Abstrait

Objectif:La formule hypoglycémiante-lipidique (HLF) à base de Cistanche a montré une efficacité significative dans l'amélioration des troubles du métabolisme du glucose et des lipides. Cependant, ses mécanismes d’action spécifiques restent flous. Cette étude visait à explorer les cibles et les mécanismes potentiels du HLF dans l'amélioration des troubles métaboliques des glucolipides grâce à la pharmacologie de réseau, à l'amarrage moléculaire, aux simulations de dynamique moléculaire (MD) et à la validation expérimentale.

Méthodes :
Les cibles associées aux troubles métaboliques des glucolipides ont été extraites de la base de données GeneCards. Les cibles d'action des principaux composants actifs du HLF ont été obtenues à partir des bases de données CTD et SwissTargetPrediction. La base de données STRING et le logiciel Cytoscape ont été utilisés pour construire des réseaux d'interaction protéine-protéine (IPP). Après avoir identifié des cibles clés potentielles, des analyses d'enrichissement de Gene Ontology (GO) et de l'Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG) ont été effectuées via la base de données Metascape, et un réseau de « voie de cible composée » a été construit. L'amarrage moléculaire a été réalisé à l'aide d'AutoDock et de PyMOL pour vérifier les interactions entre les composants principaux et les cibles principales. Des simulations MD ont ensuite été réalisées sur les meilleurs complexes protéine-ligand identifiés lors du docking. Un modèle murin de troubles métaboliques des glucolipides a été établi pourin vivovalidation des résultats de pharmacologie du réseau.

Résultats:
L'analyse topologique du réseau PPI a identifié 10 cibles principales : TNF, CTNNB1, AKT1, NF-κB1, ESR1, FN1, TP53, IL-1, IL-6 et EGFR. L'enrichissement en GO a montré que ces cibles étaient principalement impliquées dans la transduction du signal et la régulation transcriptionnelle. L'analyse de la voie KEGG a révélé une association significative avec les voies des lipides et de l'athérosclérose. L'amarrage moléculaire a confirmé des affinités de liaison favorables entre les composants principaux du HLF (par exemple, la lovastatine, la coptisine, l'acide salvianolique B) et des cibles telles que AKT1, FN1 et IL-6. Les simulations MD ont en outre démontré des interactions stables, en particulier entre AKT1 et des composés comme la lovastatine, la coptisine et l'acide salvianolique B. Des expériences sur des animaux ont indiqué que le HLF peut exercer des effets thérapeutiques en régulant négativement l'expression de AKT1, TP53, FN1 et EGFR, en supprimant les facteurs inflammatoires tels que IL-1 et IL-6, et en régulant positivement CTNNB1 et ESR1. Ces changements ont entraîné une amélioration des taux de glycémie et de lipides chez les souris modèles.

Conclusion:
Le HLF peut réguler le métabolisme du glucose et des lipides et améliorer les lésions athéroscléreuses en ciblant les voies liées aux lipides et à l'athérosclérose. Elle propose une stratégie thérapeutique globale pour prévenir et traiter les troubles métaboliques et leurs complications.

Mots-clés :
Formule à base de cistanche; Trouble métabolique des glucolipides; Pharmacologie de réseau ; Amarrage moléculaire ; Simulation de dynamique moléculaire ;Voie lipidique et athérosclérose

 

 

 

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1. Présentation

Les troubles métaboliques des glucolipides sont devenus un problème de santé publique majeur dans le monde entier. En 2021, la prévalence mondiale du diabète a atteint environ 529 millions, avec des projections indiquant plus de 1,31 milliard de cas d'ici 2050. En Chine, des études récentes montrent une prévalence du diabète de 12,4 % en 2018, contre 10,9 % en 2013. La dyslipidémie est souvent comorbide avec le diabète, augmentant considérablement les risques d'événements cardiovasculaires et cérébrovasculaires, de mortalité et d'invalidité.

Des enquêtes épidémiologiques menées dans 20 hôpitaux tertiaires en Chine montrent que 67,1 % des patients diabétiques de type 2 (DT2) souffrent de dyslipidémie. L'étude CCMR-3B a rapporté que 72 % des patients atteints de DT2 souffraient également de dyslipidémie et/ou d'hypertension, doublant ainsi leur risque de complications macrovasculaires et microvasculaires par rapport aux patients diabétiques seuls.

En raison de la pathogenèse complexe des troubles métaboliques des glucolipides et du faible taux d’obtention d’un contrôle métabolique complet, les traitements efficaces sont limités. La formule hypoglycémique-lipidique (HLF) à base de Cistanche, développée selon la théorie de la « turbidité des mucosités », vise à éliminer la chaleur, à éliminer la turbidité et à rétablir l'équilibre. Composé de huit herbes dontCistanche, Momordica charantia, Aloé vera, Scutellaria baicalensis, Schisandra chinoise, Zingiber officinale, Salvia miltiorrhiza, etAtractylodes macrocéphale, HLF cible les mécanismes fondamentaux des troubles métaboliques.

L'analyse des empreintes digitales par HPLC a identifié les composés clés :mangiférine, coptisine, jatrorrhizine, acide salvianolique B, aloïne, berbérine, palmatine,etlovastatine. Des études antérieures ont confirmé l'efficacité du HLF pour abaisser les taux de glucose et de lipides, réduire le risque cardiovasculaire et améliorer la résistance à l'insuline. Un essai clinique multicentrique, randomisé et ouvert portant sur 450 patients atteints de DT2 et de dyslipidémie liés à l'obésité a révélé que le HLF réduisait efficacement la glycémie, régulait les lipides, diminuait le poids corporel et améliorait la sensibilité à l'insuline.

Des recherches plus approfondies suggèrent que le HLF pourrait moduler le microbiote intestinal (par exemple,Faecalibactérie, Blautia) et influencent les voies métaboliques telles que la dégradation des acides gras et la glycolyse/gluconéogenèse. Malgré son efficacité clinique prouvée, les mécanismes précis restent flous, ce qui limite une application plus large.

La pharmacologie de réseau propose une approche systémique pour élucider les mécanismes des maladies et les actions des médicaments en intégrant la bioinformatique et le criblage à haut débit. Cette étude utilise la pharmacologie de réseau, l'amarrage moléculaire, la dynamique moléculaire et les expérimentations animales pour découvrir les mécanismes multi-cibles du HLF dans le traitement des troubles métaboliques des glucolipides.

2. Matériels et méthodes

2.1 Instruments

Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse D3024R (SCILOGEX)

Appareil d'électrophorèse Y300C et cuve d'électrophorèse JY300C (Junyi Oriental, Pékin)

Système d'imagerie ChampGel 5000 (Saizhi Innovation, Pékin)

SMA-1000 spectrophotomètre (Meilin Hengtong, Pékin)

Système qRT-PCR StepOne Plus (ABI)

Unité d'électrophorèse universelle PowerPac (Bio-Rad)

PB-10 pH-mètre (Sartorius)

Analyseur de chimiluminescence Tanon 5200 (Tanon, Shanghai)

2.2 Médicaments à base de plantes

Formule HLF incluse :

Cistanche (Cistanches Herba)

Momordica charantia

Scutellaria baicalensis

Aloé vera

Schisandra chinoise

Zingiber officinale

Salvia miltiorrhiza

Atractylodes macrocéphale
Toutes les herbes étaient des extraits de formule granulée (Tianjiang Pharmaceutical, Jiangyin).

Médicament témoin :Chlorhydrate de metforminecomprimés (0,5 g par comprimé, Bristol-Myers Squibb, Shanghai).

2.3 Réactifs et anticorps

Réactif TRIzol (Invitrogen)

Kit de synthèse d'ADNc HiFiScript (CW2569)

Mélange UltraSYBR (ROX élevé, CW2602)

Kit d'analyse de protéines BCA

Anticorps primaires ciblant p-AKT, p-NF-κB p65, AKT, NF-κB p65, FN1, p53, IL-1, IL-6, EGFR, TNF-, -caténine, ESR1, -actine

Anticorps secondaires (IgG de chèvre anti-lapin/souris conjugués à la HRP)

2.4 Modèles animaux

Des souris mâles C57BL/6J (âgées de 7 semaines) ont été achetées et hébergées dans des conditions SPF standard. Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le comité d'éthique de l'hôpital de Guang'anmen (approbation n° IACUC-GAMH-2019-002).

2.5 Prédiction de cible

Les composés actifs du HLF ont été interrogés dansCTDetSwissTargetPrediction(probabilité > 0,1). Les cibles liées à la maladie pour le DT2 et la dyslipidémie ont été extraites deCartes génétiques(score de pertinence > 1). Les diagrammes de Venn ont identifié des cibles qui se chevauchent pour une analyse plus approfondie du PPI.

2.6 Construction du réseau PPI

Des objectifs qui se chevauchent ont été saisis dansCHAÎNE(https://www.string-db.org), avec un niveau de confiance moyen (score supérieur ou égal à 0,4). Le réseau a été visualisé et analysé dansCytoscape, et les objectifs principaux identifiés par degré de centralité.

2.7 Enrichissement GO et KEGG

Des objectifs clés ont été soumis àMétascapepour l’analyse des voies GO (BP, MF, CC) et KEGG (P < 0,01). La visualisation a été réalisée à l'aide de graphiques à bulles.

2.8 Réseau composé-cible-voie

Cytoscape a été utilisé pour construire un réseau reliant des herbes, des composés, des cibles et des voies, illustrant les interactions multi-cibles et multi-voies.

2.9 Amarrage moléculaire

Les structures 2D des composés ont été obtenues à partir dePubChem, converti en PDB en utilisantOuvrir Babel. Les structures protéiques ont été téléchargées à partir deBPD RCSB, préparé dansOutils AutoDock, et ancré à l'aide deVoileVina. Affinité de liaison inférieure ou égale à -4,25 kcal/mol a été considérée comme significative. Les résultats de l'amarrage ont été visualisés avecPyMOL.

2.10 Simulation de dynamique moléculaire

Les simulations MD ont été réalisées en utilisantAmber18pour les meilleurs complexes sélectionnés. Protéine : ambre14SB ; ligand : gaffe ; eau : modèle OPC. RMSD et RMSF ont été calculés à partir de simulations NPT de 20 ns.

2.11 Regroupement d'animaux et intervention

Les souris ont été randomisées en 4 groupes : normal (N), modèle (M), metformine (MET) et HLF. À l’exception du groupe N, toutes les souris ont reçu un régime riche en graisses (HFD) pendant 6 semaines. Le HLF a été administré à 14 g/kg (équivalent herbe brute), le MET à 250 mg/kg. Après 8 semaines d'intervention, du sang et des tissus hépatiques ont été prélevés pour analyse.

2.12 qRT-PCR

L'ARN total a été extrait à l'aide de TRIzol. L'ADNc a été synthétisé à l'aide de HiFiScript. La qPCR a été réalisée avec UltraSYBR et StepOne Plus. L'expression relative a été calculée via 2 ^ − ΔΔCt.

2.13 Western Blot

Les protéines ont été extraites du tissu hépatique, quantifiées, séparées par SDS-PAGE et transférées sur des membranes PVDF. Après blocage et incubation avec des anticorps primaires et secondaires, les signaux ont été visualisés par ECL et quantifiés à l'aide d'ImageJ. -actine utilisée pour la normalisation.

2.14 Analyse statistique

Les données ont été analysées à l'aideSPSS23.0etPrisme GraphPad 10.1.2. Une ANOVA unidirectionnelle et des tests t ont été utilisés, avec P <0,05 considéré comme statistiquement significatif.