Clonage, identification fonctionnelle et analyse de l'expression de la chalcone synthase de Cistanche Tubulosa

Résumé : Objectif

Pour étudier la fonction deChalcone synthase de Cistanche tubulosaet le modèle d'expression du gène CtCHS dans les fleurs blanches, rouges et violettes.

MéthodesLe gène CtCHS a été cloné par RT-PCR et une analyse bioinformatique a été réalisée. Le plasmide pET-28a-CtCHS a été transféré dans Escherichia coli pour induire l'expression de la protéine par IPTG. La protéine recombinante CtCHS a été incubée avec les substrats p-coumaroyl CoA et malonyl CoA, et les produits ont été détectés par HPLC et MS. Le plasmide pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS a été transféré dans le protoplaste d'Arabidopsis thaliana pour observer la localisation subcellulaire de la protéine CtCHS. Le modèle d'expression du gène CtCHS dans les fleurs de C. tubulosa à trois couleurs a été détecté par qRT-PCR.

RésultatsUn gène CtCHS a été cloné. La longueur du cadre ouvert de lecture (ORF) était de 1 173 pb, codant pour 390 acides aminés, et le poids moléculaire de la protéine était de 42 8000.

EXTRAIT DE CISTANCHE BIO AVEC 30% D'ÉCHINACOSIDE ET 12% D'ACTÉOSIDE

CtCHS contenait les résidus catalytiques Cys164, His303, Asn336, qui étaient conservés dans la chalcone synthase. La protéine CtCHS a été exprimée dans E. coli et purifiée pour obtenir la protéine recombinante. La protéine CtCHS pourrait catalyser la p-coumaroyl CoA et la malonyl CoA pour produire de la naringénine chalcone. La protéine CtCHS était principalement localisée dans le cytoplasme. Le gène CtCHS était fortement exprimé dans les fleurs violettes et rouges, et les niveaux d'expression relative étaient respectivement 8,44 et 3,21 fois supérieurs à ceux des fleurs blanches.

Conclusion Un gène CtCHS a été cloné à partir de la fleur de C. tubulosa et la protéine a été exprimée. La protéine CtCHS a une fonction de chalcone synthase et l'expression du gène CtCHS est plus élevée dans les fleurs plus foncées, ce qui indique que le gène CtCHS peut réguler la couleur des fleurs de C. tubulosa, ce qui jette les bases de recherches plus approfondies sur le mécanisme de régulation de la couleur des fleurs de C. . tubuleuse.

Mots clés: Cistanche tubuleuse (Schenk) Wight; la chalcone synthase; analyse de l'activité enzymatique; localisation subcellulaire; analyse d'expression

Cistanche Tubuleuse(SCHENK) WIGHT est une plante du genre Pyreal, naturellement distribuée dans le sud du Xinjiang [1], dans la région Hetian du Xinjiang [2]. Les fleurs de pipe ont une grande valeur médicinale. Ses tiges de viande sont l'une des sources de la version 2020 de "Pharmacopée chinoise". [3] Les recherches sur les tiges de viande des fleurs de pipe cordonus ont augmenté, mais il y a relativement peu de recherches biologiques sur ses fleurs. La période de floraison des fleurs de pipe s'étend d'avril à mai [4], principalement Il existe trois couleurs de blanc , rouge et violet. Les fleurs à pipe sont riches en couleurs, mais leur mécanisme de régulation de la couleur des fleurs n'a pas été rapporté. Les classes sont liées au type, au contenu, au contenu et à la distribution de la structure des tissus des pétales, du pigment et de la régulation des facteurs environnementaux. et facteurs génétiques [5]. Le pigment des fleurs des plantes comprend principalement trois catégories : les flavonoïdes, le carotène et la beétine, la plus grande gamme de couleurs [7]. comme les trois variétés de Paeonia Lactiflora Pall.

Il apparaît comme blanc, et la couleur principale de la couleur contient la couleur du rouge et une belle compétence rend les fleurs présentes comme violet-rouge [8]. La couleur florale est une caractéristique importante de nombreuses plantes ornementales et constitue également le facteur clé qui attire les insectes roses [9]. Des études ont montré qu'elle se transmet de génération en génération. La plante cistanche pourpre foncé [10] est la plante la plus fréquemment visitée par les insectes. Pour la recherche biologique sur la recherche génétique synthétique des cistanoïdes dans les fleurs de cistanosaure à fleurs tubulaires, elle est propice à la clarification du mécanisme de contrôle de la coloration du cordon de fleurs tubulaires, fournissant une base théorique pour améliorer la couleur de la technologie du génie génétique, favorisant ses couleurs plus riches, augmentant la visualisation, élargir le champ des applications.

La voie biosynthétique deflavonoïdescommence par levoie phénylpropanoïde. La phénylalanine est d'abord convertie en acide cinnamique sous l'action de la phénylalanine ammonialyase (PAL), et l'acide cinnamique est 4- hydroxylé par l'acide cinnamique. L'enzyme (acide cinnamique-4-hydroxylase, C4H) et la 4-coumarate coenzyme A ligase (4-coumarate coenzyme A ligase, 4CL) catalysent la réaction pour générer du 4-coumaroyl-CoA. [11]. Une molécule de 4-coumaroyl-CoA et trois molécules de malonyl-CoA sont catalysées par la chalcone synthase (CHS) pour générer de la naringénine chalcone, qui acomposés flavonoïdes.Le squelette de base de la chalcone isomérase, de la flavanone-3-hydroxylase, de la dihydroflavonol 4-réductase, etc. génère une variété de flavonoïdes tels que les isoflavones, les flavonols, les anthocyanes, etc. [12]. En tant qu'enzyme clé dans la voie de biosynthèse des flavonoïdes, le CHS régule la teneur en flavonoïdes des plantes et joue également un rôle important dans la régulation de la couleur des fleurs des plantes [13]. Par exemple, le silençage post-transcriptionnel du gène Gentiana scabra Bunge CHS peut inhiber la biosynthèse des anthocyanes et provoquer un blanchiment spécifique des lobes de la corolle [14]. Silençage du gène CHS d'Actinidia eriantha Benth. Le CHS réduit la teneur en anthocyanes des pétales et provoque une couleur rouge plus claire des pétales [15]. Par conséquent, dans cette étude, un gène CtCHS a été cloné à partir de fleurs de Cistanche deserticola, et une analyse bioinformatique, une expression et une purification procaryotes, une analyse de l'activité enzymatique, une analyse de la localisation subcellulaire et une analyse de l'expression dans trois couleurs de fleurs ont été effectuées pour explorer la fonction de CtCHS. La protéine et le modèle d'expression du gène CtCHS ont été utilisés pour explorer de manière préliminaire la relation entre CtCHS et la couleur de la fleur de Cistanche deserticola, ce qui a jeté les bases de l'étude du mécanisme de régulation de la couleur de la fleur de CtCHS deserticola.

1 Matériels et instruments

1.1 Matériaux

Des fleurs de Cistanche tuberosa ont été collectées dans le comté de Yutian, préfecture de Hotan, Xinjiang en mai 2018. Le principe aléatoire a été suivi lors de l'échantillonnage et des fleurs de Cistanche tuberosa présentant un bon état physiologique et une hauteur de plante constante ont été sélectionnées. Trois souches de Cistanche deserticola avec trois couleurs de fleurs blanc, rouge et violet ont été prélevées et identifiées comme Cistanche tubulosa (Schenk) Wight par le professeur Tu Pengfei de l'École de pharmacie de l'Université de Pékin. Ils ont été rapidement congelés dans de l'azote liquide, stockés sur de la neige carbonique et transportés à Pékin. Des cellules chimiquement compétentes d'E. coli DH5 ont été achetées auprès de Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., et des cellules chimiquement compétentes d'E. coli BL21 (DE3) ont été achetées auprès de Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd. pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Le vecteur a été acheté auprès de Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Le malonyl-CoA a été acheté auprès de Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringénine La chalcone a été achetée auprès de Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., et la naringénine a été achetée auprès de Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instruments

Spectrophotomètre Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, États-Unis) ; instrument de PCR à gradient (Eppendorf Company, Allemagne) ; Instrument de PCR quantitative à fluorescence CFX 96, imageur de gel UVP, instrument d'électrophorèse sur gel, instrument d'électrophorèse de protéines (BioRad Company, USA) ;EnSpire

Lecteur de microplaques (PerkinElmer Company, USA) ; incubateur à température constante (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.) ; Oscillateur pleine température de grande capacité DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory) ; THZ-82Un oscillateur à température constante à bain-marie (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.) ; Établi ultra-propre AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.) ; stérilisateur à vapeur haute pression (TOMY Company, Japon) ; Instrument à eau pure Milli Q (Millipore, États-Unis) ; LC-20Un chromatographe en phase liquide à haut rendement (Simadzu Company, Japon) ; Spectrométrie de masse haute résolution UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, États-Unis) ; Microscope confocal laser FV1200 (Olympus Company, Japon).

2 Méthodes expérimentales

2.1 Extraction d'ARN et synthèse d'ADNc. Les fleurs de Cistanche deserticola ont été broyées dans de l'azote liquide puis soumises à un test d'extraction d'ARN.

L'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit (Norgen, Cat 17200), la concentration et la qualité de l'ARN ont été détectées par NanoDrop 2000C et des échantillons d'ARN présentant un rapport A260/A280 compris entre 1,8 et 2,1 ont été sélectionnés pour la synthèse par transcription inverse de l'ADNc. La transcriptase inverse M-MLV (Promega, M170B) a été utilisée pour transcrire de manière inverse l'ARN total qualifié en ADNc. Les opérations expérimentales ont été réalisées conformément aux instructions.

2.2 Clonage du gène CtCHS

Sur la base des données du transcriptome de la fleur de Cistanche deserticola de notre groupe de recherche [16], un CtCHS avec un cadre de lecture ouvert complet a été éliminé et le logiciel SnapGene a été utilisé pour concevoir des amorces spécifiques basées sur la séquence du gène (Tableau 1). L'amplification PCR a été réalisée en utilisant l'ADNc de la fleur de Cistanche deserticola comme matrice. Le système d'amplification était composé de 2 × Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, d'amorces en amont et en aval (10 μmol/L) 2 μL chacune, d'ADNc 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity.

ADN polymérase 1 μL, ddH2O 17 μL. Les conditions de réaction étaient les suivantes : pré-dénaturation à 95 degrés pendant 3 minutes ; 25 cycles de dénaturation à 95 degrés pendant 15 s, recuit à 55 degrés pendant 15 s et extension à 72 degrés pendant 1 min ; et prolongation de la réaction à 72 degrés pendant 5 min. Le produit de PCR a été détecté par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % et le kit de purification de l'ADN (Novizan, Cat DC301-01) a été utilisé pour la récupération du gel, puis l'ADN récupéré a été purifié par un kit de clonage rapide (Novizan, Cat C601-01). Le fragment d'ADN a été ligaturé avec le vecteur pCE2 TA/Blunt-Zero, transformé en cellules compétentes d'Escherichia coli DH5, et après une nuit de culture à 37 degrés, des souches de clone unique ont été sélectionnées et envoyées à l'entreprise pour séquençage.

Tableau 1 Séquences d'amorces

2.3 Analyse bioinformatique

Utilisez le logiciel en ligne ProtParam pour analyser les propriétés physiques et chimiques des protéines ; utiliser l'outil en ligne Prot Scale pour analyser l'hydrophilie/hydrophobie des protéines ; utiliser l'outil en ligne SOPMA pour prédire la structure secondaire des protéines ; utiliser le logiciel d'analyse en ligne SWISS-MODEL pour prédire la structure tertiaire des protéines ; utiliser le logiciel en ligne TMHMM Prédire la structure transmembranaire de la protéine ; utiliser le logiciel DNAMAN pour comparer l’homologie de CtCHS avec les séquences d’acides aminés CHS d’autres espèces ; utilisez le logiciel MEGA-X pour construire un arbre phylogénétique, en utilisant la jonction de voisins (NJ) et la correction de Poisson. La distance évolutive est calculée à l'aide de la méthode Bootstrap et le nombre de répétitions Bootstrap est de 1 000 fois.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS a été utilisé pour une détection plus approfondie. Les conditions de la phase liquide étaient les suivantes : colonne Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3,0 mm, 1,7 μm), température de la colonne 40 degrés, naringénine , chalcone et naringénine. Le volume de chargement de la substance témoin est de 4 μL et le volume de chargement du produit de réaction enzymatique est de 7 μL. L'eau (A)-acétonitrile (B) est utilisée comme phase mobile. Le gradient d'élution est : 0 à 5 min, 30% B ; 5 à 15 minutes. , 30 % ~ 60 % B ; 15 à 20 minutes, 60 à 100 % B ; 20 ~ 25 minutes, 100 % B ; 25~31 min, 100 %~30 % B. Le débit volumétrique est de 0,3 mL/min. Les conditions de spectrométrie de masse sont la source d'ions par électropulvérisation, l'azote comme gaz porteur, la pression du gaz de gaine 3,5 MPa, la pression du gaz auxiliaire 1,0 MPa, la pression de pulvérisation 3 500 V, la température capillaire 350 degrés, la température de chauffage du gaz auxiliaire 200 degrés, les modes ioniques positifs et négatifs, le balayage. la plage d'ions m/z est 100-1500, la résolution Full MS est 35 000, la résolution dd-MS2 est 17 500, (N)

CE/nce échelonné réglé sur 35, 60.

2.6 Localisation subcellulaire de la protéine CtCHS

Sur la base de la séquence CtCHS et du principe du clonage transparent, des amorces avec des sites de coupe enzymatiques Kpn Ⅰ et BamH Ⅰ ont été conçues et les fragments cibles correspondants ont été amplifiés par PCR. Le plasmide pCAMBIA1300-35S-GFP a été digéré avec les endonucléases de restriction Kpn Ⅰ et BamH Ⅰ, et le fragment cible et le vecteur ont été connectés via le kit de clonage transparent (Novizan, Cat C115-01), puis transférés dans des cellules compétentes d'E. coli DH5. , sélectionnez des souches de clone unique pour le séquençage et extrayez les plasmides des souches appropriées. Les plasmides pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS et pCAMBIA 1300-35S-GFP ont été transformés en protoplastes d'Arabidopsis thaliana en utilisant du PEG4000 et cultivés sous faible lumière pendant 8 à 10 h. La localisation subcellulaire de la protéine CtCHS a été observée au microscope confocal laser.

2.7 Analyse du modèle d'expression CtCHS

Sur la base de la séquence CtCHS, DNAMAN a été utilisé pour concevoir des amorces quantitatives de fluorescence en temps réel, avec F-box comme gène de référence interne. Les séquences d'amorces sont présentées dans le tableau 1. L'expression relative de CtCHS dans des fleurs de Cistanche deserticola de différentes couleurs a été détectée par PCR quantitative par fluorescence en temps réel. Utilisez TransStart Green qPCR SuperMix (full gold, AQ101-02) pour mesurer avec la méthode de colorant fluorescent SYBR Green, système de réaction : 2 × TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, amorces en amont et en aval (10

μmol/L) {{0}},2 μL chacun, matrice d'ADNc 0,5 μL, eau sans nucléotidase 4,1 μL, une méthode en deux étapes a été utilisée pour la réaction et la procédure de réaction était basée sur la méthode de Dong Xianjuan et al. [18]. Chaque échantillon contenait 3 répétitions biologiques et l’expérience a été répétée trois fois. Les données expérimentales ont été analysées à l'aide d'Excel pour 2

L'expression relative de CtCHS a été calculée à l'aide de la méthode −ΔΔCt et GraphPad Prism 8 a été utilisé pour effectuer une analyse de signification et dessiner des histogrammes.