" pas="" affecté="" le="" niveau="" de="" ros,="" alors="" que="" le="" traitement="" au="" h2o2="" a="" évidemment="" augmenté="" le="" niveau="" de="" ros,="" mais="" ce="" changement="" a="" également="" été="" significativement="" réduit="" par="" le="" prétraitement="" au="" cdp="" (p="">< 0,05 ;="" figure="" 6b,="">

3.6|Voie antioxydante NRF2/HO-1 régulée positivement par le CDP dans les mélanocytes

Pour révéler davantage les mécanismes par lesquels le CDP récupère les ROS, nous avons d'abord mesuré les niveaux de protéines de la voie antioxydante NRF2/HO-1 dans les cellules B16F10. Nous avons constaté que le traitement au CDP seul n'affectait pas de manière significative les protéines NRF2 et HO-1, mais dans les groupes traités à l'H2O2-, le niveau de ces deux protéines augmentait de manière significative, etCDPle prétraitement a encore amélioré l'élévation (p<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">CDPont montré quelques différences, car nous avons pu voir que la fluorescence dans le noyau était plus forte que celle dans le cytoplasme, et la distribution était proche à trois concentrations de CDP (figure 7C).

FIGURE 3 Le CDP favorise la mélanogénèse chez le poisson zèbre.

4|DISCUSSION ET CONCLUSIONS

Dans cette étude, nous avons étudié le rôle deCDPdans les HEM et les cellules B16F10. Pour la première fois, nous avons découvert que le CDP pouvait favoriser la mélanogénèse dans les mélanocytes et favoriser la pigmentation chez le poisson zèbre. Une expérience ultérieure a montré que la voie de signalisation MAPK était activée sous traitement CDP. Nous avons en outre étudié son rôle dansstress oxydatifet ont découvert que le CDP pouvait atténuer la cytotoxicité et l'apoptose induites par H2O2- dans les mélanocytes ; pendant ce temps, le CDP pourrait activer la voie antioxydante NRF2/HO-1 et piéger les ROS intracellulaires dans des conditions de stress oxydatif.

La protéine kinase activée par les mitogènes est une voie vitale impliquée dans la régulation du MITF, un facteur de transcription clé qui favorise l'expression demélanogénèse-gènes liés et affecte par la suite la synthèse et le transport de la mélanine.26,27 Dans notre étude, l'activation de ERK, JNK et p38 dans les mélanocytes a augmenté de manière significative après le traitement par CDP ; pendant ce temps, les expressions de MITF/p-MITF et de TYR, TRP1, TRP2 et RAB27A pilotées par MITF ont été régulées à la hausse en conséquence. Ainsi, nous suggérons que le CDP puisse promouvoirmélanogénèseen activant la voie MAPK, mais commentCDPactive les MAPK reste inconnue. Selon des études récentes, le récepteur toll-like 4 (TLR4) est fortement exprimé dans les mélanocytes et impliqué dansmélanogénèse.28,29 TLR4 est une protéine transmembranaire importante qui peut se lier spécifiquement au lipopolysaccharide (LPS)30 ; des études ont rapporté que le LPS peut induire la mélanogénèse.29 Fait intéressant, plusieurs polysaccharides extraits de plantes ou de champignons auraient activé les TLR et les voies de signalisation en aval telles que MAPK et le facteur nucléaire kappa bêta (NF-κB).31,32 Par conséquent, nous soupçonnons queCDPpeut être reconnu et lié par les TLR, puis active la voie de signalisation MAPK en aval et favorisemélanogénèse. De plus, les récepteurs de type domaine d'oligomérisation (NLR) se liant aux nucléotides sont connus pour reconnaître les ligands intracellulaires et piloter l'activation des voies de signalisation MAPK et NF-κB. et affecter les NLR.35,36 Ainsi, il est possible que le CDP puisse pénétrer dans les mélanocytes et réguler la voie de signalisation MAPK via les NLR. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour vérifier cette hypothèse.

Certaines études à ce jour ont rapporté l'application de polysaccharides à base de plantes dans la mélanogenèse pour inhiber la production de mélanine.37,38 Cependant, dans cette étude,CDPpromumélanogénèsedans les mélanocytes, et cet effet a été confirmé après comparaison avec -MSH. Le CDP est également une sorte de polysaccharide extrait d'herbes, nous soupçonnons que l'effet opposé du CDP peut être lié aux différences structurelles entre le CDP et les autres polysaccharides. Les polysaccharides sont formés par polymérisation de monosaccharides mais varient en type de monosaccharide, composition de monosaccharide, liaison glycosidique, structure de chaîne latérale et poids moléculaire39,40 ; on pense que ces facteurs déterminent leurs fonctions biologiques.41 Des études existantes ont proposé la structure deCDPet ont suggéré que la structure du CDP influence par la suite sa fonction.42 Ainsi, plus de preuves sont nécessaires pour bien comprendre le CDP et confirmer notre hypothèse.

Mélanogénèseest un mécanisme de protection important pour résister aux dommages causés par les ultraviolets et maintenir l'homéostasie du corps43 ; dans le même temps, les mélanocytes sont facilement exposés à des environnements défavorables tels que la surcharge en ROS.11 On sait que les ROS participent à la promotion de la mélanogénèse, l'un des mécanismes est l'activation des MAPK.44 Mais des études ont également révélé que cet effet n'existe qu'au sein d'un certain nombre de ROS. niveau, tandis que la surcharge ROS altèremélanogénèsede manière significative.45 La relation entre ROS, MAPK et la mélanogénèse est variable dans différentes conditions, ainsi, l'équilibre entre les systèmes pro- et anti-oxydants est évidemment important. Dans les maladies de dépigmentation telles que le vitiligo, un système antioxydant déséquilibré et une surcharge ROS incontrôlable endommageront les mélanocytes et diminueront la viabilité cellulaire.11,46 Dans cette étude, nous avons utilisé différentes concentrations de H2O2 pour simuler la surcharge ROS dans les cellules, et les HEM ont montré une moins bonne tolérance H2O2 que les cellules B16F10. Lorsque les mélanocytes ont été soumis à un traitement au H2O2, leur viabilité et leur taux d'apoptose se sont détériorés, mais un prétraitement au CDP pourrait partiellement inverser la tendance. Dans le même temps, ROS a été récupéré. Comme indiqué, l'activation de la voie antioxydante NRF2/ARE est une méthode majeure de piégeage des ROS dans les cellules cutanées.14 Dans nos expériences, les niveaux de protéines de NRF2 et HO-1 dans les mélanocytes ont été régulés positivement après un traitement H2O2 sans CDP ; cela signifie que H2O2-induitstress oxydatifpeut activer la voie NRF2/HO-1, mais elle est insuffisante pour maintenir un équilibre redox et protéger la cellule contre les blessures. Cependant, le prétraitement au CDP a amélioré la voie d'antioxydation NRF2/HO-1 et rétabli l'équilibre. Ainsi, nous suggérons que le CDP peut protéger les mélanocytes des lésions de stress oxydatif en activant la voie d'antioxydation NRF2/HO-1 et en piégeant les ROS.

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Nous avons trouvé queCDPle traitement seul n'a aucune influence sur les ROS ou NRF2/HO-1 dans les mélanocytes. Ce résultat suggère que le CDP peut affecter l'équilibre redox sousstress oxydatif, mais pas dans des conditions normales. De plus, la voie d'antioxydation NRF2/HO-1 serait régulée par les voies de signalisation PI3K, NF-κB et MAPK.47,48 Dans notre étude, le CDP a pu activer la voie de signalisation MAPK. Il est possible que CDP puisse activer la voie NRF2/HO-1 via des MAPK à régulation positive. Comme l'a rapporté Slominski, les mélanocytes sont des capteurs de stress impliqués dans un réseau de régulation, et leurs fonctions peuvent changer rapidement en réponse à l'environnement.49 Nous suggérons que le rôle du CDP est influencé par le statut des mélanocytes, il peut favorisermélanogénèsesans affecter le système antioxydant dans des conditions normales mais rétablir l'équilibre redox dans des conditions de stress oxydatif. Par conséquent, la fonction et la survie des mélanocytes peuvent être maintenues de deux manières différentes par le CDP. Le CDP aide les mélanocytes à maintenir l'homéostasie, qui est également une fonction importante demélanogénèse.50,51

En conclusion,CDPpeut favoriser la mélanogénèse des mélanocytes en activant la voie de signalisation MAPK. Le CDP peut améliorer la survie des mélanocytes en activant la voie antioxydante NRF2/HO-1 et en piégeant les ROS intracellulaires sousstress oxydatifles conditions. Nos conclusions sont significatives car elles démontrent que le CDP peut à la fois promouvoirmélanogénèseet protéger les mélanocytes des lésions de stress oxydatif, qui sont peut-être responsables du dysfonctionnement et de la perte de mélanocytes. Les résultats de cette étude indiquent que le CDP pourrait être un nouveau médicament dans le traitement des maladies de dépigmentation.