Cistanche Tubulosa induit l'apoptose médiée par les espèces d'oxygène réactif des cellules cancéreuses primaires et métastatiques du côlon humain

ABSTRAIT

Le cancer du côlon est le troisième cancer le plus répandu dans le monde. Les thérapies conventionnelles ont montré une efficacité modérée avec des effets indésirables graves, il existe donc un besoin urgent d'alternatives plus sûres. Dans cette étude, Cistanche tubulosa, le nom local Thanoon, a été considéré comme une stratégie phytothérapeutique potentielle en raison de son potentiel thérapeutique élevé connu en médecine traditionnelle et de sa grande abondance dans la région du Moyen-Orient. Des composés bioactifs ont été extraits de la poudre de Cistanche tubulosa et testés pour leurs propriétés anticancéreuses contre quatre lignées cellulaires de cancer du côlon, dont deux dérivées de la tumeur primaire (CaCo2 et HCT116) et deux dérivées du site métastatique (LoVo et SW620).

L'effet de Cistanche tubulosa sur l'induction de l'apoptose et l'homéostasie redox cellulaire a également été étudié. Cistanche tubulosa a présenté une inhibition de la prolifération dépendante de la concentration et du temps de toutes les lignées cellulaires cancéreuses testées de plus de 60 % après 72 heures de traitement avec 1 mg/mL d'extrait brut. L'inhibition de la prolifération a été marquée par l'induction de l'apoptose, la production intracellulaire d'espèces réactives de l'oxygène et les superoxydes mitochondriaux. Ces données suggèrent que Cistanche tubulosa est un candidat prometteur pour le traitement additif du cancer du côlon. Il s'agit de la première étude montrant la bioactivité anticancéreuse de Cistanche tubulosa contre les cellules cancéreuses du côlon.

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Abréviations :

7-AAD, 7-Amino-Actinomycine D ; CTE, extrait de Cistanche tubulosa ; EMEM, milieu essentiel minimum d'Eagle ; FBS, sérum bovin fœtal; DCF, 2,7-dichlorofluorescéine ; DCFH-DA, diacétate de 2,7- dichlorodihydrofluorescéine ; DMEM, milieu d'aigle modifié de Dulbecco ; DMSO, diméthylsulfoxyde; MTT, 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium ; PE, Phycoérythrine ; RFU, unités de fluorescence relative ; ROS, espèces réactives de l'oxygène

INTRODUCTION

Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus répandus dans le monde (Brenner et al., 2014), et son incidence est en constante augmentation avec environ 2,4 millions de cas en 2035, en raison de l'alimentation et du mode de vie modernes, ainsi que de la réduction de l'activité physique. Les efforts actuels ne sont pas suffisants pour lutter contre l'épidémie actuelle de cancer colorectal et, par conséquent, de nouvelles approches sont nécessaires pour une prévention et un traitement efficaces, y compris des changements de mode de vie en combinaison avec des interventions alternatives plus sûres telles que la phytothérapie (Weidner et al., 2015). La phytothérapie, l'utilisation de plantes médicinales pour traiter les maladies, a été une partie inévitable de l'histoire humaine ancienne. Les plantes médicinales sont utilisées depuis longtemps comme sources alternatives de traitement des cancers, représentant plus de soixante pour cent des agents anticancéreux utilisés en médecine conventionnelle (Balunas et Kinghorn, 2005 ; Saibu et al., 2015). Certains des exemples les plus connus incluent des extraits de Catharanthus roseus G. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) et Camptotheca acumated Decne (Nyssaceae) (Cragg et Newman, 2005; da Rocha et al., 2001). Il a été démontré que plusieurs extraits de plantes et composés phytochimiques exerçaient des effets antitumoraux dans le cancer colorectal attribués à l'induction de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et à l'apoptose associée des cellules cancéreuses, comme dans le cas des extraits de Melissa officinalis (Weidner et al., 2015).

Parmi les candidats phytothérapeutiques, Cistanche tubulosa, une plante parasitaire du désert Orobanchaceae (Jiang et al., 2009) qui est largement répandue dans les régions arides et semi-arides d'Afrique, d'Asie et de la région méditerranéenne, s'est avérée avoir de précieuses propriétés médicinales. Cistanche tubulosa a été largement utilisé en médecine traditionnelle et il est suggéré qu'il a des effets curatifs sur l'insuffisance rénale, la leucorrhée morbide, la métrorragie, l'infertilité féminine et la constipation sénile (Jiang et al., 2009). En plus de ses utilisations médicinales traditionnelles, d'importantes substances médicinales Les propriétés de Cistanche Tubulosa ont été intensivement étudiées au cours de la dernière décennie, notamment les effets vasorelaxants (Yoshikawa et al., 2006), hépatoprotecteurs (Morikawa et al, 2010), anti-hyperglycémiants et hypolipidémiants (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa a également été suggéré comme un puissant activateur du système immunitaire, un promoteur de la formation osseuse et un agent anti-âge et anti-fatigue (Xu et al., 2014). De plus, il a été démontré que l'extrait de Cistanche tubulosa bloque le dépôt d'amyloïde dans le modèle de la maladie d'Alzheimer (Wu et al., 2015). Malgré ses diverses utilisations thérapeutiques, l'effet de Cistanche Tubulosa en tant qu'agent anticancéreux potentiel n'a pas encore été étudié.

Dans le présent travail, nous avons étudié l'effet anticancéreux de Cistanche Tubulosa sur deux lignées cellulaires de cancer du côlon primaire et deux métastatiques et les mécanismes potentiels sous-jacents à cet effet.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Collecte et préparation d'extrait de plante, les échantillons de Cistanche tubulosa ont été prélevés dans une zone désertique du Qatar en 2014 et l'authenticité de la plante a été confirmée par un herboriste. Les échantillons de bons sont archivés au Service de toxicologie et polyvalente de l'ADLQ. Les échantillons de plantes séchées au soleil ont été broyés avec Retsch Knife Mill Grindomix GM300 en poudre fine. Vingt grammes de poudre ont été extraits avec 200 ml d'eau ultra pure pendant une nuit à 37 degrés sur un agitateur rotatif à 200 tr/min. Les extraits bruts de Cistanche tubulosa (CTE) ont été centrifugés pendant 30 min à 8 000 tr/min pour sédimenter les composés non solubles, le surnageant a été collecté et lyophilisé à l'aide de Labconco Freezone 6 plus lyophilisateur. L'extrait séché a été reconstitué dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, SIGMA, Allemagne) à une concentration de 20 mg/mL et filtré de manière stérile à travers un filtre à membrane de 0,2- micron.

Lignées cellulaires et maintenance cellulaire

Les lignées cellulaires de carcinome du côlon humain CaCo2, SW620 et LoVo ont été obtenues auprès du Service des lignées cellulaires (CLS, Eppelheim, Allemagne), tandis que la lignée cellulaire HCT 116 était un cadeau aimable du Département des sciences biologiques et environnementales de l'Université du Qatar. CaCo2 et HCT11 ont été dérivés du site primaire du carcinome du côlon tandis que SW620 et LoVo ont été dérivés du site métastatique. Les cellules SW620, HCT116 et LoVo ont été cultivées et maintenues dans du milieu DME tandis que les cellules CaCo2 ont été maintenues dans du milieu essentiel minimum d'Eagle (EMEM, SIGMA, Allemagne). Les cellules ont été cultivées en monocouche cultivées à 37 degrés dans un milieu respectif additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, SIGMA, Allemagne) et de 1 % de pénicilline/streptomycine (SIGMA, Allemagne) dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone.

Essai de viabilité cellulaire

Le dosage du {{0}}[4,5-diméthylthiazole-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium (MTT) a été utilisé pour évaluer l'activité cytotoxique de CTE de la même manière que décrit précédemment (Jaganjac et al., 2010). La densité d'ensemencement des cellules CaCo2, HCT116, SW620 et LoVo cultivées dans des plaques à puits 96- était de 104 cellules par puits. Les cellules ont été étalées dans un milieu respectif additionné de 10 % de FBS 24 heures avant le traitement. Après 24 heures, le milieu a été retiré et les cellules ont été traitées avec 0, 0,25, 0,5, 1 et 2 mg/mL de CTE pendant 24, 48 et 72 heures à 37 degrés dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Lors du traitement CTE, le milieu a été retiré et 40 µL de solution MTT (0,5 mg/mL) ont été ajoutés à chaque puits.

Après 3 h d'incubation, la solution MTT a été retirée, le produit formazan dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO, SIGMA, Allemagne) et l'absorbance a été mesurée à 590 nm avec un lecteur de microplaques (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Suisse) .

Test d'apoptose

L'apoptose dans les cellules CaCo2, HCT116, SW620 et LoVo a été détectée à l'aide du kit de détection d'apoptose PE Annexin V I avec 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) comme colorant vital (Becton Dickinson International, Belgique) selon les instructions du fabricant. En bref, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 24-puits à une densité de 5 × 104 cellules/puits dans un milieu respectif additionné de 10 % de FBS pendant 24 h avant l'ajout de CTE (0, 0,5 , ou 1 mg/mL). Après une incubation de 24 CTE, les cellules ont été récoltées, lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate froide et colorées avec de la phycoérythrine (PE) annexine V et 7-AAD pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité. Les cellules colorées ont été analysées en 1 heure par cytométrie en flux en utilisant FACS. Cytomètre en flux Aria III et logiciel FACSDiva (Becton Dickinson) à faible débit avec un minimum de 104 cellules. Le traitement des cellules pendant 4 heures avec de la camptothécine 6 uM (SIGMA) a été utilisé comme témoin positif pour le dosage.

Production intracellulaire de ROS

La production intracellulaire de ROS a été examinée à l'aide de diacétate de 2,7- dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA, SIGMA, Allemagne). DCFH-DA est une sonde non fluorescente, qui est oxydée avec des ROS intracellulaires en le composé fluorescent 2, 7- dichlorofluorescéine (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). Le test DCFHDA a été effectué de la même manière que nous l'avons décrit précédemment (Cindric et al, 2013 ; Poljak-Blazi et al., 2011). En bref, la densité d'ensemencement des cellules CaCo2, HCT116, SW620 et LoVo cultivées dans des plaques noires à puits 96- était de 104 cellules par puits. Les cellules ont été étalées dans un milieu respectif additionné de 10 % de FBS pendant 24 heures.

Avant le traitement, les cellules ont été incubées avec 10 µM de DCFH-DA à 37 degrés pendant 30 min dans 5 % de CO2 / 95 % d'air. Les cellules ont ensuite été lavées ettraités avec {{0}}, 0,5 et 1 mg/mL de CTE dans le milieu sans rouge de phénol. La formation intracellulaire de ROS a été surveillée en continu pendant 25 heures à 37 degrés et 5% de CO2 à l'aide d'un lecteur de microplaques avec un module de contrôle de la fluorescence et du gaz supérieur (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Suisse). L'intensité de fluorescence a été mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 500 nm et une détection d'émission à 529 nm. Les unités arbitraires, les unités de fluorescence relatives (RFU), étaient basées directement sur l'intensité de fluorescence

Génération de superoxyde mitochondrial

La capacité du CTE à induire la génération de superoxyde par les mitochondries a été estimée à l'aide d'une sonde MitoSOX Red perméable aux cellules et ciblée sur les mitochondries (Life Technologies) et Hoechst 33342 pour la coloration nucléaire (Life Technologies). Les cellules CaCo2, HCT116, SW620 et LoVo ont été ensemencées dans des plaques 96-puits à une densité de 104 cellules par puits dans un milieu respectif additionné de 10 % de FBS pendant 24 heures . Les cellules ont ensuite été chargées avec 4 µM de MitoSOX et 2 µM de Hoechst 33342 pendant 20 min, l'excès de colorant lavé et les puits traités avec 0, 0,5 et 1 mg/mL de CTE pendant 24 heures à 37 degrés et 5 % de CO2. L'intensité de fluorescence a été mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 510 nm et une détection d'émission à 580 nm pour MitoSOX et une longueur d'onde d'excitation de 350 nm et une détection d'émission à 461 nm pour Hoechst 33342 à l'aide d'un lecteur de microplaques à fluorescence supérieure (Infinite 200 PRO, Tecan Trading SA, Suisse)

analyses statistiques

Les statistiques descriptives ont été présentées comme la moyenne plus /− SD. La signification des différences entre les groupes a été évaluée à l'aide du test t de Student et du test du chi carré. Lorsque plus de deux groupes ont été comparés, nous avons utilisé une ANOVA unilatérale avec des tests post hoc appropriés. Le SPSS 11.01 pour Mircosoft Windows a été utilisé. Les différences avec P inférieur à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

RÉSULTATS

L'effet du CTE sur la prolifération des lignées cellulaires de cancer du côlon humain est illustré à la figure 1. Toutes les concentrations de CTE testées ont montré un fort effet inhibiteur sur la lignée cellulaire CaCo2 en fonction de la concentration et du temps (figure 1A). Soixante-douze heures de traitement CTE ont inhibé la croissance des cellules CaCo2 de plus de 60 % par rapport au témoin (p <0.05 pour toutes les concentrations). L'impact significatif du traitement CTE sur la croissance cellulaire HCT116 a également été détecté à tous les points de temps aux deux concentrations les plus élevées (1 mg/mL et 2 mg/mL), atteignant une réduction supérieure à 70 % à une dernière concentration (Figure 1B, p < 0,05).

Bien que les deux concentrations inférieures de CTE ({{0}}.25 et 0,5 mg/mL) aient significativement réduit la croissance des cellules HCT116 après 24 heures (p<0.05), 72="" they="" had="" no="" significant="" effect="" following="" hours="" of="" treatment="" compared="" to="" the="" control="" p="">{{0}}.{{10}}5). L'inhibition de la prolifération dépendante du temps et de la concentration avec le CTE a été confirmée dans les cellules LoVo par plus de 60 % à la concentration la plus élevée (p <0.05) (Figure 1C) , et les quatre concentrations de CTE testées ont réduit la croissance des cellules SW620 après 48 heures (Figure 1D, p <0.05 pour tous). Après 72 heures de traitement, le même effet n'a été observé que pour les deux concentrations les plus élevées (p < 0,05) alors que les concentrations de 0,25 et 0,5 mg/mL n'ont montré aucun effet significatif par rapport au témoin (p > 0,05). L'impact du traitement de 0,5 et 1 mg/mL de CTE sur l'induction de l'apoptose a été testé plus avant dans les quatre lignées cellulaires (Figure 2). Une augmentation du nombre de cellules en apoptose précoce a été détectée dans HCT116 et LoVo après 24 heures de traitement avec 0,5 mg/mL (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D).

La capacité du CTE à induire la production intracellulaire de ROS est démontrée à la figure 3. Trois heures après le traitement CTE, il y a eu une forte augmentation de la production intracellulaire de ROS dans toutes les lignées cellulaires (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24 hours of treatment with 1 mg/mL of CTE.

Fig. 1:

Effet de Cistanche tubulosa sur la viabilité des lignées cellulaires du cancer du côlon. La viabilité cellulaire mesurée par le test MTT des cellules (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo et (D) SW620 est présentée en pourcentage de la lignée cellulaire de contrôle du cancer du côlon non traitée. Les valeurs moyennes (±SD) pour 5 répétitions de l'expérience représentative sont données : (*) signification p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 2 :

L'extrait aqueux de Cistanche tubulosa induit l'apoptose des cellules cancéreuses du côlon humain. Les analyses de cytométrie en flux Annexin-V-FITC des cellules (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo et (D) SW620 sont présentées en pourcentage de la lignée cellulaire de contrôle du cancer du côlon non traitée. Les valeurs moyennes (±SD) pour 3 répétitions de l'expérience représentative sont données : (*) signification p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Fig. 3 :

L'extrait aqueux de Cistanche tubulosa induit la production de ROS intracellulaires en fonction du temps et de la dose. La production de ROS mesurée par le test DCFH-DA dans les cellules (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo et (D) SW620 est présentée sous forme de valeurs RFU moyennes (± SD) pour les 5- réplicats respectifs de une expérience représentative. (*) Signification p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

Fig. 4 :

L'extrait aqueux de Cistanche tubulosa induit la production de superoxyde mitochondrial dans les cellules cancéreuses du côlon humain. L'intensité de fluorescence de la sonde rouge MitoSOX ciblée sur les mitochondries dans les cellules A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo et (D) SW620 est présentée en pourcentage de la lignée cellulaire de contrôle du cancer du côlon non traitée. Les valeurs moyennes (±SD) pour 5 répétitions de l'expérience représentative sont données : (*) signification p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISCUSSION

Bien que des études antérieures aient rapporté de nombreuses propriétés médicinales de Cistanche tubulosa, il s'agit du premier rapport de son effet anti-prolifératif dans les cellules malignes. Les composés bioactifs de Cistanche tubulosa extraits avec de l'eau, un solvant hautement polaire, ont montré une forte bioactivité anticancéreuse. Nous avons précédemment comparé l'efficacité de Cistanche tubulosa solubilisé dans l'eau par rapport à d'autres solvants tels que le méthanol et l'acétate d'éthyle, mais les extraits aqueux présentaient les activités anticancéreuses les plus prometteuses (données non présentées).

Nous avons démontré la capacité du CTE à 1 mg/mL et 2 mg/mL à inhiber 60 % de la croissance des lignées cellulaires primaires et métastatiques du cancer du côlon, révélant un rôle potentiellement important de Cistanche tubulosa dans le traitement du cancer du côlon. Par rapport aux cellules normales, les cellules cancéreuses sont généralement caractérisées par une perturbation de l'homéostasie redox et une stratégie courante des thérapies anticancéreuses actuelles consiste à augmenter le stress oxydatif cellulaire (Yang et al, 2013). Bien que des niveaux physiologiquement faibles de ROS jouent un rôle important en tant que molécules de signalisation, une production excessive de ROS peut contribuer à l'instabilité et à la malignité du cancer (Liou et Storz, 2010). Paradoxalement, ce déséquilibre de l'homéostasie redox cellulaire rend les cellules cancéreuses plus vulnérables à la mort cellulaire induite par les ROS (Jaganjac et al., 2008 ; Nogueira et Hay, 2013). L'effet antiprolifératif du CTE rapporté dans cette étude peut être médié par divers mécanismes extra- et intracellulaires de composés connus et inconnus dans l'extrait, ciblant plusieurs voies qui jouent un rôle essentiel dans l'apoptose. Pour différencier les différents modes de mort cellulaire, nous avons étudié le mécanisme potentiel responsable de la cytotoxicité induite par le CTE observée

Nos données indiquent que la CTE augmente la production intracellulaire de ROS et par conséquent la mort cellulaire induite par les ROS. L'état Redox de la cellule joue également un rôle crucial dans la régulation de l'apoptose et la chaîne de transport d'électrons mitochondriale est l'un des sites majeurs de génération de ROS cellulaires (Trachootham et al., 2008). De plus, les ROS intracellulaires pourraient provoquer l'apoptose cellulaire via des voies dépendantes et indépendantes des mitochondries (Sinha et al., 2013). En effet, nos données indiquent également que l'externalisation de la phosphatidylsérine induite par le CTE est un effet courant de l'apoptose, dans les lignées cellulaires cancéreuses primaires et métastatiques, ce qui suggère que le mécanisme de la mort induite par le CTE est médié par l'apoptose plutôt que par la nécrose. L'activation de l'apoptose dans les cellules cancéreuses est une stratégie corrective et de nombreux médicaments anticancéreux peuvent exercer des effets apoptotiques dans les cellules cancéreuses.

Les composés ou extraits ayant des activités pro-apoptotiques dans les cellules cancéreuses sont donc potentiellement utiles dans la recherche de médicaments anticancéreux (Wong, 2011). Pour déterminer si l'effet pro-apoptotique induit par le CTE est médié par le mécanisme ROS induit par les mitochondries, nous avons mesuré la production de superoxyde à l'aide d'une sonde fluorescente ciblée sur les mitochondries dans les cellules traitées par le CTE. Nos données montrent clairement que la CTE stimule la production de superoxyde mitochondrial, ce qui suggère que l'activité anticancéreuse de Cistanche tubulosa est au moins en partie médiée par le mécanisme ROS induit par les mitochondries.

CONCLUSION

En conclusion, nos données suggèrent que l'extrait aqueux de la plante du désert Cistanche tubulosa pourrait représenter un candidat prometteur pour une approche anticancéreuse en combinaison avec d'autres thérapies conventionnelles pour la prévention et le traitement du cancer du côlon. Nous démontrons également que la toxicité de l'extrait de plante contre les cellules cancéreuses est médiée par une production intracellulaire accrue de ROS et, au moins en partie, par l'apoptose dépendante des mitochondries. D'autres études sont en cours pour isoler et caractériser les constituants biologiquement actifs individuels responsables de l'activité anticancéreuse.

Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour évaluer l'utilisation potentielle de cet extrait comme agent chimiopréventif efficace et pour comprendre les mécanismes d'action sur les cellules cancéreuses du côlon au niveau moléculaire. D'autres études précliniques et cliniques sont également nécessaires pour confirmer les effets bénéfiques observés sur la santé de Cistanche tubulosa pour la prévention du cancer.

REMERCIEMENTS

Soutien financier et parrainage : Cette étude a été soutenue par l'Anti-Doping Lab Qatar.

Conflit d'intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

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