Huiles essentielles contenant du citral en tant qu'inhibiteurs potentiels de la tyrosinase : une approche de fractionnement bioguidé

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Résumé:

Une production excessive de mélanine provoque des affections dermatologiques graves ainsi que des problèmes esthétiques mineurs (c'est-à-dire des taches de rousseur et des lentigos solaires). La régulation à la baisse de la tyrosinase est une approche répandue pour le traitement de ces troubles, et les extraits de plantes se sont souvent révélés être des sources précieuses detyrosinaseinhibiteurs. Le citral (un mélange de néral et de géranial) est un ingrédient parfumant important qui a montré un potentiel anti-tyrosinase. Il est fortement concentré dans les huiles essentielles (HE) de Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. et Verbenaofficinalis L. Cependant, seule l'HE de L. cubeba a été étudiée pour utiliser comme agent potentiel de blanchiment de la peau. Ce travail évalue l'in vitrotyrosinasel'activité inhibitrice de ces HE et étudie, à l'aide d'un fractionnement orienté bio-essai, si leurs différentes compositions chimiques influencent les activités inhibitrices globales de l'EO via d'éventuelles interactions synergiques, additives et/ou compétitives entre les composants des HE. L'activité inhibitrice de l'HE de C. schoenanthus et celle des HE de M. officinalis, avec des quantités négligeables (+) de citronellal, étaient en ligne avec leur teneur en citral. En revanche, les HE de L. cubeba et de V. officinalis ont inhibétyrosinasedans des proportions considérablement plus importantes car ils contenaient du -myrcène, qui a contribué aux activités globales d'OT. Des observations similaires ont été faites pour M. officinalis EO, qui porte une teneur élevée (plus) en citronnellal qui a augmenté l'activité citrale.

Mots clés:tyrosinaseinhibition; huiles essentielles; citral

cistanche a une fonction blanchissante

Introduction

Tyrosinaseest l'enzyme clé de la biosynthèse des pigments de mélanine chez plusieurs bactéries, champignons, plantes, animaux et humains. Chez l'homme, la tyrosinase catalyse les étapes limitantes de la voie de biosynthèse de la mélanine. Cette biosynthèse est caractérisée par plusieurs réactions enzymatiques et chimiques qui conduisent à la formation de mélanine à partir de l'acide aminé L-tyrosine, la tyrosinase catalysant son hydroxylation en o-dopaquinone via ses activités mycophénolate et diphénols. Bien qu'il existe d'autres enzymes impliquées dans la mélanogénèse, seules les réactions catalysées par la tyrosinase ne peuvent pas se produire spontanément, alors que les étapes restantes peuvent se dérouler sans activité enzymatique à pH physiologique [1]. Pour cette raison, la régulation négative de la tyrosinase est une approche très répandue pour la réduction de l'excès de mélanine. la production et l'utilisation d'inhibiteurs de la tyrosinase comme agents de blanchiment de la peau ont démontré une importance clinique et cosmétique significative [2].

Sur le marché de l'UE, letyrosinaseLes inhibiteurs utilisés comme agents de blanchiment de la peau peuvent être regroupés en deux catégories principales : ceux interdits par le règlement cosmétique de l'UE 1223/2009 (c'est-à-dire l'hydroquinone et l'hydroquinone d'éther monobenzylique) en raison de leurs effets secondaires graves, mais qui sont toujours utilisés pour traiter l'hyperpigmentation sous contrôle médical. supervision ; et les inhibiteurs de la tyrosinase dont l'utilisation est autorisée dans les produits cosmétiques (c.-à-d. l'arbutine, l'aloésine, l'acide kojique) [2,3]. Ce deuxième groupe, cependant, est toujours caractérisé par des effets secondaires potentiellement significatifs ; des études cliniques sur l'acide kojique ont en effet mis en évidence des cas d'érythème, de sensations de picotements, et d'eczéma de contact après application. De même, le comité scientifique européen sur la sécurité des consommateurs a soulevé des inquiétudes concernant l'utilisation des arbutines un ingrédient cosmétique [2], en raison de l'hydrolyse potentielle de sa liaison glycosidique qui libère de l'hydroquinone. Il existe donc un besoin de nouvelles matrices de molécules et/ou de mélanges de composés bioactifs pour traiter l'hyperpigmentation.

Les plantes ont été des sources précieuses d'agents de blanchiment de la peau, et trois des cinq agents les plus utilisés, à la fois médicalement et cosmétiquement, sont des métabolites végétaux spécialisés (c'est-à-dire l'hydroquinone, l'arbutine, l'aloésine). À ce jour, les composés phénoliques ont principalement été étudiés comme potentieltyrosinaseinhibiteurs, et ceux-ci comprennent les flavonoïdes (par exemple, la quercétine [4]), les stilbènes (par exemple, le resvératrol [1]), les phénylpropanoïdes (par exemple, le cinnamaldéhyde [5] et l'eugénol [6]) et les acides phénoliques (par exemple, l'acide anisique et acide benzoïque [7]). L'intérêt pour les terpénoïdes a été considérablement plus faible et ils ont été relativement sous-étudiés en tant qu'agents anti-tyrosinase.

Le citral fait partie du nombre limité de dérivés terpénoïdes aux propriétés anti-tyrosinase qui ont été étudiés. C'est un mélange de deux isomères, cis- et trans-3,7-diméthyl-2,6-octadiénal (c'est-à-dire, néral et géranial), dont il a été prouvé qu'ils bloquent l'activité enzymatique in vitro du champignontyrosinase[8]. En plus de son importance en tant qu'ingrédient odorant dans les boissons, les aliments et les cosmétiques, le citral a montré des activités biologiques in vitro prometteuses, notamment des effets antifongiques, antibactériens, antioxydants et anti-inflammatoires [9-11]. De plus, des études récentes ont ont souligné que le citral a une importance thérapeutique potentielle en tant que relaxant des muscles lisses et anesthésique local, car il favorise la relaxation des muscles lisses trachéaux, utérins et aortiques et inhibe l'excitabilité nerveuse dans les modèles animaux [12-15].

Le citral est obtenu à partir des huiles essentielles (HE) de plusieurs espèces botaniques, dont Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. et Verbena officinalis L. Au meilleur des auteurs connaissance, seul L. cubeba EO a été étudié pour satyrosinaseactivité inhibitrice [16]. Par conséquent, cette étude vise à évaluer les activités inhibitrices de la tyrosinase des HE de C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis et V.officinalis, à l'aide d'un test colorimétrique in vitro, afin d'évaluer si les différentes compositions chimiques influencent les activités inhibitrices globales de l'OE via n'importe quel d'éventuelles interactions synergiques, additives et/ou compétitives entre leurs composants. Cette étude utilise une approche de fractionnement guidée par essai biologique pour évaluer de manière exhaustive les constituants des HE et leurs énantiomères, lorsqu'ils sont chiraux, qui contribuent à l'activité inhibitrice des HE contre une source de champignon de tyrosinase, qui est un bon système modèle pour le criblage préliminaire detyrosinaseinhibiteurs [17].

2. Résultats et discussion

2.1. Composition chimique et teneur en citral de l'huile essentielle étudiée

Dans notre tentative de caractériser de manière exhaustive tous les composants EO potentiels qui contribuent à l'activité biologique considérée, les EO étudiés ont été analysés par GC, avec détection FID et MS. Les pourcentages d'abondance relatifs normalisés (calculés à partir des aires absolues normalisées par rapport à l'étalon interne C13 en utilisant des facteurs de réponse [18,19]) de tous les composés détectés ont été déterminés et utilisés pour comparer les compositions d'OE. La figure 1 présente le profil GC-MS des HE étudiés analysés avec une colonne conventionnelle. Le tableau 1 répertorie, pour chaque EO étudié, les composés qui affichent un pourcentage d'abondance normalisé supérieur à 0.1, tandis que les compositions chimiques complètes de l'EO sont rapportées dans les documents supplémentaires (tableaux S1 à S5).

Toutes les HE étudiées sont riches en néral (cis{{0}},7-diméthyl-2,6-octadiénal) et géranial (trans-3,{ {5}}diméthyl-2,6-octadiénal), qui sont les composés les plus abondants. Le rapport thenéral/géranial était très similaire dans toutes les HE étudiées et correspondait à0.74 ± 0.05. Les HE de C. schoenanthus et de L. cubeba affichent la teneur en néral et en géranial la plus élevée, qui représente en moyenne 60 % de l'ensemble de leurs compositions d'HE, et qui est 1,5- fois supérieure à celle de V. officinalis et en les trois HE de M. officinalis (c'est-à-dire les échantillons 1, 2 et 3). Les composés oxygénés supplémentaires communs à toutes les HE sont le 6-méthyl-5-heptène-1-one, le linalol et le citronellal. Cette dernière est significativement plus abondante dans l'OE 1 de M. officinalis que dans les autres HE étudiées, dont les OE2 et 3 de M. officinalis.

L'abondance de la fraction hydrocarbure varie significativement dans les différentes HE.M. officinalis EO 1 ne contient que du trans- -caryophyllène et -humulène sous forme d'hydrocarbures sesquiterpéniques, qui représentent respectivement 2,7 % et 0,13 % de l'EO total. L'OE de C.schoenanthus présente une fraction d'hydrocarbures légèrement plus riche que l'OE 1 de M. officinalis (c'est-à-dire 7,0 pour cent), contenant les deux monoterpènes (c'est-à-dire camphène, cis{{1{{20 }}}}ocimène, limonène, -pinène,trans- -ocimène, -thujène) et sesquiterpènes (c'est-à-dire trans- -caryophyllène, -cadinène,δ-cadinène, germacrene D, -élémène) les montants. Dans les HE de L. cubeba et de V.officinalis, la fraction d'hydrocarbures représente 20 % de l'OE totale et le limonène est le composé le plus abondant (c'est-à-dire 15,0 et 10,9 %, respectivement), suivi par le -pinène, le pinène , sabinène, trans- -caryophyllène, -myrcène, camphène et -copaène. Enfin, M.officinalis EO 2 et 3 sont caractérisés par la teneur en fraction d'hydrocarbures la plus élevée (38,8 % et 31,8 % de l'OE total, respectivement). Dans les deux échantillons, la fraction d'hydrocarbures contient principalement des sesquiterpènes, à savoir le trans- -caryophyllène (27,8 % et 20,0 %, respectivement) et -humulène (3,0 % et 2,6 % ), et une fraction monoterpénique réduite qui est principalement caractérisée par le limonène ( 4,2 % et 3,2 %, respectivement).

Trois échantillons d'HE de L. cubeba, V. officinalis et C. schoenanthus produits au cours de différentes années ainsi que trois échantillons d'HE de M. officinalis provenant de fabricants distincts ont été étudiés. Les analyses GC-MS de C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis et V. officinalis n'ont pas révélé de différences qualitatives et quantitatives significatives dans la composition chimique des trois échantillons d'années de production différentes. Cela peut être attribué à des conditions de stockage optimales, c'est-à-dire dans un récipient en verre ambré à 4 ◦C dans l'obscurité avec un espace de tête négligeable. D'autre part, les analyses GC-MS ont montré des différences significatives dans les abondances de citronellal et de trans{{4 }}caryophyllène dans les trois HE de M. officinalis étudiées. La citronnelle s'élevait à 19,6 %, 0,26 % et 0,31 % dans les M. officinalis OE 1, 2 et 3, respectivement. Au contraire, comme décrit précédemment, le trans- -caryophyllène est considérablement plus abondant dans les HE 2 et 3 de M. officinalis que dans l'OE 1 de M. officinalis. Ces résultats sont en accord avec les découvertes rapportées par Seidler-Lozykawska et al., qui ont mis en évidence des différences significatives dans les abondances de citral, de citronellal et de trans- -caryophyllène dans les HE obtenues à partir de 22 génotypes sélectionnés de M. officinalis provenant de jardins botaniques européens [20].

Une véritable quantification a été effectuée par l'étalonnage standard externe pour évaluer avec précision l'abondance de composés bioactifs spécialisés potentiels (c'est-à-dire, néral, géranial, limonène, -myrcène et citronellal. Quantification MS des composés marqueurs à l'étude avec la plage d'étalonnage, l'équation de la courbe d'étalonnage, les valeurs de corrélation et l'erreur standard de régression de chaque analyte et les résultats de quantification, respectivement.

2.2. Activité inhibitrice in vitro des huiles essentielles étudiées contre la tyrosinase de champignon

Comme décrit précédemment, les HE de C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba et V.officinalis présentent des niveaux élevés de citral, qui se caractérise par une activité inhibitrice non compétitive contre une source fongique de tyrosinase [8,16,21] . Cette étude visait à examiner les in vitrotyrosinaseactivités inhibitrices de ces HE pour explorer si leur activité inhibitrice peut être attribuée à leur teneur en citral uniquement, ou s'il existe d'autres composés bioactifs qui influencent les effets inhibiteurs des HE.

Champignontyrosinasea été adopté ici en raison de sa forte homologie avec la tyrosinase humaine, de son coût relativement faible et de sa disponibilité immédiate, qui en font un bon système modèle pour le criblage préliminaire des inhibiteurs de la tyrosinase [17]. La précision de l'in vitrotyrosinaseLe test d'inhibition enzymatique a été évalué en termes de répétabilité (en effectuant le test d'inhibition enzymatique cinq fois dans la même journée) et de précision intermédiaire (en répétant le test d'inhibition enzymatique cinq fois toutes les quatre semaines sur une période de six mois). Le tableau 4 rapporte le coefficient de variation (CV) pour les tests d'inhibition réalisés avec l'acide kojique, qui a été utilisé comme témoin positif, et avec l'HE de L. cubeba. Les résultats ont été satisfaisants car le CV n'a jamais dépassé 7 % pour la répétabilité et 10 % pour la précision intermédiaire. Le tableau 4 rapporte le coefficient de variation des tests d'inhibition réalisés avec l'acide kojique, utilisé comme témoin positif, et avec l'HE de L. cubeba. Des valeurs de précision similaires ont été obtenues pour tous les HE testés.

La courbe concentration-réponse du citral a été étudiée en traçant l'activité inhibitrice observée en fonction de sa concentration dans le mélange réactionnel. Toutes les HE ont été testées à une concentration de 166,7 µg/mL, ce qui a fourni, quelle que soit l'HE, une concentration de citral résultante dans sa plage de linéarité de la courbe concentration-réponse (y=0.3956x plus 1,8094,R{{7} }.9951, erreur de régression : 2,08448, plage de linéarité : 6,7 à 166,7 µg/mL) et n'a pas généré de problèmes de solubilité dans le mélange réactionnel.

La boîte à moustaches rapportée à la figure 2 présente le pourcentage detyrosinaseinhibition pour chaque HE. Pour les HE de L. cubeba, V. officinalis et C. schoenanthus, les résultats rapportés dans la Figure 2 correspondent à l'activité inhibitrice de la tyrosinase de champignon des HE de 2020car l'analyse de la variance n'a révélé aucune différence statistiquement significative entre les HE de différentes années de production (p > 0,05). En ce qui concerne les HE de L. cubeba et C. schoenanthus, ces résultats sont en bon accord avec les résultats obtenus à partir des analyses quantitatives GCMS qui ont révélé une quantité de citral presque identique dans les HE des différentes années de production. Le lot 2020 de V. officinalis EO contient une quantité de citral légèrement plus élevée que les lots 2019 et 2018. Cependant, selon la courbe concentration-réponse en citral, l'excès de citral dans le lot 2020 n'est pas suffisant pour déterminer un pourcentage statistiquement plus élevé d'inhibition enzymatique compte tenu de l'aléatoire. erreur associée aux mesures. Pour plus de détails, voir la figure S1 dans le matériel supplémentaire. D'autre part, l'analyse de variance (ANOVA) suivie d'un post-hoctest de Tukey-Kramer a révélé que les trois HE de M. officinalis testées, fournies par des fabricants distincts, inhibaient le champignontyrosinaseà des degrés divers, qui seront décrits plus en détail dans les paragraphes suivants. Les plus grandes activités inhibitrices ont été observées pour les HE de L.cubeba, M. officinalis 1 et V. officinalis, qui ont inhibé 59 ± 6 %, 55 ± 7 % et 52 ± 6 % detyrosinaseactivité, respectivement, lorsqu'ils sont testés à une concentration de 166,7 µg/mL. Des activités plus faibles statistiquement significatives (p <0.05) ont="" été="" observées="" pour="" les="" he="" de="" c.="" schoenanthus="" et="" m.officinalis="" 2="" et="" 3="" dont="" l'activité="" inhibitrice="" enzymatique="" était="" de="" 42="" ±="" 5="" %="" ,="" 40="" ±="" 5="" %="" et="" 38="" ±="" 6="" pour="" cent,="" respectivement.="" le="" tableau="" 5="" fournit="" la="" concentration="" d'inhibiteur="" qui="" a="" réduit="" de="" moitié="" l'activité="" enzymatique="" dans="" les="" conditions="" expérimentales="" données="" (ci50)="" pour="" chaque="" inhibiteur="" étudié="" (c'est-à-dire="" les="" he,="" les="" composés="" simples="" et="" l'acide="" kojique).="" toutes="" les="" he="" ont="" inhibé="" efficacement="" la="" tyrosinase="" des="" champignons="" et="" ont="" montré="" une="" activité="" inhibitrice="" en="" moyenne="" 100-="" fois="" inférieure="" à="" celle="" de="" l'acide="" kojica,="" utilisé="" comme="" contrôle="">

2.3. Identification de composants bioactifs supplémentaires, en plus du citral, par fractionnement guidé par bioessai seuls composés actifs dans les HE étudiées. Ces valeurs ont été mesurées par interpolation à partir de la courbe concentration-réponse du citral. Comme on peut le noter, C. schoenanthus, M. officinalis 2 et M. officinalis 3 ont affiché des activités inhibitrices en ligne avec leur teneur en citral, tandis que L. cubeba, M. officinalis 1 et V. officinalis ont inhibé les HE de champignons. tyrosinase plus que prévu. Une approche bioguidée a été adoptée pour identifier les composés supplémentaires qui contribuent à l'activité citrale. Les fractions oxygénées et hydrocarbonées des HE de L. cubeba, M. officinalis 1 et V. officinalis ont été isolées par chromatographie flash et testées individuellement pour leur champignontyrosinaseactivités inhibitrices. Les fractions phytohemical testées pour leurs activités inhibitrices de la tyrosinase de champignon. Les fractions fractions phytochimiques ont été testées à la même concentration que leur concentration résultante lors du test de 166,7 µg/mL de l'HE respective (voir la section Matériels et méthodes à la section 3.2). Le tableau 6 rapporte la concentration de néral, géranial, citronellal, limonène, et -myrcène dans les fractions oxygénées et hydrocarbonées des HE fractionnées.

En ce qui concerne les HE de L. cubeba et de V. officinalis, les fractions oxygénées et hydrocarbonées ont inhibé la tyrosinase des champignons, bien qu'à des degrés différents. Les activités des fractions oxygénées (53 ± 3 pour cent et 44 ± 5, respectivement) représentent la plupart des EOsanti-tyrosinasepotentiel et étaient en ligne avec la teneur respective en citral, suggérant que les composés qui contribuent à l'activité citrale appartiennent aux fractions d'hydrocarbures. Les fractions d'hydrocarbures des HE de L. cubeba et de V. officinalis présentent des compositions chimiques assez similaires. Limonène (68,4 et 50,3 %, respectivement), trans- -caryophyllène (12,0 et 7,8 %, respectivement), -pinène (1,7 et 7,5 %, respectivement), -pinène (2,5 et 12,9 pour cent, respectivement), sabinène (2,7 et 3,8, respectivement) et -myrcène (2,0 et 2,4 pour cent, respectivement) sont les composés les plus abondants dans les deux fractions et sont présents en quantités assez similaires, à l'exception de -pinène et -pinène, qui prédominent dans la fraction hydrocarbonée de V. officinalis EO.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 pour cent dans les deux HE), le limonène (97 et 94 pour cent dans l'HE de L. cubeba et V. officinalis, respectivement) et le sabinène (87 pour cent dans les deux HE), tandis que différents excès énantiomériques ont été observés pour le -pinène ((-)- énantiomère : 38 % dans L. cubebaEO et 73 % dans V. officinalis EO) et -pinène ((-)-énantiomère : 67 % dans L. cubeba EO et 88 % dans V. officinalis EO). Dans les deux HE, le (-)-limonène représente plus de 50 % de la fraction totale. Cependant, bien que des études antérieures aient rapporté une activité inhibitrice contre la tyrosinase de champignon en raison de sa forte abondance [22,23], le (-)-limonène n'a pas montré ici d'activité inhibitrice de la tyrosinase. Des résultats similaires ont été obtenus pour le (plus)-limonène, le mélange racémique et les composés (-)-trans- -caryophyllène, (±)- -pinène et (±)- -pinène . Sabinene n'a pas été testé car il avait déjà été prouvé qu'il avait des champignons négligeablestyrosinaseeffets inhibiteurs [8]. En accord avec les découvertes précédentes [8], le myrcène a réduit l'activité de la tyrosinase des champignons. Testée à la concentration observée à 166,7 µg/mL d'HE de L. cubeba et V. officinalis, l'activité -myrcène a comblé l'écart entre les effets inhibiteurs attendus des HE si le citral était le seul composé actif et les résultats expérimentaux. Contrairement aux observations de Matsuura et al. [8], le -myrcène s'est avéré être un inhibiteur de la tyrosinase de champignon plus puissant que le citral, car son IC50 était presque dix fois plus faible (13,3 µg/mL contre 121,8 µg/mL). Cette différence peut être attribuée aux différents substrats utilisés ; Matsuura et al. n'ont étudié que l'activité diphénolase de la tyrosinase de champignon, car ils utilisaient la L-DOPA comme substrat, alors que, dans cette étude, la L-tyrosine était utilisée. Les découvertes actuelles suggèrent que le -myrcène pourrait être plus efficace pour inhiber l'activité de la tyrosinase monophénolase des champignons que celle de la diphénolase.

L'OE 1 de M. officinalis affiche une petite fraction d'hydrocarbures qui représente moins de 3 % du total et n'a aucune activité inhibitrice de la tyrosinase. Cependant, la fraction oxygénée de M. officinalisEO 1 a inhibé la tyrosinase de champignon dans une plus grande mesure que ce à quoi on pourrait s'attendre d'après sa teneur en citral (Figure 3). Cette fraction contient des quantités importantes de citronellal en plus du néral et du géranial et l'analyse chirale a révélé une pureté énantiomère élevée du citronellal en faveur de l'énantiomère (plus) (98,3 pour cent). Lorsqu'il a été testé indépendamment, à une concentration de 166,7 µg/mL, le (plus)-citronellal a inhibé la tyrosinase de champignon dans une mesure négligeable, bien que son activité ait été significativement améliorée lorsqu'il a été testé en association avec le citral. Ces résultats peuvent expliquer les différences observées dans les pourcentages de champignonstyrosinaseinhibition dans les différentes HE de M. officinalis. M.officinalis EO 2 et 3 présentent de très faibles teneurs en citronellal, ce qui peut expliquer pourquoi leurs activités inhibitrices sont nettement inférieures à celle de M. officinalis EO 1.

3. Matériels et méthodes

3.1. Réactifs

Diméthylsulfoxyde (DMSO), tyrosinase de champignon d'Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tyrosine, acide kojique, citral, citronellal, -myrcène, ( plus )-limonène, (-)-limonène,(±)-limonène, ( ±)- et le pinène ont été achetés chez Merck Life Science Srl (Milan, Italie). Les HE de Litsea cubeba, Verbena officinalis et Cymbopogon schoenanthus ont été fournies par Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Italie). Trois lots d'années différentes (c'est-à-dire 2020, 2019, 2018) ont été testés pour chacun. Trois échantillons d'HE de Melissa officinalis ont été étudiés ; l'un a été fourni par Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), un par ErboristeriaMagentina Srl, tandis que le dernier a été acheté dans un magasin local et provenait de Specchiasol S.rl (Bussolengo, Italie). Dans le texte, les auteurs désignent les différentes HE de Melissaofficinalis comme les HE de M. officinalis 1, 2 et 3, respectivement. Les HE fournies ont été obtenues selon les procédures décrites dans la Pharmacopée Européenne [24]. Les HE de Melissa officinalis et de Verbena officinalis ont été produites respectivement par hydrodistillation à partir des parties aériennes des feuilles et des plantes ; de même, les HE de Litsea cubeba et de Cymbopogon schoenanthus ont été obtenues respectivement par distillation à la vapeur des fruits frais et des parties aériennes fraîches. Chaque HE a été analysée individuellement par GC-MS dès son achat/fourni par le fabricant correspondant, chaque année de stockage, et juste avant l'étude de son activité inhibitrice de la tyrosinase de champignon.

3.2. Test d'inhibition de la tyrosinase in vitro

Latyrosinaseles activités inhibitrices des HE et des composés isolés ont été étudiées in vitro à l'aide d'un dosage enzymatique basé sur la lecture colorimétrique optimisé par Zengh et al. [25], avec de légères modifications. Les activités inhibitrices de la tyrosinase des HE, ainsi que leurs fractions hydrocarbonées et oxygénées respectives et leurs composés purs ont été étudiées in vitro à l'aide d'un dosage enzymatique basé sur la lecture colorimétrique optimisé par Zengh et al. [25], avec de légères modifications : le dosage a été réalisé à température ambiante ettyrosinasel'inhibition a été mesurée en considérant le contrôle et l'absorbance de l'échantillon après 6 min d'incubation, plutôt qu'après 20 min, de manière à opérer sous la partie linéaire de la réaction enzymatique, ce qui fournit des résultats d'inhibition plus précis [26,27]. La tyrosinase de champignon d'Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach a été sélectionnée pour cette étude. La L-Tyrosine a été utilisée comme substrat, ce qui signifie que l'activité inhibitrice globale de la tyrosinase a été étudiée sans faire la distinction entre l'activité de la tyrosinase monophénolase et celle de la diphénolase. Les solutions des inhibiteurs potentiels étudiés (OE, fractions isolées d'OE, composés individuels d'OE et acide kojica) ont été préparées dans du DMSO. Le tableau 7 rapporte les concentrations testées pour chaque inhibiteur potentiel étudié. Le champignontyrosinasela solution 200 U/mL (27,9 µg/mL) a été préparée dans du tampon phosphate de sodium (pH 6,8) et des aliquotes de 9 mL ont été stockées à -18 ◦C et décongelées juste avant les expériences. Une solution de tyrosine 0.1 mg/mL a été préparée dans un tampon phosphate de sodium (pH 6,8) et renouvelée quotidiennement. Les composants du mélange réactionnel ont été placés dans le flacon dans l'ordre suivant : 1 mL de solution de tyrosinase de champignon 200 U/mL ; 1 ml de solution tampon de phosphate de sodium ; 10 µL de solution EO/monocomposé/acide kojique ; et enfin 1 mL de solution de tyrosine 0,1 mg/mL. Le pourcentage final de DMSO dans le mélange réactionnel était de 0,3 %. Le test a été effectué dans un flacon scellé de 4 ml pour éviter la perte de tout composant EO dans l'environnement environnant et pour minimiser leur libération dans l'espace de tête au-dessus du mélange réactionnel. Le mélange réactionnel a été incubé dans un bain-marie thermostaté à 25 ◦C pendant 6 min. Par la suite, l'absorbance à 475 nm a été enregistrée, car cette longueur d'onde permet l'identification du dopachrome. L'absorbance correspondant à 100 % de l'activité de la tyrosinase a été mesurée en remplaçant la solution d'OE/composé individuel/acide kojique par 10 µL de DMSO pur. Des solutions à blanc ont été préparées comme suit : 2 mL de solution tampon de phosphate de sodium, 10 µL d'OE/composé individuel /solution d'acide kojique/DMSO et 1 mL de solution de tyrosine 0,1 mg/mL. Le pourcentage d'inhibition de la tyrosinase a été mesuré selon l'équation ci-dessous : pourcentage d'inhibition=∆A (Contrôle) − ∆A (Échantillon) / ∆A (Contrôle) × 100,∆A (Contrôle) ou (Échantillon) {{ 33}} A475 (Contrôle) ou (Échantillon) − A475 (Témoin à blanc) ou (Échantillon à blanc).

3.3. Chromatographie sur colonne flash

Le fractionnement de l'OE a été effectué sur un système de chromatographie sur colonne flash PuriFlash450 de Sepachrom (Rho, Milan, Italie), équipé de détecteurs UV et ELSD. Quantité d'HE fractionnée : 900,0 mg. Phase stationnaire : particules sphériques de gel de silice, 50 pm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) provenaient de Sepachrom ; phase mobile : éther de pétrole (A) et acétate d'éthyle (B) ; débit 25 mL/min. L'élution à gradient linéaire a été adoptée de 100 % de A à 80 % de A et 20 % de B sur 20 min.

3.4. Conditions d'analyse

Les solutions d'HE et celles de leurs fractions respectives ont été préparées dans du cyclohexane à une concentration de 5,0 mg/mL et analysées par GC-MS. Le citral, le citronellal, le -myrcène et le limonène ont été quantifiés dans chaque HE et les fractions isolées correspondantes à l'aide de la méthode d'étalonnage standard externe. Des niveaux d'étalonnage appropriés ont été préparés dans du cyclohexane et analysés par GC-MS. Le tridécane (C13) 1.0 mg/mL a été utilisé comme étalon interne pour normaliser les signaux de l'analyte. Le tableau 2 résume la plage de concentration considérée pour chaque composé quantifié.

Les analyses GC-MS ont été réalisées à l'aide d'un échantillonneur polyvalent Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr, Allemagne) installé sur un GC Agilent 6890 N couplé à un MSD 5975 et équipé d'une ChemStation Version E. 02.0Système de traitement de données 2.1431 (AgilentTechnologies, Santa Clara, Californie, États-Unis). Conditions GC : température de l'injecteur : 250 ◦ C ; mode d'injection : fractionné ; rapport : 1/20 ; gaz porteur : hélium ; débit constant : 1 mL/min ; colonnes : Mega5 (95 % polydiméthylsiloxane, 5 % phényle) df 0,25 um, dc 0,25 mm, longueur 25 m, de MEGA (Legnano, Italie). Programme température : 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C(5 min). Conditions MSD : MS fonctionnant en mode EI (70 eV) ; plage de balayage : 35 à 350 uma ; temps de séjour 40 ms ; température de la source d'ions : 230 ◦C ; température quadripolaire : 150 ◦C ; température de la ligne de transfert : 280 ◦C. Les marqueurs EO ont été identifiés en comparant à la fois leurs indices de rétention linéaire (IT), calculés par rapport à un mélange d'hydrocarbures C9-C25, et leurs spectres de masse soit à ceux d'échantillons authentiques, soit à partir de bibliothèques de spectres de masse disponibles dans le commerce (Adams, 2007). Les analyses chirales EO ont été réalisées en adoptant les mêmes conditions d'analyse sur un 2,3-di-O-methyl-6-Ot-butyldimethylsilyl- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, longueur 25 m de chez MEGA. Programmes de température : 40 ◦C(1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

Les analyses GC-FID ont été réalisées sur le même instrument. Conditions GC : température de l'injecteur : 250 ◦ C ; mode d'injection : fractionné ; rapport : 1/20 ; gaz porteur : hydrogène ; débit : 1 ml/min. Programmes de température : 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

4. Conclusions

Les buts de cette enquête étaient (1) d'examiner de manière exhaustive les champignons in vitrotyrosinaseactivités inhibitrices des HE Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis et Verbena officinalis et (2) pour déterminer si leur activité biologique est attribuée à leur teneur en citral uniquement ou s'il existe d'autres monoterpènes bioactifs qui contribuent à l'activité biologique étudiée en utilisant un approche de fractionnement guidée par essai biologique. Cette étude a identifié que dans les HE de L. cubeba et V. officinalis, le -myrcène contribue aux activités inhibitrices des HE malgré sa faible quantité et il a été démontré qu'il a un plus grand pouvoir inhibiteur vis-à-vis du citral. La deuxième découverte majeure était que le champignon citral amélioré (plus)-citronellaltyrosinasepouvoir inhibiteur, potentiellement via une interaction synergique car il ne présentait aucune activité par lui-même. Cette dernière découverte expliquait pourquoi dans les HE de M. officinalis qui contiennent des quantités négligeables ( plus ) de citronnellal, les activités inhibitrices étaient en ligne avec leur contenu en citral alors que le contraire était vrai pour l'HE de M. officinalis avec une abondance relativement élevée ( plus ) de citronnellal. bien que d'autres études soient encore nécessaires pour définir avec précision le type d'interactions qui se produisent entre le -myrcène et le citral et entre le citronellal et le citral, et pour évaluer les activités inhibitrices de ces HE et des composés individuels sur l'homme.tyrosinase, les résultats de cette étude peuvent aider à concevoir rationnellement des mélanges d'HE ou d'HE enrichies qui améliorent leur efficacité biologique et augmentent leur potentiel en tant qu'adjuvants dans le traitement de l'hyperpigmentation.

Références

1. Pillaiyar, T. ; Manickam, M.; Namasivayam, V. Agents de blanchiment de la peau : perspective de la chimie médicinale des inhibiteurs de la tyrosinase.J. Enzym. Inhib. Méd. Chim. 2017, 32, 403–425. [Référence croisée]

2. Desmedt, B. ; Courselle, P.; De Beer, JO ; Rogiers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Vue d'ensemble des agents de blanchiment de la peau avec un aperçu du marché cosmétique illégal en Europe. J.Eur. Acad. Dermatol. Vénéréol. 2016, 30, 943–950. [Référence croisée] [PubMed]

3. Desmedt, B. ; Van Hoeck, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO ; De Paepe, K.; Deconinck, E. Caractérisation des produits cosmétiques de blanchiment de la peau présumés illégaux. J.Pharm. Biomédical. Anal. 2014, 90, 85–91. [Référence croisée] [PubMed]

4. Kubo, I. ; Ikuyo, KH Flavonols de la fleur de safran : activité inhibitrice de la tyrosinase et mécanisme d'inhibition. J. Agric. Food Chem.1999, 47, 4121–4125. [Référence croisée]

5. Chang, C.-TT ; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Composition chimique et activité inhibitrice de la tyrosinase de l'huile essentielle de Cinnamomum cassia. Bot. Étalon. 2013, 54, 2–8. [Référence croisée]

6. Garcia-Molina, MDM ; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, Pennsylvanie ; Garcia-Canovas, F. Action des phénols onortho-substitués par la tyrosinase : influence possible sur le brunissement et la mélanogénèse. J. Agric. Chimie alimentaire. 2012, 60, 6447–6453. [Référence croisée]

7. Kubo, I. ; Kinst-Hori, I. Inhibiteurs de la tyrosinase du cumin. J. Agric. Chimie alimentaire. 1998, 46, 5338-5341. [Référence croisée]

8. Matsuura, R. ; Ukeda, H.; Sawamura, M. Activité inhibitrice de la tyrosinase des huiles essentielles d'agrumes. J. Agric. Chimie alimentaire. 2006,54, 2309–2313. [Référence croisée]

9. Lertsatitthanakorn, P. ; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. Bioactivités in vitro des huiles essentielles utilisées pour le contrôle de l'acné. Int. J.Aromather. 2006, 16, 43–49. [Référence croisée]

10. Bouzenna, H. ; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Propriétés biologiques du citral et ses effets protecteurs potentiels contre la cytotoxicité causée par l'aspirine dans les cellules IEC-6. Biomédical. Pharmacologue. 2017, 87, 653–660. [Référence croisée]

11. Lee, HJ; Jeong, HS ; Kim, DJ ; Non, YH ; Beurk, DY ; Hong, JT Effet inhibiteur du citral sur la production de NO par suppression de l'expression d'iNOS et activation de NF-κB dans les cellules RAW264.7. Cambre. Pharm. Rés. 2008, 31, 342–349. [Référence croisée]

12. Carvalho, PMM ; Macêdo, CAF ; Ribeiro, TF ; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, M. ; Menezes, IRA; Barbosa, R. Effet de l'huile essentielle de Lippia alba (Mill.) NE Brown et de ses principaux constituants, le citral et le limonène, sur le muscle trachéal lisse des rats. Biotechnol. 2018, 17, 31–34. [Référence croisée] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L. ; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd ; Monteiro, Á.B. ; Barbosa, CRdS ; Amorim, TDS ; de Menezes, IRA ; Kerntopf, M. ; Barbosa, R. Activité tocolytique de l'huile essentielle de Lippia alba et de ses principaux constituants, le citral et le limonène, sur l'utérus isolé de rats. Chim. Biol. Interagir. 2019, 297, 155-159. [Référence croisée]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS ; Pereira-Gonçalves, Á. ; Kerntopf, M. ; Menezes, IRA ; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Effet vasorelaxant de l'huile essentielle de Lippia alba et de son constituant majeur, le citral, sur la contractilité de l'aorte isolée du rat. Biomédical. Pharmacologue. 2018, 108, 792–798. [Référence croisée] [PubMed]

15. Sousa, DG ; Sousa, ODD ; Silva, RER; Silva-Alves, KS ; Ferreira-da-Silva, FW ; Kerntopf, M. ; Menezes, IRA ; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. L'huile essentielle de Lippia alba et son principal constituant, le citral, bloquent l'excitabilité des nerfs sciatiques du rat. Braz. J. Med. Biol. Rés. 2015, 48, 697–702. [Référence croisée] [PubMed]

16. Huang, X.-W. ; Feng, Y.-C. ; Huang, Y.; Li, H.-L. Potentiel d'application cosmétique de l'huile essentielle extraite des fruits de Litsea cubeba de Chine. J.Essent. huile rés. 2013, 25, 112–119. [Référence croisée]

17. Zolghadri, S. ; Bahrami, A.; Hassan Khan, MT ; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Revue complète sur les inhibiteurs de la tyrosinase. J. Enzym. Inhib. Méd. Chim. 2019, 34, 279–309. [Référence croisée]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Costa, R.; Rubiolo, P. Analyse quantitative des huiles essentielles : une tâche complexe. Arôme Parfum. J. 2008, 23, 382–391. [Référence croisée]

19. Rubiolo, P. ; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Huiles essentielles et substances volatiles : préparation et analyse d'échantillons. A review.Flavor Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [Référence croisée]

20. Seidler-Łozykowska, K. ; Bocianowski, J.; Król, D. L'évaluation de la variabilité des traits morphologiques et chimiques des génotypes sélectionnés de mélisse (Melissa officinalis L.). Ind. Cultures Prod. 2013, 49, 515–520. [Référence croisée]

21. Kubo, I. ; Kinst-Hori, I. Activité inhibitrice de la tyrosinase des composés aromatiques de l'huile d'olive. J. Agric. Chimie alimentaire. 1999, 47, 4574–4578. [CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D. ; Arciuli, M.; Arène, député ; Benvenuti, S.; Gallone, A. Composition chimique et potentiel anti-mélanogénique de différentes huiles essentielles. Arôme Parfum. J. 2016, 31, 255–261. [Référence croisée]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Effet inhibiteur de l'huile essentielle de citron sur l'activité de la tyrosinase des champignons in vitro. Mod. FoodSci. Technol. 2015, 31, 97–105. [Référence croisée]

24. Conseil de l'Europe. Pharmacopée européenne, 10e éd. ; Conseil de l'Europe : Strasbourg, France, 2020 ; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Caractérisation des inhibiteurs de la tyrosinase dans les brindilles de Cudrania tricuspidata et étude de la relation structure-activité. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [Référence croisée] [PubMed]

26. Williams, CP ; Scott, JE Enzyme Assay Design pour le criblage à haut débit. Dans le criblage à haut débit. Méthodes en Biologie Moléculaire (Méthodes et Protocoles); Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press : Clifton, NJ, États-Unis, 2009 ; Tome 565, p. 107–126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD ; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC ; Weidner, JR Bases des dosages enzymatiques pour HTS. Dans le manuel d'orientation des essais ; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds. ; Eli Lilly & Company et le NationalCenter for Advancing Translational Sciences : Bethesda, MD, États-Unis, 2004