Le cistanoside de Cistanche Herba améliore les dommages reproductifs masculins induits par l'hypoxie via la suppression du stress oxydatif-Ⅱ

Effets du Cis sur la viabilité des cellules GC-1 induite par l'hypoxie in vitro.

Pour déterminer si Cis peut prévenir les effets inhibiteurs de l'hypoxie sur la viabilité des cellules GC{{0}}, un test CCK-8 a été réalisé. Les cellules GC-1 ont été traitées avec différents sous-types (Cis-A, B, C, H) et plages de concentrations (0.02 μM, 0,2 μM, 2 µM) de Cis pendant 72 h. Une comparaison du groupe modèle avec le groupe DMSO a montré que le DMSO ne favorisait pas directement la viabilité des cellules GC{{10}} (Figure 2A). Cependant, les viabilités cellulaires ont été nettement restaurées (P < 0.05) avec les traitements Cis. Par rapport au groupe modèle, Cis-A, Cis-B, Cis-C et Cis-H ont tous montré certains effets protecteurs sur les dommages induits par l'hypoxie sur la viabilité cellulaire GC-1, et Cis-B a montré le plus significatif effet (figure 2A). Les effets protecteurs du Cis à 0,2 μM étaient significativement plus élevés que les effets protecteurs du Cis à 0,02 μM, tandis que la différence entre 2 μM et 0,2 μM n'était pas évidente, indiquant que le rétablissement La viabilité cellulaire GC-1 induite par Cis a démontré une augmentation dose-dépendante de la plage de concentrations de 0,02-0,2 μM (Figure 2A). Par conséquent, en fonction des besoins expérimentaux, 0, 2 µM de Cis a été sélectionné comme concentration optimale dans les expériences in vitro suivantes. Pour confirmer davantage si les cellules germinales étaient effectivement protégées par Cis, des colorations FCM et Ki -67 ont été réalisées pour évaluer l'altération de la prolifération des cellules GC -1 après un traitement avec Cis. Lors du traitement Cis, la proportion de cellules GC-1 dans la phase G1 a été réduite. En revanche, davantage de cellules sont entrées dans la phase S, ce qui suggère que le traitement par Cis pourrait augmenter l'indice de prolifération des cellules germinales (P < 0,01 ; Figure 2B). Les statistiques du cycle cellulaire GC-1 sont présentées dans la figure 2Bb. Les résultats de la coloration Ki-67 ont également montré que le traitement Cis-A, Cis-B, Cis-C et Cis-H améliorait de manière significative le rapport cellulaire Ki-67-positif des GC induites par l'hypoxie{{54} } cellules in vitro (Figure 2C).

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Le mécanisme du Cis protège les cellules germinales de l'hypoxie in vitro.

Pour déterminer si les effets protecteurs du Cis sur les cellules GC-1 étaient liés à l'élimination des ROS excessifs, le colorant fluorescent DCFH-DA a été utilisé pour détecter les niveaux de ROS dans chaque groupe. Comme le montrent les figures 3A et 3B, le traitement au DMSO n'a pas modifié la teneur en ROS intracellulaire ni le niveau de LPO par rapport au groupe modèle. Cependant, les niveaux de ROS dans les cellules GC-1 étaient nettement réduits dans les groupes traités au Cis (Figure 3A). De plus, une diminution de la LPO a également été observée dans les cellules GC-1 soumises au Cis (Figure 3B).

Pour explorer plus en détail le mécanisme par lequel Cis protège les cellules germinales des lésions hypoxiques, une coloration TUNEL et des analyses par Western blot ont été réalisées pour évaluer l'apoptose. La coloration TUNEL (Figure 3C) a montré une apoptose significative dans les groupes modèle et DMSO. Cependant, moins de cellules apoptotiques ont été observées avec le traitement Cis, ce qui indique que le traitement Cis réduit l'apoptose des cellules GC-1. De plus, l'expression de PARP, Caspase-3, Bax et Bcl-2 a été mesurée pour corroborer le mécanisme moléculaire. Comme présenté sur la figure 3D, la Caspase-3 et la PARP ont été activées dans les cellules GC-1 sous hypoxie, et cette activation a été inhibée par le traitement Cis. De plus, le rapport Bax/Bcl-2 était plus élevé dans le groupe modèle que dans le groupe témoin, et le traitement Cis a réduit le rapport Bax/Bcl-2 (Figure 3D). Ces données ont indiqué que Cis avait la capacité potentielle d'atténuer les dommages oxydants induits par l'hypoxie, et cet effet protecteur pourrait être obtenu en réduisant l'accumulation de ROS et en inhibant l'activation de la voie de l'apoptose liée à la caspase.

Le mécanisme enzymatique inhibant la SG implique des piégeurs de radicaux libres tels que la glutathion réductase (GR), la glutathion peroxydase (GPx) et la superoxyde dismutase (SOD) (23). Le mécanisme enzymatique inhibant la SG joue un rôle essentiel dans la prévention des dommages oxydatifs dans les cellules et les tissus [23]. Pour valider davantage le mécanisme potentiel d'inhibition par Cis de la SG induite par l'hypoxie dans les cellules GC-1, les activités de GR, GPx et SOD ont été mesurées. Les résultats ont révélé que les activités GR, GPx et SOD ont toutes diminué de manière significative (P < 0.01, Figure 3E) sous hypoxie par rapport aux groupes témoins, et le traitement Cis a nettement restauré leurs activités dans Cellules GC-1 exposées à l’hypoxie (P < 0,05, Figure 3E), suggérant que ces composés pourraient activer le puissant système antioxydant endogène.

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Effets du Cis sur la reproduction chez les rats hypobares induits par l'hypoxie.

Pour déterminer les effets de l'hypoxie hypobare sur les rats mâles, nous avons d'abord testé les altérations morphologiques des testicules chez des rats induits par l'hypoxie hypobare. Les résultats de la coloration HE ont montré que dans le groupe témoin, les cellules spermatogènes normales à différents stades étaient disposées de manière ordonnée depuis la membrane basale jusqu'à la lumière, et que les spermatozoïdes matures étaient visibles dans les lumières des tubules (Figure 4A). Par rapport aux témoins, des altérations pathologiques du tissu testiculaire ont été observées dans le groupe modèle, la membrane basale des cellules épithéliales testiculaires était disposée de manière lâche, l'épithélium spermatogène était extrêmement mince et le niveau et le nombre de cellules germinales étaient nettement réduits (Figure 4A). . Cependant, le traitement par Cis a remarquablement amélioré l’histologie des lésions testiculaires induites par l’hypoxie hypobare in vivo (Figure 4A). Nous avons également mesuré le poids corporel, le poids des testicules, le poids de l'épididyme et le poids des glandes vésiculaires séminales, ce qui a conduit au calcul de l'indice des organes reproducteurs (le rapport organe reproducteur/poids corporel). Comme le montre la figure 4B-D, l'indice des organes reproducteurs (testicules, épididyme et glande vésiculaire séminale) était nettement inférieur dans le groupe modèle (P < 0,01) que dans le groupe témoin. Cependant, l’effet de l’hypoxie hypobare sur l’indice des organes reproducteurs des rats a été inversé avec le traitement au Cis (Figure 4B-D).

Ensuite, l’activité enzymatique de l’acrosome et le taux de spermatozoïdes vivants du sperme de rat mâle ont également été mesurés pour élucider les dommages à la fonction testiculaire. Comme le montrent les figures 4E, 4F, l'activité enzymatique acrosomique et la motilité des spermatozoïdes étaient plus faibles chez les rats du groupe modèle que dans le groupe témoin (P < 0.01). Cependant, par rapport aux rats du groupe modèle, l'activité enzymatique acrosomique a été restaurée chez les rats traités avec 8 mg/kg/j de Cis (P < 0,05) (Figure 4D). De plus, comme le montre la figure 4F, le traitement avec Cis égalementamélioré le taux de spermatozoïdes vivants; les rats traités avec 8 mg/kg/j de Cis ont tous montré un taux de spermatozoïdes vivants significativement augmenté (55,83 ± 6,03 %, P < 0.05 ; 69,{ {8}} ± 2,29 %, P < 0,01 ; 52,33 ± 3,40 %, P < 0,05 et 53,67 ± 2,25 %, P < 0,05 respectivement) par rapport aux rats modèles (43,83 ± 4,01 %) .

Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l'environnement hypobare et hypoxique entraînait des altérations morphologiques des testicules, une perte de poids des organes reproducteurs et des dommages à la fonction testiculaire chez les rats mâles, et que le Cis pourrait protéger efficacement les organes reproducteurs des dommages induits par l'hypoxie.

Effets du Cis sur la SG dans les testicules de rats hypobares induits par l'hypoxie.

Les niveaux de ROS et de LPO dans les testicules de rats ont été mesurés pour analyser les effets du Cis sur la SG induite par l'hypoxie hypobare. L'analyse ROS a révélé que par rapport au groupe témoin, les niveaux de ROS dans les testicules du groupe modèle étaient significativement augmentés (P < 0.01 Figure 5A). À l’inverse, la LPO était considérablement élevée dans les testicules (P < 0,01) sous hypoxie hypobare par rapport aux conditions normoxiques (Figure 5B). Cependant, le traitement Cis a modifié les changements ci-dessus (P <0,05), dans lesquels Cis-B a exercé de meilleurs effets que les autres Cis (Figure 5A, 5B). Cis semble protéger les testicules en réduisant la SG dans des conditions hypobares et hypoxiques in vivo.

De plus, des analyses d'apoptose ont été effectuées pour évaluer plus en détail le mécanisme par lequel Cis se protégeait contre les lésions de la fonction testiculaire induites par l'hypoxie hypobare. Les résultats de la coloration TUNEL (Figure 5C) ont montré qu'une apoptose significative existait dans le groupe modèle par rapport au groupe témoin. Cependant, après le traitement au Cis (8 mg/kg/j), moins de cellules apoptotiques se sont produites (P < 0,05) (Figure 5C). Les données de Western blot ont également montré que l'hypoxie et le traitement hypobare entraînaient l'activation de la Caspase-3 et de la PARP et une augmentation du rapport Bax/Bcl-2 dans le tissu testiculaire, indiquant une augmentation de l'apoptose (Figure 5D). De plus, différents types deTraitement cisapoptose considérablement réduite dans le tissu testiculaire (Figure 5D). De même, l’analyse IHC du tissu testiculaire a montré des résultats similaires (Figure 1 supplémentaire).

Pour vérifier le mécanisme de la SG réduite en Cis déclenché par l'hypoxie hypobare, nous avons en outre testé les activités de GR, GPx et SOD dans le tissu testiculaire. Comme le montre la figure 5E, par rapport au groupe témoin, le traitement par hypoxie hypobare a réduit de manière significative les activités GR, GPx et SOD (P < 0.01). Cependant, le traitement au Cis a restauré les activités enzymatiques (GR, GPx et SOD) du tissu testiculaire chez les rats traités par hypoxie hypobare (P < 0,05). En conclusion, Cis semble protéger les testicules en activant un puissant mécanisme de défense enzymatique antioxydant endogène dans des conditions d’hypoxie hypobare.

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Discussion

Dans les zones de haute altitude, on sait que l'hypoxie hypobare affecte plusieurs systèmes chez l'homme, y compris le système reproducteur masculin (4, 20). Des recherches expérimentales récentes visent à comprendre les mécanismes par lesquels l'hypoxie hypobare altère le système reproducteur masculin. Dans cette étude, l'effet thérapeutique de l'extrait de Cis de Cistanches Herba sur les dommages reproducteurs induits par l'hypoxie a été étudié. Les résultats ont démontré que Cis peut protéger le système reproducteur masculin des dommages hypoxiques en réduisant l'accumulation de ROS induite par l'hypoxie et la SG en améliorant l'activité des enzymes antioxydantes endogènes.

Les ROS sont des radicaux libres dérivés de l'oxygène qui jouent un rôle essentiel dans la physiologie et la pathologie humaines. De faibles doses de ROS sont essentielles pourcapacitation des spermatozoïdes, la réaction acrosomique et la fusion spermatozoïdes-ovocytes [24, 25]. Cependant, une accumulation excessive de ROS entraîne souvent des dommages aux cellules germinales et aux cellules stromales, entraînant l’infertilité masculine (26). Les ROS peuvent facilement endommager les membranes cellulaires, les acides nucléiques, les protéines, les enzymes et d’autres macromolécules biologiques par peroxydation. De plus, ils entraînent également des dommages potentiels aux cellules et à l’ADN lorsqu’ils dépassent la capacité de transport des antioxydants. Les preuves accumulées soutiennent le rôle central des ROS dans la pathogenèse de la fertilité masculine (27, 28). La production de ROS est régulée par la tension d’oxygène. Dans des conditions hypoxiques, l'oxygène disponible dans l'environnement diminue et la viscosité du sang augmente, affectant ainsi de nombreux processus métaboliques dépendants de l'oxygène dans l'organisme [29, 30]. Cependant, la pression atmosphérique plus basse à haute altitude entraîne un mauvais retour veineux et une diminution de la quantité d’oxygène transportée par le sang vers toutes les cellules de l’organisme, ce qui augmente encore l’hypoxie des organes et des cellules [29, 30]. Ainsi, l’exposition à une altitude élevée donne lieu à une série de réponses physiologiques hypoxiques, notamment la production et l’accumulation de ROS, lorsque la demande en oxygène dépasse l’apport vasculaire. Comme mentionné précédemment, l’accumulation de ROS entraîne divers effets intracellulaires, dont le plus critique est de provoquer une OS dans les cellules.

L'OS fait référence à un déséquilibre entre les réactions d'oxydation et de réduction, conduisant à la génération d'un excès d'oxydants ou de molécules acceptant un électron d'un autre réactif, qui à son tour produit des ROS (31, 32). Il est bien connu que la SG peut être déclenchée par une série de facteurs endogènes et exogènes, notamment l’exposition à haute altitude. Les spermatozoïdes sont des cellules particulièrement sensibles à la SG en raison de leurs systèmes de réparation cellulaire inadéquats et de leur teneur élevée en acides gras polyinsaturés dans leur membrane plasmique [33]. Les tissus testiculaires et épididymaires ne font pas exception, puisque la présence d’une SG sévère a été observée dans les spermatides rondes de rats soumis à une hypoxie [4]. L'OS affecte la stabilité de l'ADN, mettant ainsi en péril l'intégrité du matériel génétique des gamètes [34-36]. Cependant, il a été confirmé qu'un niveau élevé de dommages à l'ADN dans les gamètes mâles conduit à l'activation de la signalisation de l'apoptose, ce qui entraîne une réduction du nombre de spermatozoïdes épididymaires et une augmentation du pourcentage de cellules défectueuses (28, 37). Dans la présente étude, l'hypoxie a réduit de manière significative la viabilité des cellules GC-1 grâce à l'induction de l'apoptose et à l'arrêt du cycle cellulaire. Plus important encore, l'analyse FCM après stimulation de l'hypoxie a montré une augmentation significative des niveaux de ROS, avec un taux d'apoptose accru et une activation plus élevée du rapport Caspase-3, PARP et Bax/Bcl-2, indiquant que les ROS pourraient s'activer apoptose en activant la voie de signalisation de la Caspase lors de dommages à la fertilité induits par l'hypoxie. Les présents résultats ont démontré que l’hypoxie entraînait une accumulation excessive de ROS, provoquant des dommages oxydatifs aux cellules reproductrices. Il est donc important d’identifier de nouveaux antioxydants pouvant constituer une approche efficace pour atténuer les lésions de fertilité induites par l’hypoxie.

Pour se protéger contre la SG, il existe dans l’organisme un système antioxydant complexe, principalement composé de facteurs enzymatiques. Dans des conditions physiologiques, la teneur en ROS et le système antioxydant maintiennent un certain équilibre. Cependant, la surproduction de ROS épuise le système antioxydant des spermatozoïdes, conduisant à la SG, ce qui provoque des dommages à l'ADN des spermatozoïdes et entraîne une baisse des taux de fertilité et de grossesse (23). Ainsi, pour lutter contre la surproduction de ROS et ses effets délétères au niveau cellulaire dans le système reproducteur masculin, différentes stratégies antioxydantes ont été testées (23). Actuellement, la littérature concernant l'utilisation de composés ayant une activité antioxydante etamélioration de la fonction des spermatozoïdesest vaste. Il est important de noter que la plupart des rapports décrivent une amélioration des paramètres du sperme après la prise orale d'antioxydants, notammentaméliorations de la concentration des spermatozoïdeset la motilité ou une diminution des dommages à l'ADN (38). Ainsi, un nombre croissant d'urologues prescrivent des antioxydants oraux pour l'infertilité due à des problèmes liés à la SG [39]. Ces antioxydants comprennent principalement les carnitines, les vitamines, le zinc, la mélatonine et les composés naturels [23, 40]. Actuellement, avec le développement de la technologie d'extraction de médicaments, un nombre croissant d'extraits de MTC sont également envisagés pour atténuer l'infertilité masculine, car ces antioxydants peuvent réduire les effets destructeurs de la SG (41). Yuce A. et al. rapporté en 2013 que la cannelle avait des effets bénéfiques sur l'équilibre oxydatif et antioxydant des testicules et sur la qualité du sperme [42]. Zhang L et coll. ont montré que la curcumine améliore significativement la motilité des spermatozoïdes chez les patients et diminue le H2O2 [43]. En outre, il a également été démontré qu'une variété d'autres extraits de plantes tels que la myrtille, le crocus sativus, les graines de grenade et le thé vert protègent le système reproducteur via des mécanismes antioxydants [27, 44-47]. Cistanches Herba est un MTC important qui possède un profil de sécurité favorable et de larges fonctions médicinales pour le traitement de l'infertilité, entre autres conditions [13]. Des études pharmacologiques modernes ont montré que Cistanches Herba possède diverses activités, telles que des activités antioxydantes, anti-inflammatoires, hépatoprotectrices et anti-neurodégénératives [13, 48]. Par conséquent, les extraits, fractions ou composés de Cistanches Herba peuvent avoir des propriétés antioxydantes potentielles pour le traitement de l'infertilité.

Les substances actives des plantes qui améliorent la fertilité comprennent divers groupes chimiques tels que les PhG, les saponines, les composés volatils oxygénés et les alcaloïdes (41). Des études sur l'activité pharmacologique des PhG ont démontré que les PhG présentent un large éventail de bioactivités, telles que l'antioxydation, la neuroprotection antiradiation et l'amélioration de la fonction sexuelle (49, 50). Parmi ces activités, l’antioxydation retient progressivement l’attention. Il a été rapporté que certains composants ou fractions de PhG inhibent l'apoptose des cellules germinales induite par divers produits chimiques, et leurs capacités antioxydantes in vitro ont également été démontrées in vivo dans plusieurs modèles animaux (51, 52). Ces résultats indiquent que les PhG pourraient être un candidat intéressant pour letraitement de l'infertilité masculine. Cis est une PhG active qui peut être isolée de Cistanches Herba. Dans la présente étude, nous avons exploré les effets du Cis sur des cellules traitées par hypoxie ou sur un modèle de rat et étudié les mécanismes moléculaires sous-jacents. Cis a présenté des activités protectrices sur la diminution de la viabilité induite par l'hypoxie et l'augmentation de l'apoptose dans les cellules GC-1, et a également montré un effet protecteur sur les dommages induits par l'hypoxie dans le système reproducteur des rats in vivo. Une diminution significative des activités GR, GPx et SOD sous hypoxie par rapport aux groupes normoxiques a été observée, tandis que les activités spécifiques de GR, GPx et SOD ont augmenté de manière significative dans les testicules ou les cellules GC-1 traitées avec Cis. Cis semblait protéger les testicules et les cellules GC-1 dans des conditions hypoxiques en renforçant les activités des enzymes antioxydantes.

Les antioxydants enzymatiques fonctionnent principalement en éliminant les anions superoxydes, empêchant ainsi la peroxydation lipidique et les dommages à l'ADN pour prévenir l'infertilité. Les mécanismes enzymatiques antioxydants jouent un rôle crucial dans la prévention des dommages oxydatifs [23]. Le mécanisme enzymatique contre l'OS comprend des piégeurs de radicaux libres et des enzymes dépendantes du glutathion, notamment GR, GPx et SOD (12). Il est bien connu que les enzymes antioxydantes sont essentielles au système reproducteur masculin. Dans la présente étude, l'effet de la réduction des activités des enzymes antioxydantes sous hypoxie hypobare s'est accompagné d'une augmentation des ROS et de la LPO dans le groupe modèle, ce qui concorde avec les rapports précédents (12). Cependant, l'administration de Cis a conduit à une récupération des activités enzymatiques antioxydantes dans les cellules GC-1 et les testicules de rats, permettant ainsi de générer des stratégies d'administration de Cistanches Herba pour prévenir les dommages induits par l'hypoxie hypobare, comme suggéré précédemment. Bien que les résultats actuels aient montré que le traitement au Cis réduisait en partie les dommages aux cellules germinales induits par l'hypoxie chez le rat, des recherches plus approfondies sont nécessaires pour dresser le tableau complet de ses effets protecteurs sur la reproduction. Par exemple, le mécanisme spécifique du Cis affecte l’activité des enzymes antioxydantes. En outre, la question se pose de savoir si d’autres mécanismes pourraient également être pertinents, étant donné que Cis ne s’est que partiellement remis des dommages reproductifs causés par l’hypoxie. Enfin, il convient également de déterminer si le Cis a un effet direct favorisant la croissance sur les cellules germinales.

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Conclusions

En général, les résultats de cette étude soulignent le potentiel du Cis en tant qu’antioxydant pour le traitement des lésions reproductives masculines induites par l’hypoxie. Cis peut protéger contre les dommages reproductifs masculins induits par l'hypoxie en rétablissant l'activité enzymatique antioxydante, en réduisant la SG induite par les ROS, en augmentant simultanément la viabilité cellulaire et en diminuant l'apoptose. Il est important de noter que les sous-types Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C et Cis-H) étudiés dans cette étude ont tous montré un certain effet protecteur sur le système reproducteur, et Cis-B a montré l'effet le plus significatif. Par conséquent, nous pensons que Cis pourrait être un bon candidat antioxydant pour letraitement des lésions reproductives masculines induites par l'hypoxie, bien que le mécanisme sous-jacent précis nécessite des recherches plus approfondies.