Analyse des composants aromatiques et des métabolites différentiels dans le Cistanche Musalais basée sur la GC-MS et la métabolomique

 

Abstrait:Cette étude a préparé le Cistanche Musalais en utilisant des techniques traditionnelles avec des raisins rouges Xinjiang Hetian et divers ajouts de Cistanche. Les conditions de traitement optimales ont été déterminées par ANOVA unidirectionnelle. La GC-MS et la métabolomique non ciblée ont été utilisées pour analyser les composants aromatiques et les métabolites différentiels, et les constituants actifs tels que les flavonoïdes totaux et les polyphénols totaux ont été quantifiés. Les conditions optimales étaient : une teneur initiale en sucre de 32 degrés Bx, une température de fermentation de 25 degrés et un ajout de 7 % de Cistanche deserticola. Dans ces conditions, la teneur en alcool, l'acidité totale, les flavonoïdes totaux et les polyphénols totaux ont atteint respectivement (12,6 ± 0,6) % vol, (3,82 ± 0,19) g/L, (0,80 ± 0,01) g/L et (0,60 ± 0,00) g/L. La GC-MS a détecté 38 composés aromatiques, les esters étant la classe la plus abondante (24 composés), suivis de 6 alcools, 2 cétones et 2 aldéhydes. Par rapport au Musalais fabriqué uniquement à partir de jus de raisin, le Cistanche deserticola Musalais présentait des niveaux significativement plus élevés d'esters clés, notamment l'acétate d'éthyle (6,42 % contre . 2.42 %) et le palmitate d'éthyle (3,75 % contre . 1.18 %), tandis que les alcools plus élevés tels que l'isobutanol ont nettement diminué (2,11 % contre . 3.98 %). La métabolomique a identifié 230 métabolites différentiels (VIP supérieur ou égal à 1, P < 0,05), enrichis en voies liées aux transporteurs ABC et à la biosynthèse des acides aminés. Les composants tels que la trigonelline et la crocine étaient significativement élevés. Le métabolisme des acides aminés a contribué à la formation du profil aromatique caractéristique. Cette étude fournit une base théorique et technique pour le développement et l'amélioration de la qualité du Cistanche Musalais. Les recherches futures devraient intégrer des techniques sensorielles moléculaires, telles que GC-O, pour mieux identifier les principaux composés actifs responsables du profil aromatique global.

Mots-clés: Cistanche;Musalais; GC-MS ; métabolomique

CistancheMusalais

 

 

 

Cistanche Musalais Détails de l'annonce

 

 

 

Musalais (Msalais)est une boisson fermentée traditionnelle unique au Xinjiang, produite à partir de raisins rouges Awati ou de raisins rouges Hetian (Hotan). Il est obtenu par extraction de jus, concentration et fermentation spontanée et se caractérise comme primitif, naturel et vert. En tant que boisson alcoolisée naturellement fermentée typiquement chinoise, le Musalais présente des caractéristiques régionales distinctes en termes d'attributs sensoriels, de valeur nutritionnelle et d'activités fonctionnelles. Les alcools, esters, aldéhydes, acides, phénoliques et terpènes générés pendant la fermentation confèrent non seulement une saveur unique, mais sont également associés à des bienfaits tels que favoriser la circulation sanguine, abaisser les lipides sanguins, tonifier les reins et renforcer l'organisme, réguler le cholestérol et maintenir la santé cardiovasculaire et cérébrovasculaire, ce qui le rend adapté aux consommateurs de différents âges [1].

Ces dernières années, avec la demande croissante des consommateurs pour des boissons saines, le marché des boissons alcoolisées fonctionnelles s'est développé rapidement. Sur la base du brassage traditionnel, les liqueurs fonctionnelles intègrent des composants fonctionnels spécifiques pour répondre à des besoins de bien-être, de maintien de la santé ou de régulation physiologique spécifique. Leur qualité est influencée par les matières premières, les processus, les communautés microbiennes et la stabilité des composants fonctionnels [2]. Dans la pratique populaire du sud du Xinjiang, des compléments locaux tels que la baie de goji, le carthame, le cistanche et le safran sont souvent ajoutés lors de la préparation du Musalais pour améliorer les bienfaits pour la santé et enrichir la diversité des saveurs [3]. Parmi ceux-ci, le Cistanche, riche en polysaccharides, acides aminés, glycosides phényléthanoïdes, glycosides iridoïdes et alcaloïdes, a des effets toniques sur le yang des reins, module la fonction neuroendocrinienne et combat la fatigue, ce qui lui vaut le nom de « ginseng du désert » [4-5].

Cependant, l'industrialisation du Cistanche Musalais est actuellement confrontée à des défis, notamment le manque de normes de production, une technologie de transformation incomplète et une recherche insuffisante sur les substances aromatiques, limitant sa promotion sur le marché et l'amélioration de sa qualité. Dans cette étude, le Cistanche a été utilisé comme complément pour optimiser le processus de fermentation du Musalais. La GC-MS et la métabolomique non ciblée ont été utilisées pour résoudre systématiquement les constituants aromatiques et les métabolites différentiels, dans le but de fournir une base théorique et un support technique pour la production standardisée, la modulation de la saveur et l'amélioration fonctionnelle du Cistanche Musalais, favorisant ainsi la modernisation et le développement de la valeur de cette boisson traditionnelle.

1 Matériels et méthodes

 

1.1 Matériels et réactifs

 

Cistanche tubulosa (Cistanche tubulaire): spécimens commerciaux de première qualité provenant de Hetian (Hotan), Xinjiang, à la texture dodue et exempts de moisissures et d'impuretés.

Raisins rouges Hetian : fruit commercial à l'apparence intacte et à l'arôme puissant, provenant de Hetian, Xinjiang.

Méthanol et acétonitrile : Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.

Acide formique : TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.

L-2-chlorophénylalanine : Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

 

1.2 Instruments et équipements

 

Agitateur magnétique à température constante 08-2T, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.

Dispositif SPME 57330-U et fibre SPME DVB/CAR/PDMS 57348-U 50/30 μm, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Système GC-MS 6890N-5973, Agilent Technologies (Chine) Co., Ltd.

Centrifugeuse réfrigérée 5430R, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.

TL-48R Broyeur de tissus à haut débit, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.

Concentrateur sous vide SCIENTZ-1LS, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.

Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (Chine) Co., Ltd.

SDAJ-0.5 Ligne de production de vin de style chinois, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.

1.3 Méthodes expérimentales

 

1.3.1 Flux de processus

Cistanche a été cuit à la vapeur pour une utilisation ultérieure. Les raisins rouges Hetian ont été lavés et sélectionnés, égrappés et foulés. Le jus de raisin a été extrait au pressoir, puis chauffé et concentré pour ajuster les indicateurs de concentration du jus. Enfin, le produit Cistanche cuit à la vapeur a été mélangé avec du jus de raisin concentré et fermenté sous des paramètres de température et de temps contrôlés. Après fermentation, le produit a été clarifié pour obtenir le Cistanche Musalais.

 

1.3.2 Préparation de la cistanche

Avec des modifications mineures à Gong et al. [6], du Cistanche séché de haute qualité et non détérioré a été pelé, tranché, enveloppé dans de la gaze et cuit à la vapeur pendant 20 minutes pour une utilisation ultérieure.

 

1.3.3 Préparation du jus de raisin

Des raisins rouges Hetian avec une teneur initiale en solides solubles (sucre) de 18 degrés Bx ont été utilisés. Les raisins pourris, détériorés et inégalement mûris ont été enlevés. Après lavage et épluchage, les raisins ont été pressés. Le jus était bouilli (concentré) à haute température et la concentration était arrêtée lorsque le sucre atteignait 26, 29 ou 32 degrés Bx. Le jus a été refroidi à température ambiante pour une utilisation ultérieure.

 

1.3.4 Processus de fermentation du Cistanche Musalais

Du Cistanche cuit à la vapeur a été ajouté dans des proportions définies (3%, 5%, 7%) à 600 ml de jus de raisin concentré dans un fermenteur. Le sucre résiduel a été mesuré toutes les 24 heures pendant la fermentation pour suivre la progression. Lorsque le sucre résiduel descend à 4 g/L, la fermentation est terminée. Le surnageant a été collecté et pasteurisé à 85 degrés pendant 30 min pour obtenir le Cistanche Musalais.

1.3.5 Plan expérimental à un seul facteur pour le Cistanche Musalais

Les effets de l'ajout de Cistanche (3 %, 5 %, 7 %), de la teneur initiale en sucre (26, 29, 32 degrés Bx) et de la température de fermentation (22, 25, 28 degrés) sur les propriétés physicochimiques et la bioactivité ont été étudiés.

 

1.3.6 Analyses et mesures

 

Teneur en alcool, solides solubles et acidité totale : déterminés selon GB/T 15038-2006 "Méthodes analytiques générales pour le vin et les vins de fruits".

Flavonoïdes totaux : déterminés en référence à Xu et al. [7]. Une courbe d'étalonnage a été préparée avec la concentration de rutine (X) en abscisse et l'absorbance (Y) à 510 nm en ordonnée, donnant Y=0.8043X − 0,0278, R2=0.9999, indiquant une bonne linéarité.

Polyphénols totaux : déterminés selon la méthode Folin – Ciocalteu [8]. Une courbe d'étalonnage a été préparée avec la teneur en acide gallique (X) en abscisse et l'absorbance (Y) à 760 nm en ordonnée, donnant Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, indiquant une bonne linéarité.

 

1.3.7 Analyse GC-MS

Des échantillons de deux groupes – expérimental (32 degrés Bx, 25 degrés, 7 % de Cistanche) et témoin sans Cistanche – ont été soumis à GC-MS.

Prétraitement de l'échantillon : l'échantillon a été placé dans un flacon d'extraction de 20 mL ; 100 µL de phénylacétate d'isoamyle à 50 µg/mL ont été ajoutés comme étalon interne. Le flacon a été scellé et équilibré dans un bain-marie à 60 degrés sous agitation magnétique à 250 tr/min pendant 20 min. La fibre SPME a ensuite été insérée pour une extraction de 30 minutes. Avant utilisation, la fibre SPME a été conditionnée à l’entrée du GC à 250 degrés pendant 20 min.

Conditions GC – MS : colonne HP-INNOWax (60 m × 250 μm × 0,25 μm) ; entrée 250 degrés ; ligne de transfert 250 degrés ; débit de gaz vecteur 1,5 ml/min ; divisé 4:1. Programme du four : 40 degrés (5 min), rampe de 5 degrés/min jusqu'à 250 degrés, maintenir 10 min. Source d'ions 230 degrés ; quadripôle 150 degrés ; EI 70 eV ; analyse complète 35-550 Da.

 

1.3.8 Métabolomique non ciblée

 

1.3.8.1 Préparation des échantillons

Deux groupes ont été testés : expérimental (32 degrés Bx, 25 degrés, 7 % de Cistanche) et témoin sans Cistanche ; n=3 répétitions biologiques par groupe, totalisant 6 échantillons. Après décongélation et vortex, 300 µL de chaque échantillon ont été transférés dans un tube de 1,5 mL et centrifugés à 12 000 tr/min, 4 degrés pendant 15 min. Ensuite, 100 µL de surnageant ont été déplacés dans un tube de 2 mL, congelés dans de l’azote liquide et lyophilisés. Ajouter 1 mL de méthanol:acétonitrile pré-refroidi (1:1, v/v), vortexer 30 s ; congeler à −20 degrés pendant 30 min ; centrifuger à 12 000 tr/min, 4 degrés pendant 10 min ; recueillir 850 μL de surnageant et sécher sous vide jusqu'à épuisement ; reconstituer dans 150 μL de méthanol à 50 % (avec 5 ppm de 2-chlorophénylalanine), vortexer 30 s ; centrifuger 12 000 tr/min, 4 degrés pendant 10 min ; filtrer sur membrane de 0,22 µm et transférer le filtrat dans des flacons. Combinez 10 à 20 μL de chaque échantillon pour créer un échantillon de contrôle qualité afin d'évaluer la stabilité de l'instrument et la fiabilité des données ; Le CQ est omis si moins de 5 échantillons sont inclus.

 

1.3.8.2 Conditions analytiques

Chromatographie : colonne ACQUITY UPLC HSS T3 (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm) ; débit 0,4 ml/min ; colonne 40 degrés ; échantillonneur automatique 8 degrés ; injection 2 µL. Phase mobile A : eau avec 0,1 % (v/v) d'acide formique ; phase mobile B : acétonitrile avec 0,1% (v/v) d'acide formique.
Spectrométrie de masse : tension de pulvérisation +3.5 kV/−3,0 kV ; gaz de gaine 40 arb ; gaz auxiliaire 10 arb; capillaire 320 degrés ; température du gaz auxiliaire 300 degrés ; Résolution MS1 ​​60 000 ; plage de balayage m/z 70–1 000 ; Norme cible AGC ; IT maximum 100 ms ; MS/MS dépendant des données sur les 4 premiers ions avec exclusion dynamique 4 s ; Résolution MS2 15 000 ; Énergie de collision HCD 30 %.

 

1.3.8.3 Identification des métabolites

L'identification des métabolites était basée sur le PSNGM (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), comprenant une bibliothèque interne de normes, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.ca/), MoNA (https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/), NIST_2020_MSMS et un Bibliothèque spectrale MS/MS prédite par l'IA.

Remarque sur les bases de données externes utilisées en annotation :

HMDB : une base de données complète sur le métabolome humain (version 5.0) contenant des informations chimiques, cliniques et biochimiques détaillées sur 220 945 métabolites, avec des liens croisés étendus avec KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt et GenBank, et prenant en charge les recherches avancées de texte/séquence/structure et spectrales MS/RMN. Également associé à DrugBank, T3DB, SMPDB et FooDB.

LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50 000 structures lipidiques conservées), spectres, voies, outils d'analyse MS, dessin de structure et ressources de nomenclature/classification.

mzCloud : une bibliothèque spectrale de masse avancée prenant en charge les recherches basées sur le spectre, la structure, la sous-structure, l'arbre et m/z, avec 32 330 composés, 51 002 arbres spectraux et 16 531 567 spectres (avec des ajouts substantiels en 2024), optimisés pour l'accès au bureau Firefox/Chrome.

 

1.3.8.4 Analyse statistique multivariée

Des analyses multivariées ont été appliquées aux données métabolites des 6 échantillons pour effectuer une PCA, élucidant les différences métaboliques entre Cistanche Musalais et Musalais. Les métabolites différentiels entre les groupes ont été examinés en utilisant l'importance variable OPLS-DA dans la projection (VIP), le changement de pli et les valeurs P (seuil VIP et signification comme ci-dessus), suivis d'une interprétation biologique incluant l'enrichissement de la voie KEGG (9).

 

Références

[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ et al. Analyse qualitative des principaux composés aromatiques associés à la transformation traditionnelle du Musalais au Xinjiang en Chine. Journal de l'Institut de la Brasserie. 2012;118(2):236-242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y et al. Progrès de la recherche moderne sur les liqueurs fonctionnelles fermentées. Fabrication d'alcool. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Discussion sur les stratégies de développement du vin de raisin Xinjiang Msalais. Science et technologie de fabrication d'alcool. 2008(7) : 111-113.
[4] Chanson ZH, Lei L, Tu PF. Avancées dans la recherche sur l'activité pharmacologique des plantes de Cistanche Hoffing. et Lien. Drogues traditionnelles et à base de plantes chinoises. 2003 ;34(9) :U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Le développement de la recherche de Cistanche Hoffmg. Et Link. Journal chinois d'ethnomédecine et d'ethnopharmacie. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY et al. Etude sur la technologie d'un nouveau vin fermenté de Cistanche. Nourriture moderne. 2019(5):64-68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ et al. Activités antioxydantes et antibactériennes des flavonoïdes totaux de Nervilia fordii. Horticulture du Nord. 2017(16) : 161-165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX et al. Fermentation mixte de marcs d'écorces d'agrumes avec Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae et Lactobacillus casei : optimisation des procédés, activités antioxydantes et analyse métabolomique non ciblée. Bioscience alimentaire. 2025 ; 66 : 106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ et al. Comparaison de la métabolomique largement ciblée et de la métabolomique non ciblée de l'Ophiocordyceps sinensis sauvage. Molécules. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Recherche sur la technologie de Rosa kwangsiensis var. vin fermenté sterilis [Mémoire de maîtrise]. Chongqing : Université du Sud-Ouest ; 2017.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX et al. Recherche sur le développement de produits et l'optimisation de la surface de réponse de la poire du Msalais. Transformation des produits agricoles. 2025 ; 3 : 1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Vérification de l'adaptabilité de la méthode de dosage du cuivre dans GB/T15038-2006 méthode générale d'analyse du vin et des vins de fruits. Fabrication d'alcool. 2020;47(5):104-107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z et al. Effet de la température de fermentation malolactique sur la qualité du vin Cabernet Sauvignon. Sciences agricoles du Zhejiang. 2025;66(7):1724-1732.