Abstrait

La présente invention divulgue unExtrait de Cistanche pour améliorer la densité minérale osseuse (DMO). Dans l'extrait, leteneur totale en échinacoside et actéoside (verbascoside)est>25% en poids. L'extrait est préparé en effectuantextraction à l'eau distilléedepoudre brute deCistanche tubuleuse, suivi defiltration, centrifugationdu filtrat,concentration, extraction liquide-liquide, concentration avec élimination des impuretés, dilution, post-traitement, et puisconcentration finale et séchagepour obtenir l'extrait de Cistanche.

 

 

Processus d'extraction de cistanche

Dans l'extrait de Cistanche pour améliorer la densité minérale osseuse selon l'invention, leteneur totale en échinacoside et actéosideest25 à 30 % en poids(à l'exclusion de 25 % en poids %), et l'extrait est également riche enacide shikimiqueainsi quecomposants de type acide phénylpropioniqueetcomposants de type alcaloïde, lui permettant deexercer de manière stable un effet d’amélioration de la densité osseuse.

 

Réclamations

1. Méthode de préparation

Procédé de préparation d'un extrait de Cistanche destiné à améliorer la densité minérale osseuse, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

écrasementCistanche tubuleusepour obtenir de la poudre brute deCistanche tubuleuse;

ajouter de l'eau distillée à la poudre brute deCistanche tubuleusepour l'extraction, la filtration, la centrifugation du filtrat et la concentration pour obtenir une solution concentrée deCistanche tubuleuse;

extraire la solution concentrée deCistanche tubuleuse, concentrer la phase d'extraction inférieure pour éliminer les impuretés, et diluer pour obtenir une solution de chargement ;

post-traitement de la solution de chargement, suivi d'une concentration et d'un séchage pour obtenir l'extrait de Cistanche.

2. Rapport matériau/eau

Procédé selon la revendication 1, dans lequel le rapport masse/volume de la poudre brute deCistanche tubuleuseà l'eau distillée est1 : (15–25).

3. Température d'extraction

Procédé selon la revendication 1, dans lequel la température d'extraction de l'eau distillée est60-100 degrés.

4. Rapport lors de l'extraction liquide-liquide

Procédé selon la revendication 1, dans lequel pendant l'extraction de la solution concentrée, le rapport volumique de la solution concentrée deCistanche tubuleuseau solvant d'extraction est1 : (1–5).

5. Solvant d'extraction

Procédé selon la revendication 4, dans lequel le solvant d'extraction comprend au moins l'un deséther de pétrole, acétate d'éthyle, n-hexane ou cyclohexane.

6. Processus de post-traitement

Procédé selon la revendication 1, dans lequel le post-traitement de la solution de chargement comprend : le passage de la solution de chargement à travers unrésine macroporeuse, puis éluant séquentiellement aveceau distilléeet unsolution d'éthanol.

7. volumes d'élution

Procédé selon la revendication 6, dans lequel le rapport volumique de l'eau distillée à la résine macroporeuse est(5–10) : 1, et le rapport volumique de la solution d'éthanol à la résine macroporeuse est(3–9) : 1.

8. L'extrait

Extrait de Cistanche pour améliorer la densité minérale osseuse, caractérisé en ce qu'il est préparé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.

9. Contenu des marqueurs actifs

Extrait de Cistanche selon la revendication 8, dans lequel la teneur totale en échinacoside et en actéoside est25 à 30 % en poids, à l'exclusion de 25 % en poids.

10. Demande

Utilisation de l'extrait de Cistanche selon l'une quelconque des revendications 8 à 9 pour préparer un produit destiné à améliorer la densité minérale osseuse, dans laquelle la concentration de l'extrait de Cistanche dans le produit est12,5 à 25 ug/mL.

 

Domaine technique

[0001] La présente invention concerne le domaine deformulations médicales, et concerne spécifiquement unExtrait de Cistanche pour améliorer la densité minérale osseuse, c'estméthode de préparation, etcandidatures.

Arrière-plan

[0002] Cistanche fait référence à la tige charnue séchée avec des feuilles écailleuses des plantes Orobanchaceae.Cistanche deserticola YC MaouCistanche tubuleuse (Schenk) Wight. Cistanche a de multiples activités telles querégulation immunitaire, anti-inflammatoire, anti-fatigue, antioxydant, neuroprotecteur, etsoutien du système reproducteur.

Glycosides phényléthanoïdes (PhG) - avecéchinacosideetActéoside (verbascoside)étant les principaux PhG de Cistanche, ils constituent des constituants importants.Échinacosideil a été démontré qu'elle avait un effet suraméliorer la densité minérale osseuse. Cependant, nous avons constaté que l'effet des extraits de Cistanche sur l'amélioration de la densité osseuse estpas uniquement corrélé à la teneur en échinacoside. Contrôler simplement la teneur en échinacosidene peut garantirque l'extrait serade manière stableexercer un effet d’amélioration de la densité osseuse. Il est donc crucial de développer un extrait de Cistanche et une méthode de préparation qui puissede manière stableoffrent l’effet souhaité de soutien à la densité osseuse.

[0003] Demande de brevet d'invention chinoiseCN102441040Adécrit un procédé de préparation de glycosides phényléthanoïdes totaux à partir de Cistanche par pulvérisation, extraction, adsorption de résine macroporeuse, élution, concentration, etc. Dans des conditions faiblement acides (pH 2-4), la stabilité des glycosides phényléthanoïdes de Cistanche est significativement améliorée, et les glycosides totaux résultants contiennent de l'échinacoside et de l'actéoside dans une proportion combinée > 90 %. Toutefois, il ne vérifie pas si le produit peutde manière stableaméliorer la densité minérale osseuse.

Demande de brevet d'invention chinoiseCN105111255Adécrit un procédé d'extraction et de séparation de l'échinacoside et de l'acteoside de Cistanche, utilisant 75 % d'éthanol comme solvant d'extraction, AB-8 résine macroporeuse comme matériau de remplissage et une élution à 55 % d'éthanol, donnant un extrait de Cistanche avec de l'échinacoside > 25 %, de l'acteoside > 10 % et des PhG totales > 80 %. Cependant, il se peut que cela ne garantisse toujours pas unécurieeffet améliorant la densité osseuse.

 

Résumé de l'invention

[0004] Développer un extrait de Cistanche et une méthode de préparation qui peuventde manière stablesoutenir une densité minérale osseuse améliorée, l'invention propose :

Premier aspect : méthode de préparation

Procédé de préparation d'un extrait de Cistanche pour améliorer la densité minérale osseuse, comprenant :

écrasementCistanche tubuleuseobtenir de la poudre brute;

extraire la poudre brute avec de l'eau distillée, filtrer, centrifuger et concentrer pour obtenir une solution concentrée ;

effectuer une extraction ; concentrer la phase inférieure pour éliminer les impuretés ; diluer pour obtenir une solution de chargement ;

post-traiter la solution de chargement, concentrer et sécher pour obtenir l'extrait de Cistanche.

[0005] Dans un mode de réalisation, la poudre brute passe à travers un40 maillestamis.

Dans un mode de réalisation, le rapport masse/volume de la poudre brute à l'eau distillée est1 : (15–25).

[0007] Dans un mode de réalisation, le rapport masse sur volume est1 : 20.

[0008] Dans un mode de réalisation, la température d'extraction est60-100 degrés.

[0009] Dans un mode de réalisation, la température d'extraction est80 degrés.

[0010] Dans un mode de réalisation, l'extraction est effectuée1 à 2 fois, 1 heure à chaque fois.

[0011] Dans un mode de réalisation, la filtration est réalisée à travers un80 maillesfiltre.

[0012] Dans un mode de réalisation, la vitesse de centrifugation est3 000 à 4 000 tr/minet le temps est3 à 9 minutes.

[0013] Dans un mode de réalisation, la vitesse de centrifugation est3500 tr/minet le temps est5 min.

[0014] Dans un mode de réalisation, après centrifugation, le filtrat est concentré à70 degrésà18%–28%du volume initial.

Dans un mode de réalisation, lors de l'extraction de la solution concentrée, le rapport volumique de la solution concentrée au solvant d'extraction est1 : (1–5).

[0016] Dans un mode de réalisation, le rapport est1 : 3.

[0017] Dans un mode de réalisation, le solvant d'extraction comprend au moins l'un deséther de pétrole, acétate d'éthyle, n-hexane ou cyclohexane.

[0018] Dans un mode de réalisation, l'extraction est effectuée séquentiellement en utilisantéther de pétrolesuivi deacétate d'éthyle.

Dans un mode de réalisation, « concentration avec élimination des impuretés » signifie concentrer la phase d'extraction inférieure en une pâte, la dissoudre dans300 ml d'éthanol aqueux à 50 % en poidspour éliminer les impuretés et s'adapter à1,0 à 1,5 g d'herbe brute par mlcomme solution de chargement.

[0020] Dans un mode de réalisation, la concentration de la solution de chargement est1,0 à 1,5 g d'herbe brute/mL d'eau.

Dans un mode de réalisation, le post-traitement comprend le passage de la solution de chargement à traversrésine macroporeuse, puis éluant séquentiellement aveceau distilléeet unsolution d'éthanol.

Dans un mode de réalisation, le débit de chargement à travers la résine macroporeuse est1 à 5 ml/min.

[0023] Dans un mode de réalisation, la résine estAB-8 résine macroporeuseavec un volume de résine de0.93 L.

Dans un mode de réalisation, le rapport volumique de l'eau distillée à la résine est(5–10) : 1, et le rapport volumique de la solution d'éthanol à la résine est(3–9) : 1.

Dans un mode de réalisation, le rapport volumique de l'eau distillée à la résine est7 : 1, et le rapport entre la solution d'éthanol et la résine est6 : 1.

[0026] Dans un mode de réalisation, la solution d'éthanol est80 % (p/p) d'éthanol aqueux.

Deuxième aspect : l'extrait

L'invention propose en outre un extrait de Cistanche préparé par le procédé ci-dessus.

Dans un mode de réalisation, la teneur totale en échinacoside et en actéoside est25 à 30 % en poids, à l'exclusion de 25 % en poids.

Troisième aspect : utilisation

L'invention propose en outre l'utilisation de l'extrait de Cistanche dans la préparation de produits destinés à améliorer la densité minérale osseuse, la concentration de l'extrait dans le produit étant de12,5 à 25 ug/mL.

 

Avantages / Effets bénéfiques

[0030] Par rapport à l'art antérieur, l'invention présente les effets bénéfiques suivants :

L'extrait de Cistanche contient25 à 30 % en poidséchinacoside et actéoside totaux, et est riche enacide shikimique, composants de type acide phénylpropionique, alcaloïdes, etacides gras, lui permettant dede manière stablesoutenir l’amélioration de la densité minérale osseuse.

Au sein du12,5 à 25 ug/mLplage de concentration, l'extrait favorise la prolifération desMC3T3-E1cellules avec d’excellents effets prolifératifs.

L'extrait montre la même tendance liée à la dose en favorisant la prolifération cellulaire etActivité ALP, et peut promouvoir de manière stable la prolifération et la différenciation. En favorisant la minéralisation des ostéoblastes, il montre un meilleur effet que le contrôle positif17 -estradiol.

L'extrait stimule les facteurs de transcription spécifiques aux ostéoblastesExécuterx2etOsx, améliore la différenciation des ostéoblastes et favorise l'expression de marqueurs ostéogéniquesOPNetOCN, favorisant ainsi la formation osseuse. Cela augmente égalementARNm Bmp2expression pour améliorer la différenciation des ostéoblastes et la formation de nouveaux os en activant leVoie BMP/Smad; en outre, en réglementantARNm Lrp5, ARNm Lrp6, etARNm Wnt3, il activeSignalisation Wnt/-caténine, affecte l'expression des facteurs de transcription en aval et favorise la différenciation des ostéoblastes et la formation osseuse.

Le procédé de préparation donne un extrait contenant des glycosides phényléthanoïdes (échinacoside et actéoside), de l'acide shikimique et des acides phénylpropioniques, des alcaloïdes et des acides gras. Ensemble, ces composants permettent à l'extrait de présenter une dépendance constante à la dose en matière de prolifération, de différenciation et de minéralisation, permettant ainsi des effets stables de soutien à la densité osseuse.

 

Brève description des dessins

[0035] Fig. 1 : Effet de l'extrait (Exemple 1) sur la prolifération des cellules MC3T3-E1
Fig. 2 : Effet de l'extrait (Exemple 2) sur la prolifération des cellules MC3T3-E1
Fig. 3 : Effet de l'extrait (Exemple 3) sur la prolifération cellulaire MC3T3-E1
Fig. 4 : Effet de l'extrait (exemple 1) sur l'activité ALP
Fig. 5 : Effet de l'extrait (exemple 2) sur l'activité ALP
Fig. 6 : Effet de l'extrait (exemple 3) sur l'activité ALP
Fig . 7 : Photos de coloration au rouge alizarine de la minéralisation des ostéoblastes (exemple 2)
Fig. 8 : Résultats quantitatifs de la minéralisation des ostéoblastes (Exemple 2)
Fig. 9–12 : Effets de l'exemple 2 sur l'expression des ARNm de Runx2, Osx, Opn, Ocn
Fig. 13 : Effet de l'exemple 2 sur l'expression de l'ARNm de Bmp2 (BMP/Smad)
Fig. 14–16 : Effets de l'exemple 2 sur l'expression de l'ARNm de Lrp5, Wnt3, Lrp6 (Wnt/ -caténine)
Fig. 17–18 : Effets de l'exemple 2 sur l'expression des protéines Osx et RUNX2

 

Description détaillée/modes de réalisation

Exemple 1

[0036] Un procédé de préparation comprend :

écrasementCistanche tubuleuse, en passant au tamis de 40 mailles pour obtenir200 gpoudre brute;

extraire aveceau distillée à 5× masse(comme décrit), en extrayant à75 degréspour2 fois, 1h chacun, en se concentrant sur70 degrésà un rapport de concentration de1 : 2.2obtenir une solution concentrée;

ajouter de l'éthanol absolu à la solution concentrée pour une précipitation graduée de l'éthanol avec des concentrations massiques finales d'éthanol de20%, 40%, 60%, 80%, précipitant à5 degrés pendant 24 h, en récupérant le surnageant après80% en poidsprécipitation à l'éthanol;

concentrer et sécher à70 degréspour obtenir l'extrait de Cistanche, avec un rendement de20.75%.

Exemple 2

[0037] Un procédé de préparation comprend :

écrasementCistanche tubuleuseobtenir240 gpoudre brute;

extraire avec de l'eau distillée, filtrer, centrifuger et concentrer pour obtenir une solution concentrée ;

extraire la solution concentrée ; concentrer la phase inférieure pour éliminer les impuretés ; diluer pour obtenir une solution de chargement ;

post-traiter la solution de chargement ; concentrer et sécher à70 degréspour obtenir l'extrait, avec un rendement de19.69%.

[0038] La poudre brute passe à travers un tamis de 40 mesh.
Le rapport masse/volume de la poudre brute à l'eau distillée est1 : 20.
[0040] La température d'extraction est80 degrés.
[0041] L'extraction est effectuée1 à 2 fois, 1h chacun.
[0042] La filtration se fait à travers un80 maillesfiltre.
[0043] La centrifugation est3500 tr/min pendant 5 min.
[0044] Concentration après centrifugation : concentrer à70 degrésà20%du volume initial.
[0045] Lors de l'extraction, le rapport volumique de la solution concentrée au solvant est de1 : 3.
[0046] L'extraction est effectuée séquentiellement avecéther de pétroleetacétate d'éthyle.
La phase inférieure est concentrée en une pâte et dissoute dans300 ml d'éthanol aqueux à 50 % en poidspour éliminer les impuretés.
[0048] Concentration de la solution de chargement :1,0 g d'herbe brute/mL d'eau.
Post-traitement : passer sur résine macroporeuse, éluer avec de l'eau distillée puis une solution éthanolique.
[0050] Débit à travers la résine :3 ml/min.
[0051] Résine :AB-8, volume de résine0.93 L.
[0052] Rapport volumique eau distillée/résine :7 : 1. Rapport solution éthanol/résine :6 : 1.
Solution éthanolique :80% (w/w)éthanol aqueux.

 

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Exemple 3

[0053] Un procédé de préparation comprend :

écrasementCistanche tubuleuse, en passant au tamis de 40 mailles pour obtenir120 gpoudre brute;

extraire avec12× massede50 % en poids d'éthanol aqueux, extrayant à70 degrés, 2 fois, 1h chacun, en se concentrant sur70 degrésà un rapport de1 : 2.5obtenir une solution concentrée;

ajouter de l'eau pour ajuster la concentration à0,2 g d'herbe brute/mL d'eau, centrifugation à3500 tr/min pendant 5 min, en prenant le surnageant comme solution de chargement ;

en passant par une résine macroporeuse ; éluer séquentiellement avec de l'eau distillée et une solution d'éthanol ; recueillir l'élution éthanolique et concentrer/sécher à70 degréspour obtenir l'extrait avec un rendement de24.30%.

[0054] Résine :HPD750, volume de résine0.93 L.
[0055] Rapport eau distillée/résine :3 : 1. Rapport solution éthanol/résine :4 : 1.
Solution d'éthanol :30% (w/w)éthanol aqueux.

 

Tests de performances

1.1 Test de prolifération cellulaire

Les ostéoblastes sont les principales cellules fonctionnelles responsables de la formation osseuse, impliquant la prolifération des pré-ostéoblastes, la production de matrice osseuse et la différenciation finale. LeMC3T3-E1la lignée cellulaire est couramment utilisée pour étudier l’activité ostéogénique. La différenciation des ostéoblastes implique une prolifération, une différenciation et une minéralisation qui se manifestent par une augmentation du nombre de pré-ostéoblastes, une maturation en ostéoblastes et la formation d'une nouvelle matrice osseuse.

Phosphatase alcaline (ALP)est une protéine liée au phénotype des ostéoblastes, détectable lors de la prolifération cellulaire et de la maturation matricielle, et constitue un marqueur précoce couramment utilisé de la différenciation des ostéoblastes.

Par conséquent, en évaluant la prolifération de MC3T3-E1 et l'activité de l'ALP, l'activité favorisant l'ostéogenèse des extraits préparés dans les exemples 1 à 3 a été comparée.

Les cellules MC3T3-E1 ont été réactivées et passées. Après stabilisation, les cellules ont été digérées, centrifugées et collectées. La densité cellulaire a été ajustée de manière à ce que chaque 100 µL contienne 5 × 1035 × 10 ^ 35 × 103 cellules et a été ensemencée dans une plaque à 96 puits. Après une nuit de culture, le milieu a été remplacé par un milieu complet contenant les extraits des exemples 1 à 3 à des concentrations de6,25, 12,5, 25 et 50 ug/mL, ou contenant0,1 méstradiol(témoin positif), ou milieu seul (témoin à blanc) et cultivé pour48 h. Dans des conditions à l'abri de la lumière, une solution mère de MTT (10 à 20 % du volume du puits) a été ajoutée, incubée pendant4 hdans un incubateur à CO₂, milieu retiré, et200 μL de DMSOajouté pour dissoudre le formazan. Les valeurs de DO ont été mesurées à490 nm.

Résultats : Fig. 1 (Exemple 1), Fig. 2 (Exemple 2), Fig. 3 (Exemple 3).

Taux de prolifération cellulaire (%)=OD (Exemple 1 à 3) - OD (Vide) OD (Vide) × 100 %\\frac{OD(\\text{Exemple 1 à 3}) - OD(\\text{Vide})}{OD(\\text{Vide})} \\times 100\\%OD(Vide)OD(Exemple 1–3)−OD(Vide)​×100 %

Comme le montre la figure . 1-3, le contrôle positif a favorisé la prolifération de MC3T3-E1. L'exemple 1 a favorisé la prolifération à 6,25, 12,5 et 25 ug/mL ; le taux de prolifération à 12,5 ug/mL était 1,4 fois supérieur à celui du contrôle positif, mais sans différence significative (P > 0,05). L'exemple 2 a favorisé la prolifération à 6,25, 12,5, 25 et 50 ug/mL ; à 12,5, 25 et 50 ug/mL, ses effets étaient supérieurs à ceux du contrôle positif (P < 0,01 ou P < 0,001), avec des taux de prolifération de 2,55 ×, 3,46 × et 2,59 × du contrôle positif. L'exemple 3 a favorisé la prolifération à 6,25, 12,5, 25 et 50 ug/mL ; à 12,5, 25 et 50 ug/mL, il était supérieur au contrôle positif (P < 0,01 ou P < 0,001), avec des taux de prolifération de 1,40×, 1,76× et 0,93× du contrôle positif. Cela indique que l'exemple 2 a eu le meilleur effet sur la promotion de la prolifération de MC3T3-E1.

1.2 Test d’activité ALP

L'activité ALP a été mesurée en utilisant un kit de test ALP. La concentration stock de p-nitrophénol était de 10 mM et les concentrations de la courbe standard étaient de 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 et 0,25 mM, préparées par dilution en gradient avec un tampon de détection.

Pour chaque puits d'échantillon dans une plaque à 96 puits, 49 μL de tampon de détection, 1 μL de protéine extraite des cellules MC3T3-E1 traitées (de la section 1.1) et 50 μL de substrat chromogène (ajouté en dernier) ont été ajoutés. La réaction s'est déroulée pendant 30 min dans l'incubateur à l'abri de la lumière, terminée par l'ajout de 100 µL de solution d'arrêt et l'absorbance mesurée à405 nm. L'activité ALP a été calculée à partir de la courbe standard.

Résultats : Fig. 4 (Exemple 1), Fig. 5 (Exemple 2), Fig. 6 (Exemple 3).

Activité ALP (U/L)=(concentration molaire relative de protéine) × 1000 × 100/30
(1 000 pour la conversion des unités molaires ; 100 pour le volume réactionnel total ; 30 pour un temps de réaction de 30 minutes)

ALP est un marqueur précoce de la différenciation MC3T3-E1. Les figures . 4–6 montrent que le contrôle positif a augmenté l'activité de la PAL. L'exemple 1 n'a pas favorisé l'activité ALP. L'exemple 2 a augmenté l'activité de l'ALP à 12,5, 25 et 50 ug/mL ; à 25 et 50 ug/mL, les différences par rapport au blanc étaient significatives (P < 0,01). L'exemple 3 a augmenté l'activité de l'ALP à 12,5 et 25 ug/mL (P < 0,001), mais avec l'augmentation de la concentration, l'amélioration a diminué. Cela indique que seuls les exemples 2 et 3 ont augmenté l'activité de l'ALP et pris en charge la différenciation.

Dans l'ensemble, seul l'exemple 2 a montré une corrélation dose-positive à la fois dans la prolifération de MC3T3-E1 et dans l'activité de l'ALP à 12,5 et 25 ug/mL. L'exemple 3 a montré une corrélation dose-positive pour la prolifération mais une corrélation dose-négative pour l'ALP. Comparativement, l'exemple 2 est plus adapté pour améliorer la densité minérale osseuse.

1.3 Minéralisation (coloration au rouge alizarine) de l'exemple 2

Puisque l'exemple 2 a montré la meilleure corrélation d'activité et de dose par rapport aux exemples 1 et 3, des expériences de minéralisation ont été menées pour évaluer davantage son effet.

Les cellules MC3T3-E1 ont été traitées après 72 h de culture avec l'extrait de l'exemple 2 à12,5, 25 et 50 ug/mL, incubé à 37 degrés pendant14 days(basé sur la formation de nodules de calcium), avec des changements de milieu tous les 2 jours. La coloration au rouge alizarine a été réalisée : le milieu a été retiré, les cellules ont été fixées avec du formol neutre à 10 % (300 μL/puits) pendant 30 min, rincées, colorées avec 0,1 % de rouge alizarine (300 μl/puits) pendant 30 min (à température ambiante, à l'abri de la lumière) et lavées jusqu'à ce qu'il ne reste plus de couleur rouge. Des images ont été prises. Ensuite, une solution à 10 % de chlorure de cétylpyridinium (400 µL/puits) a été ajoutée et agitée pendant 1 h pour dissoudre les nodules calcifiés. La solution dissoute a été transférée dans une plaque à 96 puits (100 µL/puits) et la DO mesurée à562 nmpour calculer le taux de minéralisation. Photos : Fig. 7 ; résultats quantitatifs : Fig. 8.

Taux de minéralisation (%)=OD (Exemple 2) - OD (Vierge) OD (Vide) × 100%\\frac{OD(\\text{Exemple 2}) - OD(\\text{Vierge})}{OD(\\text{Vide})} \\times 100\\%OD(Vierge)OD(Exemple 2)−OD(Vide)​×100%

La figure . 7 montre que le nombre de nodules de calcium a augmenté séquentiellement avec la concentration par rapport au blanc. La figure . 8 indique que l'exemple 2 a favorisé la minéralisation de manière dépendante de la concentration à 12,5, 25 et 50 ug/mL, avec l'effet le plus fort à 50 ug/mL, nettement meilleur que le contrôle positif (P < 0,001). Étant donné que les nodules minéralisés représentent l'étape finale de la différenciation des ostéoblastes, ces résultats confirment en outre l'effet de soutien de la densité osseuse de l'exemple 2 et démontrent son activité stable. L'exemple 2 était supérieur à l'estradiol, ce qui indique une valeur potentielle pour les produits de santé osseuse.

Expression génétique et mécanisme de voie (exemple 2)

L'extrait de l'exemple 2 (12,5, 25, 50 ug/mL) a été appliqué à des cellules MC3T3-E1 pendant 3 jours. L'extraction, la quantification, la transcription inverse de l'ARN (système de 20 μL ; entrée d'ARN de 800 ng) et la qRT-PCR ont été réalisées pour quantifier les niveaux d'expression relatifs deARNm Runx2, ARNm Osx, ARNm Opn et ARNm Ocn. Résultats : Fig. 9–12.

Runx2 et Osx sont des régulateurs clés en aval dans la signalisation BMP, induisant la différenciation des ostéoblastes. Runx2 est important au début de l'engagement, tandis qu'Osx fonctionne dans la différenciation des terminaux. OPN et OCN sont des indicateurs importants de l'activité des ostéoblastes et de la minéralisation des tissus. Les figures . 9–12 montrent que l'exemple 2 a augmenté l'expression relative de ces marqueurs, favorisant ainsi la différenciation des ostéoblastes et la formation osseuse.

[0069] Exemple 2 régulé positivementARNm Bmp2(Fig. 13), indiquant l'activation duVoie BMP/Smad, qui favorise la différenciation des ostéoblastes et la formation de nouveaux os.

L'exemple 2 a augmenté l'expression relative deARNm Lrp5, ARNm Lrp6 et ARNm Wnt3(Fig. 14–16), prenant en charge l'activation deSignalisation Wnt/-caténine, qui est étroitement liée à la prolifération, à la différenciation et à la formation osseuse des ostéoblastes.

Expression des protéines (exemple 2)

L'analyse par Western blot a montré que l'exemple 2 augmentaitOsxetRUNX2expression protéique (Fig. 17–18), indiquant une régulation aux niveaux transcriptionnel et traductionnel pour favoriser la différenciation des ostéoblastes.

Ces tests d'activité montrent que l'exemple 2 a fourni le meilleur effet favorisant la prolifération et était le seul avec une corrélation de dose constante pour la prolifération et l'ALP. L'exemple 2 était également supérieur à l'estradiol pour favoriser la prolifération et la minéralisation de MC3T3-E1, avec des effets de différenciation comparables, suggérant un potentiel optimal de soutien de la densité osseuse.

 

Test de composition chimique

6.1 Teneur en glycosides phényléthanoïdes

En référence à la méthode de test « Cistanche » dans la Pharmacopée chinoise, les teneurs en échinacoside et en actéoside dans les exemples 1 à 3 ont été mesurées (résultats présentés dans le tableau 1). Sur la base de l'échinacoside, de l'acteoside et des PhG totaux, la tendance était cohérente : Exemple 3 > Exemple 1 > Exemple 2, et l'acteoside dans l'exemple 3 était 3,85 × et 4,27 × celui des exemples 1 et 2, respectivement. La combinaison des résultats d'activité et de contenu indique que l'échinacoside et l'actéoside seuls ne déterminent pas directement les effets ostéogéniques.

 

Tableau 1. Contenu en échinacoside et en actéoside dans les extraits de cistanche (%)

Échantillon (exemple)	Échinacoside (%)	Actéoside / Verbascoside (%)	Total (%)
Exemple 1	28.68	1.63	30.31
Exemple 2	26.27	1.47	27.74
Exemple 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Autres composants (UPLC/Q-TOF/MS)

UPLC/Q-TOF/MS a été utilisé pour comparer les composants chimiques parmi les exemples 1 à 3. Les valeurs de réponse sont présentées dans le tableau 2.

[0079] Outre l'échinacoside et l'actéoside, l'exemple 2 contenait descomposants de type acide shikimique et acide phénylpropionique, et aussialcaloïdes. Comparé aux exemples 1 et 3, l'exemple 2 contenait 11 composants liés à l'acide phénylpropionique/shikimique avec les réponses les plus élevées, notamment :

Tableau 2. Valeurs de réponse UPLC/Q-TOF/MS des composants clés dans les extraits de Cistanche (exemples 1 à 3)

Nom : 原表为"响应值(response value)" ;Acide shikimique et dérivés de l'acide phénylpropionique(莽草酸及苯丙酸类)与 Alcaloïdes(生物碱).

A. Dérivés de l'acide shikimique et de l'acide phénylpropionique

Composé	Exemple 1	Exemple 2	Exemple 3
Acide isodanphénolique B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Acide p-hydroxyphénylpropionique (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Acide shikimique (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
Acide (2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-carboxy-2-(3,4-dihydroxyphényl)éthoxy]carbonyl-2-(3,4-dihydroxyphényl)-7-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-énoyl]oxy-3-(3,4-dihydroxyphényl)propanoïque	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Benzoylacétone (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinorésinol 4′-O- -D-glucoside (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Glycoside Yangmei Changshan* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
Acide 3,4-diméthylbenzoïque (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxytétrahydropyran-2-yl]oxyméthyl]tétrahydropyran-2-yl]oxychromène-2-one	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

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B. Alcaloïdes

Composé	Exemple 1	Exemple 2	Exemple 3
Verticine (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihydrocoptisine (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
Thymine (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsémine (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

acide isodanphénolique B,

acide p-hydroxyphénylpropionique,

acide (2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-carboxy-2-(3,4-dihydroxyphényl)éthoxy]carbonyl-2-(3,4-dihydroxyphényl)-7-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-énoyl]oxy-3-(3,4-dihydroxyphényl)propanoïque,

la benzoylacétone,

épipinorésinol 4′-O- -D-glucoside,

glycoside lié à la myricétine (comme indiqué),

jionoside A1,

acide 3,4-diméthylbenzoïque,

Robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxytétrahydropyran-2-yl]oxyméthyl]tétrahydropyran-2-yl]oxychromène-2-one.

Il contenait également 5 alcaloïdes, dont :

verticine,

dihydrocoptisine (comme indiqué),

la thymine,

alcaloïde lié à la gelsémine (comme indiqué),

yohimbine.

Sur la base des résultats comparatifs de l'activité de prolifération/ALP, des dosages des glycosides phényléthanoïdes et du profilage chimique, on peut conclure que les glycosides phényléthanoïdes (échinacoside et acéoside), les acides shikimique/phénylpropionique, les alcaloïdes et les terpénoïdes constituent conjointement la composition spécifique de l'extrait de l'exemple 2, produisant une dépendance à la dose constante (12,5 à 25 ug/mL) tout au long de la prolifération. la différenciation et la minéralisation, permettant des effets stables de soutien à la densité osseuse.

Tableau 2 : valeurs de réponse des composants.
L'invention, grâce au procédé de l'exemple 2, fournit un extrait de Cistanche avec un total d'échinacoside + actéoside > 25 % et des acides et alcaloïdes shikimiques/phénylpropioniques enrichis, permettant des effets stables de soutien de la densité osseuse. Dans une plage de 12,5 à 25 ug/mL, il favorise la prolifération, la différenciation et la minéralisation du MC3T3-E1 de manière à augmenter la dose avec une corrélation de dose constante, favorisant des résultats meilleurs et plus stables en matière de santé osseuse et permettant une utilisation dans des produits liés à l'amélioration de la densité minérale osseuse.