Clonage de gènes, identification fonctionnelle, analyse structurelle et d'expression de la saccharose synthase de Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Analyse de l'expression de CtSus dans différentes parties de Cistanche tubulosa et dans un système de culture cellulaire soumis à un stress de sécheresse

4.1 Analyse de l’expression de CtSus dans différentes parties de Cistanche tubulosa

Des expériences de transformation de cellules entières in vitro et des expériences de réaction catalytique enzymatique ont confirmé que la protéine codée par le gène CtSus a la capacité de catalyser la synthèse de l'UDP-glucose. Afin d'explorer davantage la corrélation entre ce gène et la biosynthèse de composés glycosides chez Cistanche tubulosa, le niveau d'expression de ce gène dans différentes parties deCistanche tubuleusea été analysée.

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Échinacosideest le composé glycoside le plus représentatif de Cistanche tubulosa, et sa teneur peut atteindre plus de 30 % du poids sec des plantes de Cistanche tubulosa [23]. Le groupe de recherche a précédemment mesuré la teneur en échinacoside dans différentes parties des plantes de Cistanche tubulosa, et la performance spécifique était la suivante : la teneur enechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>partie aérienne; parmi eux, la teneur en échinacoside de l'haustorium était la plus élevée. Une PCR quantitative par fluorescence en temps réel a été réalisée en utilisant comme modèles l'ADNc de différentes parties de Cistanche tubulosa, et les résultats ont été analysés par le 2–Méthode ΔΔCT et une analyse différentielle a été réalisée. Les résultats sont présentés sur la figure 4A. Le niveau d'expression du gène CtSus dans l'haustorium était le plus élevé, 1,5 fois celui de la partie aérienne, et le niveau d'expression dans la partie souterraine était significativement plus élevé que celui de la partie aérienne, ce qui est cohérent avec le schéma d'accumulation des glycosides de phényléthanol. représenté par l'échinacoside dans différentes parties deCistanche tubuleuse.

Figure 4 Niveaux d'expression relatifs de CtSus dans différentes parties de C. tubulosa et dans des cellules en suspension traitées par PEG6000. A : Niveau d’expression relatif de CtSus dans différentes parties de C. tubulosa ; B : Niveau d'expression relatif de CtSus dans les cellules en suspension de C. tubulosa traitées par PEG6000 à différents moments n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

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4.2 Analyse de l’expression de CtSus dans des cellules en suspension de Cistanche deserticola dans des conditions de stress dû à la sécheresse

Les recherches préliminaires sur le projet ont montré questress de sécheresse induit par le PEG6000peutaugmenter considérablementleaccumulation de glycosides de phényléthanoldans des cellules en suspension de Cistanche. De 3 à 9 jours après l'induction, la teneur en échinacéaside a augmenté de manière significative. Du 12ème au 15ème jour, letaux de croissance de l'échinacéele contenu a ralenti et a atteint la valeur maximale le 15ème jour. Ensuite, à mesure que la durée de culture augmentait, la teneur en échinacée augmentait de manière significative. La teneur en fructoside a progressivement diminué [24]. Sur la base de cette recherche, cet article a utilisé l'ADNc de cellules en suspension de Cistanche deserticola non traitées et de cellules en suspension de Cistanche deserticola induites par le PEG6000- comme modèles pour effectuer une détection PCR quantitative par fluorescence en temps réel afin d'examiner le gène CtSus dans la suspension de Cistanche deserticola. cellules dans des conditions de stress dû à la sécheresse. changements dans les niveaux d’expression. Les résultats sont présentés sur la figure 4B. Dans les cellules en suspension de Cistanche deserticola induites par le PEG6000, l'expression de CtSus a augmenté de manière significative le 6ème jour après l'induction, et a atteint la valeur la plus élevée le 9ème jour, puis est retombée au même niveau que le contrôle. groupes de même niveau. Les résultats ci-dessus montrent que le stress dû à la sécheresse peut augmenter de manière significative l'expression du gène CtSus dans la lignée cellulaire en suspension de Cistanche deserticola, ce qui est cohérent avec le schéma d'accumulation d'échinacéaside en cas de stress dû à la sécheresse. Cependant, le pic d'expression du gène CtSus apparaît plus tôt que le pic de teneur en échinacéaside, car le donneur de glycosyle actif synthétisé par catalyse CtSus est un précurseur important requis pour la réaction de glycosylation en plusieurs étapes dans la voie de biosynthèse ultérieure de l'échinacéaside. , on suppose donc qu'après avoir été soumis à un stress de sécheresse, les organismes mobiliseront préférentiellement les gènes liés au métabolisme primaire pour réaliser l'accumulation de donneurs actifs, puis réaliseront l'accumulation de métabolites secondaires importants.

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5 Etude de la structure tridimensionnelle de la protéine CtSus et analyse des sites actifs clés

Sur la base de la fonction de CtSus dans la catalyse de la production d'UDP-glucose donneur de glycosyle, la base structurelle de l'activité catalytique de CtSus a été étudiée plus en détail. L'outil en ligne SOPMA a été utilisé pour prédire la structure secondaire de la protéine. Les résultats ont montré que la structure secondaire de CtSus contenait 55,28 % d'hélices, 25,47 % de bobines aléatoires, 12,80 % de brins étendus et 6,46 % de tours (Figure 5A), ce qui indique que les hélices sont les unités structurelles secondaires les plus importantes de la protéine CtSus. suivis de bobines aléatoires, qui représentent également une grande proportion de la protéine. Les brins et spires étendus sont répartis dans toute la protéine. Selon les études existantes, la saccharose synthase existe généralement sous la forme d'un tétramère, considéré comme sa forme active. Par conséquent, cet article a également utilisé AlphaFold2 pour prédire la structure de la protéine CtSus et obtenu sa structure tridimensionnelle de tétramères protéiques. La comparaison de la base de données PDB (Protein Data Bank) a révélé que la similarité de séquence entre la saccharose synthase AtSus1 d'Arabidopsis thaliana (PDBID 3S28) et CtSus peut atteindre 77,93 %. La structure CtSus prévue a été comparée à la structure tridimensionnelle AtSus1 et la valeur de l'écart quadratique moyen (RMSD) après superposition de protéines était de 1,11 Å, ce qui indique que les structures spatiales des deux sont hautement cohérentes (Figure 5B).

La structure complexe cristalline protéine-ligand rapportée d'Arabidopsis AtSus1 avec UDP et fructose (PDBID3S29) a été utilisée comme modèle (16) pour analyser le mode de liaison de CtSus avec UDP et fructose. Les résultats de l’amarrage moléculaire sont présentés sur la figure 5C. On peut observer que les poches de liaison au substrat d'AtSus1 et de CtSus sont très similaires en termes de type d'acide aminé, de distribution spatiale et de configuration, et que le chevauchement est élevé, prouvant que la séquence de saccharose synthase est hautement conservée dans les plantes. Les conformations des deux ligands, UDP et fructose, dans la poche de liaison au substrat protéique sont présentées sur la figure 5D. La conformation d'amarrage moléculaire la plus avantageuse de l'UDP et du CtSus chevauche bien la conformation de l'UDP dans le complexe cristallin AtSus1-UDP, prouvant l'exactitude des résultats de l'amarrage moléculaire. L'interaction entre l'UDP et les principaux résidus d'acides aminés dans la poche de liaison au substrat protéique est illustrée à la figure 5E. UDP et CtSus sont principalement liés entre eux par des liaisons hydrogène et des interactions hydrophobes. Les principaux résidus d'acides aminés dans la poche de liaison au substrat comprennent : eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 et Glu681.

Références

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