Identification des espèces et analyse de la composition chimique des plantes sauvages de Cistanche du Kenya

Abstrait:Cette étude a utilisé des techniques de morphologie végétale, d'histologie et de codes-barres ADN pour identifier les espèces sauvages de Cistanche au Kenya. La teneur en composants actifs principaux, notamment les glycosides phényléthanoïdes, les alcools de sucre et la bétaïne, du Cistanche sauvage du Kenya a été déterminée par la méthode HPLC. Entre-temps, l’analyse des empreintes digitales a été effectuée. Les résultats ont montré que la plante sauvage Cistanche récoltée au Kenya a été identifiée comme étant Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Le contenu des principes actifs tels queéchinacoside,cistanoside A, acéoside, isoactéosideet le 2′-acétylactéoside chez C. senegalensis du Kenya étaient inférieurs à ceux de C. tubulosa domestique, mais supérieurs à ceux de C. deserticola domestique. La teneur en bétaïne était similaire à celle du C. deserticola domestique, mais elle ne contient pas de glucose. Les caractéristiques de l'empreinte digitale sont plus similaires à celles du C. tubulosa domestique. Cette étude fournit une base pour la protection des ressources, la recherche approfondie et le développement de la ressource Cistanche au Kenya.

Mots-clés : Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenya; identification des espèces; codes-barres ADN ; détermination du contenu

 

 

 

Cistanche désertiqueYC Maman

 

Cistanche, une herbe prisée en médecine traditionnelle chinoise, fait référence aux tiges séchées, écailleuses et succulentes de plantes du désert telles queCistanche désertiqueYC MamanetCistanche tubuleuse(Schenk) Wight, tous deux membres de la famille des Orobanchaceae. Réputé pour sa capacité à tonifier le yang des reins, à nourrir l'essence et le sang et à humidifier les intestins pour soulager la constipation, le Cistanche est célébré dans les textes à base de plantes chinoises depuis des siècles. Son premier enregistrement médicinal apparaît dans l'ancien classiqueLe classique de la matière médicale de Shennong, où le Cistanche est classé comme herbe de « qualité supérieure ». Au cours de l'histoire, de nombreux textes médicaux traditionnels ont documenté les puissants bienfaits du Cistanche, ce qui lui a valu le surnom estimé de « Ginseng du Désert ».

Les divers effets pharmacologiques du Cistanche sont attribués à sa gamme de composés bioactifs. Parmi eux, les glycosides phényléthanoïdes sont les principaux ingrédients actifs responsables des effets tonifiants des reins et nourrissants de la moelle du Cistanche. Ces composés, tels que l'échinacoside et l'actéoside, présentent des activités neuroprotectrices, anti-démence, anti-âge et hépatoprotectrices. Notamment, l'échinacoside et l'actéoside sont les deux composés de référence utilisés pour le contrôle qualité du Cistanche, comme spécifié dans l'édition 2020 de la Pharmacopée chinoise. De plus, l'effet laxatif du Cistanche est principalement dû à ses composants alcooliques oligosaccharides, notamment la bétaïne, le mannitol, le fructose, le glucose et le saccharose. Ces cinq composants sont largement reconnus comme indicateurs de la capacité du Cistanche à humidifier les intestins et à favoriser le transit intestinal.

Cistanche tubuleuse(Schenk) Wight

En Chine, les principales espèces de Cistanche comprennentCistanche désertiqueYC Maman,Cistanche tubuleuse(Schenk) R. Wight,Salsa à la cistanche(CA Mey.) G., etCistanche sinensisG. Beck. Ces espèces sont originaires de régions telles que la Mongolie intérieure, le Ningxia, le Gansu et le Xinjiang. Au-delà du nord-ouest de la Chine, les espèces de Cistanche sont également réparties dans les régions arides et désertiques d'Eurasie et d'Afrique du Nord et de l'Est, notamment dans des pays comme l'Iran, l'Afghanistan, le Kenya, le Pakistan et la Mongolie.

Le Kenya, situé en Afrique de l'Est et à cheval sur l'équateur, est principalement composé de hauts plateaux d'une altitude moyenne de 1 500 mètres, mais ses zones septentrionales sont désertiques ou semi-désertiques. Les peuples autochtones du Kenya utilisent depuis longtemps les plantes médicinales à des fins curatives. La région possède une richesse de flore médicinale, par exemple des extraits de l'écorce et des racines de l'arbre à brosse à dents (Salvadore persiqueL.) sont connus pour leurs propriétés anti-inflammatoires et antibactériennes et sont souvent utilisés pour traiter les maux de dents et les infections. L'écorce du bois de santal (Osyris lanceolataTrès bien. & Steud.) est utilisée pour traiter la diarrhée, tandis que les décoctions d'ortie Massaï (Urtique massaïqueMildbr.) les feuilles sont utilisées pour les douleurs à l’estomac. Cette riche tradition a favorisé une culture dynamique de plantes médicinales, mais en raison des défis de développement économique, l'utilisation de ces plantes médicinales n'a pas été entièrement documentée ni systématiquement étudiée.

Il est intéressant de noter que les espèces de Cistanche sont souvent considérées comme des mauvaises herbes en Afrique et n’ont pas fait l’objet de beaucoup d’attention ou de recherches. En fait, il n’existe pratiquement aucune étude publiée sur le Cistanche africain. Répondant à une invitation du Département de développement régional des terres arides et semi-arides de la Communauté d'Afrique de l'Est, notre équipe de recherche a mené une étude sur le terrain au Kenya pour étudier les ressources locales de Cistanche. Nous avons collecté des spécimens sauvages de Cistanche, procédé à une identification botanique et analysé leurs principaux composés bioactifs. L'objectif était de comprendre la diversité des espèces et le potentiel de développement du Cistanche au Kenya, et de fournir une base scientifique pour la poursuite des recherches et l'utilisation de ces précieuses plantes du désert.

Cistanche tubulosa racine entière séchée Vente en Chine

WhatsApp nous pour plus de détails

 

 

Matériels et méthodes

Matériaux végétaux

Des spécimens sauvages de Cistanche du Kenya ont été collectés en août 2023 par les professeurs Pengfei Tu et Yong Jiang de l'École des sciences pharmaceutiques de l'Université de Pékin, à Kajiado, au Kenya (01 degré 50'01"S ; 36 degré 47'00"E). Deux plantes sauvages de Cistanche ont été collectées et étiquetées K1 et K2, ainsi que les racines de leur plante hôte (voir Figure 1). La plante hôte a été identifiée par Kennedy Matheka, assistant de recherche à l'Herbier d'Afrique de l'Est des Musées nationaux du Kenya, comme étantSericocomopsis hildebrandtiiSchinz, appartenant à la famille des Amaranthacées. Des échantillons deCistanche désertiqueetCistanche tubuleuseont été collectés respectivement dans la ville de Turpan et dans le comté de Yutian, dans la région autonome ouïgoure du Xinjiang, et ont été authentifiés par le professeur Pengfei Tu comme étant des tiges fraîches et succulentes deCistanche désertiqueYC Ma etCistanche tubuleuse(Schrenk) Wight. Tous les spécimens de référence sont conservés dans notre laboratoire.

Instruments

Système HPLC WatersArc

Balance électronique Quintix125D-1CN (Sartorius, Pékin)

Microscope optique Olympus BX-50 (Olympus, Japon)

Scanner de diapositives panoramiques NanoZoomer-SQ (Hamamatsu Photonics, Japon)

Nettoyeur à ultrasons numérique KQ500DE (Kunshan Ultrasonic Instruments, Chine)

Broyeur d'extraction d'ADN MM400 (Retsch, Allemagne)

Thermocycleur PCR (Analytik Jena, Allemagne)

DYY-8C appareil et cuve d'électrophorèse (Liuyi Instrument Factory, Pékin)

Système d'imagerie sur gel MINI Space 1000 (Tanon, Shanghai)

Incubateur à température constante (Yiheng, Shanghai)

Réactifs

L'échinacoside (lot : DST191008-038), l'actéoside (DSTDL006101), l'isoacteoside (DST210601-060), le D-mannitol (DSTDG006201) ont été achetés auprès de Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. ; Le tubuloside A (MUST-15040115), le 2'-acétylacteoside (MUST-15071504), la bétaïne (MUST-23082505), le D-glucose anhydre (MUST-23030214), le fructose (MUST-23031403) et le saccharose (MUST-23082505) ont été obtenus auprès de Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. Méthanol (qualité HPLC, Thermo Fisher), acétonitrile (qualité HPLC, OCEANPAK), acide formique (qualité HPLC, réactifs VOKA) étaient tous d'une pureté chromatographique. Un kit d'extraction d'ADN génomique végétal (DP305, Tiangen Biotech, Chine) et de l'eau ultrapure ont été utilisés pour l'analyse moléculaire.

Préparation, coloration et observation de sections de tiges succulentes

Suivant la méthode de la référence [10], des tiges succulentes fraîches de Cistanche ont été coupées à des tailles appropriées et conservées dans un fixateur FAA (éthanol à 70 % : acide acétique glacial : formaldéhyde=90 : 5 : 5). Après lavage à l'eau courante pour éliminer le fixateur résiduel, les tissus ont été ramollis avec de l'acide fluorhydrique, colorés à la Safranine, déshydratés, inclus dans de la paraffine et sectionnés. Après le montage, les lames ont été cuites, la paraffine fondue et les coupes colorées avec une solution Fast Green à 95 % d'éthanol, puis scellées avec une résine neutre. La morphologie des tissus a été observée au microscope et des coupes bien formées ont été numérisées à l'aide d'un scanner panoramique pour obtenir des images à haute résolution.

Extraction d'ADN, amplification PCR et séquençage

L'ADN total des échantillons de Cistanche et des racines de plantes hôtes a été extrait à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN génomique végétal (Tiangen), en suivant le protocole du fabricant. Les concentrations d'ADN et les rapports OD260/OD280 ont été mesurés avec un spectrophotomètre UV à microvolume pour évaluer la qualité avant de continuer.

L'amplification PCR a ciblé la région de l'espaceur transcrit interne 2 (ITS2) de l'ADN ribosomal et le gène psbA-trnH du chloroplaste pour l'identification moléculaire (11). Les séquences d'amorces étaient les suivantes :

ITS2 en avant : 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 inversé : 5'-GACGCTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH en avant : 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH inverse : 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

Les réactions PCR (25 μL) comprenaient 12,5 μL de 2 × Taq Master Mix, 1 μL de chacune des amorces directe et inverse (2,5 μmol·L⁻¹), 2 μL de matrice d'ADN et 8,5 μL de ddH₂O. Amplification ITS2 : 94 degrés 5 min ; puis 35 à 40 cycles de 94 degrés 30 s, 56 degrés 30 s, 72 degrés 45 s ; extension finale à 72 degrés 10 min. Amplification psbA-trnH : 95 degrés 4 min ; 35 cycles de 94 degrés 30 s, 55 degrés 1 min, 72 degrés 1 min ; extension finale à 72 degrés 10 min. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel et les bandes cibles ont été soumises au séquençage bidirectionnel de Sanger. Les chromatogrammes de séquence ont été analysés à l'aide de CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., USA) pour obtenir des séquences d'ADN cibles, qui ont été identifiées à l'aide du système chinois de codes-barres d'ADN Materia Medica et de l'analyse BLAST dans la base de données GenBank. Des arbres phylogénétiques ont été construits avec le logiciel MEGA X pour l'identification des espèces.

Détermination quantitative de cinq glycosides phényléthanoïdes

La teneur en cinq glycosides phényléthanoïdes a été déterminée selon des méthodes précédemment établies [13]. Préparation des solutions de référence : pesez avec précision l'échinacoside, le tubuloside A, l'acteoside, l'isoacteoside et le 2'-acétylactéoside, et dissolvez-les dans 50 % de méthanol pour préparer une solution étalon mixte de concentration prédéterminée. Conditions chromatographiques : colonne Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) ; phase mobile A : acétonitrile-méthanol (6 : 1, v : v) ; phase mobile B : tampon acide formique 0,1 % ; élution par gradient : 0 à 5 min, 10 à 18 % A ; 5 à 15 minutes, 18 à 24 % A ; 15 à 20 minutes, 24 à 26 % A ; 20 à 28 minutes, 26 à 30 % A ; 28 à 35 min, 30 à 35 % A. Débit : 1,0 ml·min⁻¹ ; température de la colonne : 30 degrés ; longueur d'onde de détection : 330 nm. Méthode : injecter 10 μL de chacune des solutions étalon et échantillon dans la HPLC pour analyse.

Détermination quantitative de la bétaïne, du mannitol, du fructose, du glucose et du saccharose

Ces composants ont été quantifiés selon les méthodes précédentes [14]. Solutions de référence : pesez avec précision la bétaïne, le mannitol, le fructose, le glucose et le saccharose, dissolvez-les dans l'eau pour préparer une solution étalon mixte. Solutions d'échantillon : diluez la solution d'échantillon de Cistanche (préparée comme ci-dessus) avec 50 % de méthanol jusqu'à 1/5 de la concentration d'origine, mélangez bien et filtrez à travers une membrane microporeuse de 0,22 μm. Conditions chromatographiques : colonne Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) ; phase mobile : acétonitrile-eau (77:23) ; débit : 0,7 mL·min⁻¹ ; température de la colonne : 25 degrés ; détection avec détecteur à diffusion de lumière par évaporation (ELSD) : température du tube de dérive 100 degrés, débit de gaz porteur 3 L·min⁻¹. La quantification a été réalisée en injectant 5 μL et 10 μL de solutions étalons et 5 μL de solution échantillon, et en calculant le contenu à l'aide de l'équation logarithmique à deux points standard externe.

Évaluation de la similarité des empreintes digitales

Les solutions échantillons ont été préparées comme décrit ci-dessus, et les conditions et méthodes HPLC étaient les mêmes que pour la quantification des glycosides phényléthanoïdes. Les données chromatographiques ont été importées dans le « Système d'évaluation de similarité d'empreintes digitales chromatographiques de médecine traditionnelle chinoise (édition 2012) ». Le chromatogramme de l'échantillon K1 a été utilisé comme référence, avec cinq pics de glycosides de phényléthanoïde marqués pour une correction multipoint, générant des chromatogrammes de superposition et de référence et calculant la similarité des empreintes digitales.

 

 

Résultats et analyse

1. Identification morphologique de Cistanche

Les spécimens sauvages de Cistanche collectés au Kenya présentent des caractéristiques morphologiques distinctives. L'inflorescence est un épi, avec une bractée de forme long-ovale-lancéolée et deux petites bractéoles dont les deux côtés sont glabres. Le calice est tubulaire, avec cinq lobes émoussés au sommet. La corolle est tubulaire-campanulée, mesurant 3 à 4 cm de longueur, environ 2,5 fois la longueur du calice, avec cinq lobes au sommet et des marges recourbées. La corolle est de couleur jaune (Figure 1A, B) et vire au brun une fois séchée. Les filaments mesurent environ 3 cm de long, avec quelques poils fins à la base. Le style est légèrement plus long que les étamines et le stigmate est presque sphérique, lisse et glabre. Il y a quatre étamines, avec des anthères longues et ovales, densément couvertes de longs poils laineux ; la base de l'anthère est brusquement pointue. Cette fonctionnalité est conforme aux descriptions deCistanche désertiqueetSalsa à la cistanchedans la « Flore de Chine » ; en revanche, la base de l'anthèreCistanche tubuleuseest obtus et arrondi, ce qui le différencie nettement des autres espèces du même genre [7].

De plus, la plante hôte,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, est un arbuste très ramifié. Ses jeunes branches sont densément couvertes de poils laineux jaune pâle ou blancs. Les feuilles sont largement spatulées-obovales avec une base étroite (Figure 1D, E). Les inflorescences sont densément regroupées le long du pédoncule qui, avec l'axe de l'inflorescence, est couvert de poils laineux blanc grisâtre ou gris pâle ou blanc.

La tige succulente du Cistanche sauvage est cylindrique aplatie, avec une surface jaune pâle ou brunâtre densément couverte d'écailles charnues en forme d'aiguilles disposées en rangées. La texture est ferme, mais légèrement flexible (Figure 2A). La section transversale de la tige succulente est jaune pâle ou brunâtre, avec des faisceaux vasculaires brun pâle dispersés visibles à l'œil nu (Figure 2B). Au microscope, les faisceaux vasculaires apparaissent ovoïdes ou fusiformes, composés de xylème et de phloème, souvent présents sous forme de faisceaux solitaires dispersés ou regroupés en paires ou trios, le phloème étant orienté dans diverses directions (Figure 2C, D). Selon l'édition 2025 de la Pharmacopée chinoise, la coupe transversale deCistanche désertiqueest brunâtre, avec des faisceaux vasculaires en forme de points brun pâle disposés en un anneau ondulé, formant souvent un faisceau annulaire plié intérieurement ; en revanche,Cistanche tubuleuseprésente des faisceaux vasculaires dispersés en forme de points, une caractéristique distinctive clé pour identifier ces deux types de tranches de Cistanche [1]. La Cistanche sauvage du Kenya présente également des faisceaux vasculaires dispersés en forme de points dans la coupe transversale, ce qui correspond aux caractéristiques deCistanche tubuleuse.

 

 

Figure 2 Apparence et caractéristiques transversales de la plante sauvage Cistanche (K2) au Kenya. A : L’apparence de la tige ; B : La section transversale de la tige charnue ; C : Coupe en paraffine de la tige charnue (coloration verte safranine-fast) ; D : Vue agrandie du faisceau vasculaire dans la coupe en paraffine